（广西医科大学第一附属医院病理科 广西 南宁 530021）
【摘要】 目的：通过对已验证的hsa-miR-204-5p靶基因的提取和功能富集分析，为进一步探究其生物学功能及调控机制提供数据支持和理论指导。方法：应用mirTarBase和TarBase数据库提取已被验证过的hsa-miR-204-5p靶基因，取其交集，将集合基因分别进行GO富集分析和Pathway富集分析。结果：miR-204-5p在多物种间具有较高保守性。在MirTarBase和TarBase数据库中分别得到398个和600个靶基因，重叠获得85个共有靶基因，其中同时被qPCR、Western blot、Reporter assay进行过检测的靶基因为15个。GO分析得到13个基因的生物进程信息、12个基因的细胞组分信息、12个基因的分子功能信息。Pathway分析显示靶基因富集于线粒体通路。结论：hsa-miR-204-5p的靶基因主要富集于凋亡相关进程及通路，与多种肿瘤生物学进程密切相关。
【关键词】 hsa-miR-204-5p；靶基因；生物信息学
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）12-0181-01
MicroRNA（MiRNA）是近年来发现的一类短链非编码蛋白RNA，长约18-24nt，通过与靶标mRNA的3‘非翻译区（3’UTRs）的互补位点相互结合，在转录后水平进行调控来发挥其作用。研究表明miRNAs在多种癌症中表达异常，并且对细胞分化、发育、增殖、凋亡、周期等生物学进程进行调控。hsa-miR-204-5p作为hsa-miR-204家族中的一个亚型，已被证实在子宫内膜癌、胃癌等癌症中低表达，并且通过与靶基因的相互结合，进而参与到各细胞通路中，对肿瘤的形成产生影响[1]，但其具体的调控机制及生物功能仍不明确。随着生命科学的深入进展，对于基因功能、作用机理和相互之间的信号转导通路的分析越来越系统，我们将通过整合hsa-miR-204-5p的相关数据进行系统分析，为研究其在肿瘤中的相关作用及机制提供理论依据。
1.材料与方法
1.1数据来源
使用mirTarBase和TarBase在线数据库，提取已通过实验验证的hsa-miR-204-5p的靶基因，取二者交集，并在mirTarBase中对其进行进一步的Strong evidence分析。
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1.2分析方法
1.2.1 GO富集分析 整理Strong evidence中提取到的hsa-miR-204-5p的靶基因，在DAVID数据中进行GO分析，包括生物进程（Biologycal Process，BP）注释、细胞组分（Cellular Component，CC）注释、分子功能（Molecular Function，MF）注释三个分类，以P＜0.05得到在GO类别上高频率的基因富集信息。
1.2.2 Pathway 富集分析 将Strong evidence中的靶基因集合，进行KEGG和BIOCARTA生物信号通路富集分析，分别提取KEGG和BIOCARTA富集出的信号通路。通过软件附带的Fisher Exact Test计算P值，P＜0.05则判断该信号通路具有统计学意义。
2. 结果
2.1 miR-204-5p的靶基因提取结果
分别在MirTarBase和TarBase数据库中对hsa-miR-204-5p进行检索，得到398个和600个靶基因，将二者重叠，获得85个共有的靶基因。在mirTarBase数据库中用Strong evidence对这85个基因进一步精确验证，验证方法为同时被qPCR、Western blot、Reporter assay进行过检测，最终得到15靶基因，分别为BCL2、BCL2L2、BIRC2、EFNB2、EZR、M6PR、NTRK2、RAB22A、RAB40B、RUNX2、SERP1、SOX4、TCF12、THRB和USP47。
2.2 GO分类富集分析结果
对上述15个基因进行GO富集分析，得到13个基因的生物
进程信息、12个基因的细胞组分信息、12个基因的分子功能信息。hsa-miR-204-5p的靶基因主要富集于各器官和系统的进化形成、解剖结构的形成、膜组织、多细胞的生物学发生、淋巴祖细胞的分化、发育进化过程、造血祖细胞的分化、细胞凋亡的调控、细胞程序性坏死的调控、细胞死亡的调控、细胞进程、蛋白质定位、细胞凋亡的负调控、蛋白质稳定性调控、细胞程序性死亡的负调控、细胞死亡的负调控、多细胞的生物过程、雄性性腺发育、细胞组织组分等生物进程上（P＜0.05）；质膜内侧、膜部等细胞组分上（P＜0.05）。
2.3 KEGG和BIOCARTA通路分析结果 基于GO分类的分析结果，对集合中的15个基因进行Pathway富集分析。在KEGG中hsa-miR-204-5p的基因集合富集在小细胞肺癌、凋亡信号通路；而在BIOCARTA中则富集于线粒体通路（线粒体在凋亡信号转导中的作用），三条通路中仅线粒体通路有统计学意义（P＜0.05）。
3. 讨论
近年来，随着miRNA相关研究的深入，越来越多的miRNA被发现通过调控其下游靶基因的表达来参与生物进程，包括分化、新陈代谢等，并且在肿瘤的发展形成过程中，miRNA也发扮演着重要角色来行使其功能。由于已确定的miRNA的靶基因有限，因此对于深入探究其功能往往造成不全面的认识。目前，常用的miRNA预测软件有三十余种，较常用的有microRNA.org、miRBase、TarBase、TargetScan、miRWalk等，但是只有mirTarBase和TarBase是综合收集已被验证过的miRNA靶基因的网站。生物信息学软件可以整合大量复杂的数据，对其进行系统分析，将两者结合在一起，可以深入全面的准确认识miRNA与靶基因之间的相互作用网络，确定miRNA的主要研究方向。
hsa-miR-204-5p的研究仍不全面，已有研究证实其在乳头状甲状腺癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤中异常表达，并参与到增殖、凋亡、侵袭、转移等肿瘤形成相关进程中[2]。通过对15个基因的最终富集，不难发现，hsa-miR-204-5p主要富集于多细胞的生物学进程、细胞凋亡的调控、细胞程序性坏死的调控、细胞死亡的调控生物进程上，这恰恰说明了hsa-miR-204-5p通过结合靶基因调控这些程序来影响肿瘤的凋亡。通过GO分析，本课题发现miR-204-5p的靶基因具有多种功能，涉及到不同的调控环节中，然而这些基因及之间是否是通过构成复杂的网络来进行联合调控，进而发挥多种生物学调控仍不清晰。因此，运用KEGG和BIOCARTA进行通路分析则可提示之间可能的联系，KEGG显示基因集合信号位于小细胞肺癌、凋亡信号通路，但是在统计学中并无意义，可能是由于hsa-miR-204-5p的研究还欠缺，被证实的基因仍不多，综合筛选之后的基因过少，从而造成阴性结果；而在BIOCARTA中则富集于线粒体通路，此通路作为凋亡通路中极为重要的一条，通过影响线粒体来干扰DNA的合成，活化并激活内源性凋亡程序，直接影响细胞的存活。
综合分析GO和Pathway的富集结果，同时发现hsa-miR-204-5p极大地影响了凋亡进程，这与前面已述的结果相合。本文利用生物学方法较为系统的对hsa-miR-204-5p的靶基因进行了多层次的全面分析，为其在疾病中生物学功能的研究提供一定的数据支持和理论依据。
基金资助：广西自然科学基金（2015GXNSFAA139187），广西区卫生厅自筹课题（Z2014057）
论文作者:沈思乔,肖晓玲,朱晓菲,冯振博,韦康来（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年4月第12期
论文发表时间:2016/5/19
标签：基因论文; 细胞论文; 进程论文; 凋亡论文; 线粒体论文; 生物论文; 生物学论文; 《医药前沿》2016年4月第12期论文;