熊涛[1]2001年在《湖北省鸭疫里默氏杆菌病的研究》文中进行了进一步梳理本研究对湖北省各地区及武汉市周边地区最近一两年以来发生的以雏鸭传染性浆膜炎为主要特征的疾病进行了系统研究，确诊为鸭疫里默氏杆菌病(Riemerella anatipestifer,RA)；感染鸭日龄多为2～6周龄，剖检病变以心包炎、肝周炎以及全身性败血性病变为特征，病原菌从病死鸭的肝脏、脾脏及血液中容易分离，特别是脑组织极易分离；对分离到的两个代表菌株进行了详细的生理生化鉴定、血清学鉴定和药物敏感性实验，结果表明两菌株都不发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、甘露醇，不分解尿素，不产生硫化氢，不还原硝酸盐，过氧化氢酶阳性，能液化明胶。云梦株对诺氟沙星、呋喃唑酮、林可霉素敏感，对氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、壮观霉素、强力霉素中度敏感，对杆菌肽、红霉素不敏感，而江夏株对呋喃唑酮、杆菌肽、氯霉素、林可霉素敏感，对红霉素、诺氟沙星、壮观霉素、强力霉素中度敏感，对青霉素、氨苄青霉素不敏感。经玻片凝集试验确定其血清型为Ⅰ型。用分离的Ⅰ型RA菌株作为种毒，研制了3种剂型的灭活水剂苗和灭活油剂苗，并进行免疫预防试验，用四种不同类型的疫苗免疫8日龄的雏鸭，每组70只，每只颈部皮下注射0.5ml，并设有对照组70只，共350只。然后分别在免疫后第4、7、10、14、21、28、35天用2倍的LD50进行攻毒试验，检测其保护力。结果表明，四种剂型的疫苗均具有较好的免疫效果，免疫后第4天开始产生免疫力，7～10天免疫力达到最高，持续一个月后仍有约50％的保护力，说明用疫苗来防制鸭疫里默氏杆菌病的效果是确实的，但考虑到经济实用，采用Ⅰ组和Ⅳ组疫苗比较好。
杨依霏[2]2012年在《1型鸭疫里默氏杆菌比较蛋白质组学研究及抗体检测方法的建立》文中研究说明鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种革兰氏阴性菌,火鸡、水禽等对其敏感。它是鸭疫里默氏杆菌病的病原体,主要引起宿主的纤维素性气囊炎、脑膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性输卵管炎,并伴有不同程度的败血症,对养殖业的发展存在着巨大的威胁。因此,开发鸭疫里默氏杆菌病的疫苗对防止该疫病的发生有重大意义。同时,建立一种诊断鸭疫里默氏杆菌抗体的方法也对临床实践中监测免疫效果、诊断疾病具有指导意义。本试验中对限铁环境中的RA以及正常培养环境中的RA的分泌蛋白进行差异比较,发现其差异表达的蛋白,并对差异蛋白的免疫原性进行鉴定。此外,利用重组ompA蛋白作为包被抗原,建立了检测RA抗体的间接ELISA方法,主要完成以下研究工作：通过模拟动物机体内的限铁环境,在限铁环境中培养RA。通过比较蛋白质组学,利用双向电泳技术和质谱鉴定技术,鉴定出在限铁环境中有23个蛋白质点表达量上升,选取其中的12个蛋白质点进行质谱鉴定,分别代表了8类蛋白质,包括111型纤维连接蛋白、分泌蛋白家族蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、亮氨酸富集蛋白质、2类RA假想蛋白、似半乳糖结合区域蛋白、延伸因子。选取理论等电点、分子量和实际等电点、分子量相近的蛋白质Fe10和Fel9(hypothetical protein Riean_1750和hypothetical protein Riean_1752)进行原核表达。构建了重组质粒pET-28a(+)-Fe10和pET-28a(+)-Fe19,并通过蛋白质诱导表达技术,表达出Fe10和Fe19蛋白。经过镍亲和层析纯化,获得了较高纯度的RA的Fe10和Fe19两种蛋白。通过Western-blotting分析,表明蛋白质Fel0和Fe19与RA的阳性血清是有反应性的。通过鸭的免疫攻毒试验,证明蛋白质Fe10和Fe19对鸭具有一定的免疫保护性。且两种蛋白同时配合免疫,比单独一种蛋白作为免疫原具有更好的免疫保护力。此外,成功构建了重组质粒pET-28a(+)-ompA,经过诱导表达后,表达出RA的ompA蛋白。经过纯化的重组ompA蛋白作为包被物,以方阵滴定法确定抗原包被浓度为1.5μ g/mL,待检血清稀释度为1：100。与普通的微量凝集试验相比,该方法灵敏度较高,比凝集试验高16-128倍。与鸭源大肠杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒感染鸭血清均无交叉反应,表明该方法特异性强。ompA蛋白作为抗原包被到酶标板之后于-20℃保存时间为3个月。经过重复性试验证实,该方法批内重复的变异系数小于5%(1.8%-4.6%),批间重复变异系数小于9%(1.2%-8.8%)。结果表明,本试验建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和稳定性。利用该方法进行雏鸭免疫RA灭活油乳剂疫苗之后血清抗体水平变化规律的研究。试验结果表明,在雏鸭免疫RA疫苗之后7d鸭血清中的抗体水平开始有上升趋势,在35d达到高峰,之后出现下降趋势,在77d左右抗体水平与14d的抗体水平相近。
周祖涛[3]2009年在《鸭疫里氏杆菌免疫诊断方法及在感染鸭肝脏差异表达基因的研究》文中研究指明鸭疫里氏杆菌(Riemerella anantipestifer,RA)病是由鸭疫里氏杆菌引起的雏鸭的一种急性、接触性败血性传染病,是严重危害我国养鸭业的重要传染病之一。鸭疫里氏杆菌血清型复杂,各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护,这给使用全菌灭活疫苗或弱毒疫苗进行该病的免疫防治带来了诸多困难。临床分离菌株的鉴定和血清定型及鸭群鸭疫里氏杆菌抗体的监测,对了解鸭疫里氏杆菌的流行情况和制定有效的免疫计划以及评价疫苗免疫效果具有重要意义。鸭疫里氏杆菌在入侵宿主后,迅速在感染位点定居、繁殖,经血液扩散到全身各组织器官,引起全身多发性浆膜炎并发展为败血症。而目前对鸭疫里氏杆菌如何在宿主体内生存、繁殖和逃避免疫系统监视并致病的分子机制知之甚少。本研究针对我国流行的血清1型鸭疫里氏杆菌的42kD外膜蛋白OmpA进行了克隆、表达和免疫原性研究,探索外膜蛋白OmpA的免疫保护作用及其作为包被抗原建立用于鸭疫里氏杆菌分子流行病学调查的ELISA诊断方法;在此基础上,利用选择性捕获转录序列技术对鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏基因差异表达进行了研究,为进一步开展了鸭疫里氏杆菌致病分子机理的研究,阐明雏鸭腹腔广泛性浆液渗出的分子机制奠定基础。本研究取得的结果如下:1.鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的制备和应用用本实验室鉴定、保存的血清1型鸭疫里氏杆菌云梦分离株(RA-YM)制备了RA平板染色诊断抗原,该抗原与鸭流感、鸭瘟、鸭肝炎、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的等5种病原的阳性血清无交叉反应;染色抗原平板凝集试验与琼脂免疫扩散试验(AGID)对RA疫苗免疫鸭的抗体检出率结果表明,在疫苗免疫后12天,平板凝集法即可检测到RA抗体,检出率为30%,AGID在免疫后31天才能检测到抗体,检出率为10%,而平板凝集法的检出率为80%,平板凝集法抗体检出率明显高于AGID,且染色抗原平板凝集试验比AGID的灵敏度高3个滴度;不同批次的平板染色诊断抗原检测的阳性率基本相当,在凝集程度上有较小的差异,表明不同批次平板染色诊断抗原具有良好的重复性。以RA-YM和纯化的鸭IgG为免疫原免疫鸭和兔,制备了鸭抗1型RA和兔抗鸭IgG的高免血清,平板凝集试验检测鸭抗RA-YM高免血清的效价为1:32,兔抗鸭IgG高免血清的琼扩效价为1:64。以制备的鸭抗血清1型RA血清对分离自湖北省不同地区的23株鸭疫里氏杆菌进行血清型鉴定,结果均为血清1型,表明我省目前流行的RA主要是血清1型。将制备的兔抗鸭IgG高免血清纯化后,经辣根过氧化物酶(HRP)标记,制备出特异性强、免疫学活性高的兔抗鸭IgG-HRP,工作浓度为1:4000,为下一步建立一种用于RA流行病调查的间接ELISA诊断方法奠定了基础。2.鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆、表达及重组OmpA蛋白免疫保护性试验研究根据RA15型CVL110/89株OmpA基因序列(GeneBank登录号:AF104936)合成特异性引物,PCR扩增了RA-YM株OmpA基因,克隆到pMDl8-T,获得重组质粒pT-OmpA并进行了测序;将OmpA克隆到pGEX-KG,构建了重组原核表达质粒pGEX-OmpA,转化E.coli BL21后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量为68kD,表达产物主要以包涵体形式存在,Western-blot证实表达产物具有良好的生物学活性。将重组表达的OmpA蛋白以0.5mg、1.0mg、1.5mg叁个免疫剂量分别与弗氏完全佐剂乳化后免疫7日龄樱桃谷肉鸭,17日龄以同样剂量加强免疫,二免后8天攻毒(3×10~6CFU/只),在攻毒24h后蛋白免疫组和未免疫空白组均发病,动物试验结果表明重组表达的OmpA不能起到保护作用。3.鸭疫里氏杆菌间接OmpA-ELISA检测方法的建立及初步应用用大肠杆菌表达的重组蛋白OmpA建立了RA抗体OmpA-ELISA检测方法,方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为0.81μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:160。通过检测84份鸭疫里氏杆菌病阴性血清,确定该方法的阴阳性临界值为0.22。用该方法检测鸭流感,鸭瘟,鸭肝炎,鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的标准阳性血清OD_(450)值均小于临界值0.22,表明该方法与其它病原抗体无交叉反应,特异性强。重复性试验表明OmpA-ELISA检测方法的批内重复和批间重复的变异系数均小于10%。用建立的OmpA-ELISA检测方法和平板凝集分别对213份送检血清进行检测,结果表明OmpA-ELISA检测方法的敏感性为95.77%,二者的符合率为62.91%。将湖北汉川、荆州和武汉市江夏区、黄陂区等地送检的472份鸭血清采用建立的OmpA-ELISA检测方法进行检测,结果表明RA抗体阳性率为64.6%,说明建立的间接OmpA-ELISA检测方法能够很好的应用于临床RA抗体检测。4.应用选择性捕获转录序列技术(SCOTS)筛选鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏中差异表达的基因的研究根据RAD-24105株16S rRNA基因序列(GeneBank登录号:AY871819),合成特异性引物,PCR扩增了RA-YM株16S rRNA基因,克隆到pMD18-T,获得重组质粒pT-16SrDNA并进行测序,结果表明克隆的RA-YM株16S rRNA为1479bp,其GeneBank登录号为FJ031240。比对分析Genbank中已公布的表皮葡萄球菌(GeneBank登录号:NC_002737),多杀巴氏杆菌(GeneBank登录号:NC_002663)、大肠杆菌(GeneBank登录号:NC_000913)和噬二氧化碳单胞菌(GeneBank登录号:AY661855)23S rRNA基因序列的保守区域,利用Primer premier 5.0设计3对引物,分3段分别扩增了23S rRNA基因,克隆到pMD18-T,获得重组质粒pT-23S2、pT-23S1和pT-23S3并进行测序,拼接结果表明克隆的RA-YM株23S rRNA为2655bp,其GeneBank登录号为FJ031241。对生物素标记的RA-YM基因组DNA和构建好的RA-YM核糖体rDNA质粒(pT-16SrDNA,pT-23S-1rDNA和pT-23S-3rDNA)超声破碎,凝胶电泳结果表明破碎产物大小为100-2000bp。以血清1型RA-YM感染9日龄樱桃谷肉鸭,提取感染鸭肝脏的总RNA和TSB培养基中生长的RA-YM的总RNA,经SuperScript~(TM)ⅢRTase反转录,Klenow酶合成cDNA第二链后,记为体内感染cDNAs(in vivo cDNAs)和RA-YM体外培养cDNAs(in vitro cDNAs)。对in vivo cDNAs和in vitro cDNAs进行3轮SCOTS,得到均一化的RA-YM在体内感染时转录的cDNAs和在TSB培养时转录的cDNAs,通过3轮差异杂交选择性捕获RA-YM在感染鸭肝脏中差异表达的基因,将RA-YM在感染鸭肝脏中差异基因的PCR产物克隆到pMD18-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞,通过PCR和斑点杂交,从文库中筛选出187个差异克隆,经序列测定和比对分析获得了48个RA-YM在感染鸭肝脏中差异表达的基因。Real-time RT-PCR对甘氨酸裂解酶T亚基,尿黑酸1,2-加氧酶,天冬氨酸转氨酶,触酶,磷酸盐转运蛋白,二肽肽酶Ⅳ,肽酶M28,和RA46等8个基因的差异表达情况进行验证,结果表明与生长于TSB培养基RA的基因表达水平相比,这8个基因在RA感染过程中的表达水平上调1.44-4.62倍,t-检验分析表明8个基因的表达水平差异显着。根据基因功能,将48个基因分为六类:合成与代谢,适应性调节,应激,转运系统,蛋白酶和5个未知功能序列。本研究初步揭示了RA在感染鸭肝脏的基因表达情况,获得的差异表达基因对研究RA在宿主体内的存活、增殖及持续感染具有重要的作用。本研究筛选到二肽肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidaseⅣ,DPPⅣ)可能是RA重要的毒力因子。DPPⅣ是一种丝氨酸蛋白酶,能特异性水解氨基端第二位是脯氨酸的多肽。牙龈卟啉单胞菌的DPPⅣ能够降解结缔组织以及介导牙龈卟啉单胞菌与纤粘蛋白的粘附,缺失dppⅣ基因的牙龈卟啉单胞菌的毒力明显降低。格氏链球菌的DPPⅣ可以酶解P物质,协同胞外精氨酸蛋白酶酶解缓激肽,导致血管通透性的变化及感染的内皮组织平滑肌的收缩。雏鸭感染鸭疫里氏杆菌后,主要病理变化是全身各组织器官的浆膜面出现广泛性的纤维素性渗出,RA感染严重损伤了雏鸭的血管内皮系统,导致血管通透性的增高。因此,二肽肽酶Ⅳ可能是RA关键的毒力因子。下一步研究将克隆、表达和缺失RA的dppⅣ基因,以及利用酵母双杂交系统筛选和鉴定与DPPⅣ互作的宿主蛋白,为进一步研究dppⅣ对RA的毒力以及RA的致病机理奠定基础。
张红[4]2010年在《鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及对雏鸭致病性观察》文中研究表明鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的侵害雏鸭的一种急性或慢性败血性传染病。目前,此病呈世界性分布,在我国养鸭区也广泛流行,是危害养鸭业最为严重的传染病之一。该病能导致雏鸭产生广泛性浆膜胸膜炎,主要表现为心包炎、肝周炎和气囊炎,另外各个脏器组织器官均有不同程度的病理损伤。相同血清型的不同菌株的致病力不相同,与其毒力强弱有关。本试验从湖北省武汉市周边地区养殖户送检的鸭浆膜炎的病料中分离并鉴定一株血清型为1型鸭疫里默氏杆菌,并对其致病性及对组织器官的损伤特征等进行了初步研究,主要完成以下工作：1从湖北省武汉市周边地区养殖户送检的鸭浆膜炎的病料中分离得到一株细菌,经血清凝集试验、PCR试验及动物回归试验,确定该分离菌株为鸭疫里默氏杆菌,血清型为1型,该型也是我国主要流行血清型。将分离株16S rRNA的测序结果与GeneBank公布序列对比发现,该菌保守序列区也存在个别位点的突变,表明不同菌株间保守序列存在差异。2复制动物模型。用3×108CFU菌液经脚蹼注射感染20日龄樱桃谷肉鸭,能导致雏鸭产生典型浆膜炎病变,病程2～4天。感染后12h开始出现精神不振、饮食下降、拉黄绿色稀粪等症状；24h病鸭出现少量死亡；第2～3天死亡达到高峰期；第4天死亡量减少,但症状仍很明显；第5天后鸭群不再死亡,症状有所缓解,但生长抑制。3将两株相同血清型不同地区分离菌株,分别用半数致死量经脚蹼注射感染20日龄樱桃谷肉鸭,在不同时间段对感染组及对照组进行剖杀,观察不同菌株对雏鸭各个组织器官的损伤。结果显示这两株菌均能导致明显的浆膜炎等典型病理变化,但症状出现的先后有差异,在相同时间段组织损伤程度也不同,可能与不同菌株的毒力差异有关。对照组则无病理损伤。4利用SABC免疫组织化学方法对感染鸭组织中5-羟色胺进行染色,观察5-羟色胺在感染鸭体内组织器官中的分布规律并测定其水平变化。结果显示5-羟色胺免疫反应阳性细胞在感染鸭体内分布较广泛,主要分布于外周血与神经系统中,血管周围及淋巴器官中也均有分布；在大脑、脾脏、法氏囊中,5-羟色胺免疫反应阳性信号与对照组相比明显增多,且差异性显着。结果表明5-羟色胺参与了鸭疫里默氏杆菌疾病发生发展的过程。
罗玲, 罗青平, 张蓉蓉, 王红琳, 卢琴[5]2018年在《乳胶凝集试验快速检测鸭疫里默氏杆菌抗体的研究》文中指出将鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂,建立一种可快速检测鸭疫里默氏杆菌抗体的检测方法。结果表明,该检测方法快速、敏感、特异,操作简单,适合临床现场快速筛查,对该病的流行病学调查及防控有重要意义。
张蓉蓉, 罗青平, 温国元, 王红琳, 杨峻[6]2012年在《4株鸭疫里默氏杆菌的PCR快速鉴定及药敏试验》文中研究指明从湖北省武汉郊区和监利市两地的发病雏鸭分离纯化到4株鸭疫里默氏杆菌(Riemerella a-natipestifer,RA),通过对该菌形态学鉴定、生化试验、细菌16S rRNA的快速鉴别诊断证明了4株细菌均为鸭疫里默氏杆菌。将不同来源的菌株各选一株HBSPX和HBJL,进行了16S rRNA目的片段的扩增并测序,测序结果表明这两株细菌与其他鸭疫里默氏杆菌的16S rRNA同源性高达99.4%和98.9%。药敏试验结果表明,HBSPX株对阿莫西林、先锋VI高度敏感,但HBJL株对氯洁霉素和红霉素高度敏感。
覃宗华, 蔡建平, 吕敏娜, 余劲术, 吴彩艳[7]2008年在《鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用》文中进行了进一步梳理本研究从鸭疫里默氏菌提取基因组DNA,采用细菌16S rRNA基因的通用引物,用PCR方法成功扩增出鸭疫里默氏菌的部分16S rRNA基因,克隆及测序结果表明其全长1 512 bp,G+C含量为51%,该序列已登入GenBank,登录号为DQ078779。同时利用生物软件对GenBank收录的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行分析后,设计了鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的种特异性引物,分别能从各自的16S rRNA基因中扩增出长度为342和718 bp的DNA片段。并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌病的双重PCR方法,该方法能从肝脏组织悬液煮沸后的上清、细菌培养物或提取的细菌基因组DNA中快速扩增出相应的片段,进行鉴别诊断。
张蓉蓉, 罗青平, 王红琳, 温国元, 艾地云[8]2013年在《一株无毒力鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定》文中认为从湖北某地淘汰鸭的脑组织分离到一株短杆菌,命名为JLLY,经分离培养、形态学检查、生理生化试验、PCR鉴定及测序结果的分析,分离菌株被鉴定为鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)。在毒力测定试验中,将不同浓度的菌液腿部肌肉注射5日龄健康雏鸭。结果显示,分离株JLLY注射的试验动物无一死亡,可确定为无毒力。
廖永洪, 邵璐璐, 邵华斌, 杨峻, 罗玲[9]2010年在《湖北1型鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定》文中研究说明湖北地区某鸭场20日龄樱桃谷鸭发生疑似鸭疫里默氏杆菌病,临床表现为缩脖、腿发软,部分病鸭表现为仰卧、双腿划动呈游泳状,临死前出现典型的神经症状。剖检病变呈典型的心包炎、肝周炎和气囊炎。用含5%小牛血清的TSA平板从病鸭中分离到8株细菌,经过染色、PCR及测序分析、玻片凝集和动物回归试验,综合分析鉴定为1型鸭疫里默氏杆菌。
艾地云, 彭公宽, 罗玲, 王红琳[10]2012年在《麻鸭Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌与O_78型大肠杆菌混合感染的诊断》文中认为湖北省汉川市某蛋鸭场发生了一起18日龄麻鸭精神沉郁、食欲减退、嗜睡、缩颈、拉稀及神经症状为特点的疫病,经流行病学调查、临床症状观察、病理剖检、病原分离鉴定及动物回归试验确诊为Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌和O78型大肠杆菌混合感染。
参考文献：
[1]. 湖北省鸭疫里默氏杆菌病的研究[D]. 熊涛. 华中农业大学. 2001
[2]. 1型鸭疫里默氏杆菌比较蛋白质组学研究及抗体检测方法的建立[D]. 杨依霏. 华中农业大学. 2012
[3]. 鸭疫里氏杆菌免疫诊断方法及在感染鸭肝脏差异表达基因的研究[D]. 周祖涛. 华中农业大学. 2009
[4]. 鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及对雏鸭致病性观察[D]. 张红. 华中农业大学. 2010
[5]. 乳胶凝集试验快速检测鸭疫里默氏杆菌抗体的研究[J]. 罗玲, 罗青平, 张蓉蓉, 王红琳, 卢琴. 中国家禽. 2018
[6]. 4株鸭疫里默氏杆菌的PCR快速鉴定及药敏试验[J]. 张蓉蓉, 罗青平, 温国元, 王红琳, 杨峻. 湖北农业科学. 2012
[7]. 鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用[J]. 覃宗华, 蔡建平, 吕敏娜, 余劲术, 吴彩艳. 畜牧兽医学报. 2008
[8]. 一株无毒力鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定[J]. 张蓉蓉, 罗青平, 王红琳, 温国元, 艾地云. 湖北农业科学. 2013
[9]. 湖北1型鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定[J]. 廖永洪, 邵璐璐, 邵华斌, 杨峻, 罗玲. 湖北农业科学. 2010
[10]. 麻鸭Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌与O_78型大肠杆菌混合感染的诊断[J]. 艾地云, 彭公宽, 罗玲, 王红琳. 湖北畜牧兽医. 2012
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