黄庆生, 马文煜, 姜绍谆, 樊英茹, 张富泉[1]2000年在《乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究》文中进行了进一步梳理本研究根据已知的乙脑病毒 (JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT PCR技术 ,一次扩增出了JEV的全长cDNA ,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游。阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变 ,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV ,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功。其次 ,合成一条含有RNA聚合酶启动子序列的 5′引物 ,利用长模板RT PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录。转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变。收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV ,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法。本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT PCR快速制备JEV感染性RNA的方法 ,将为JEV分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础。
黄庆生[2]1999年在《乙脑病毒全长cDNA的扩增、克隆及体外转录制备感染性转录体的研究》文中提出乙脑病毒，属黄病毒科黄病毒属成员。基因结构为单股正链RNA，全长11kb。本病毒主要侵犯中枢神经系统，且患者以儿童居多，在黄病毒中乙脑病毒引起的乙型脑炎病死率最高，年病死人数超过1万人。随着对该病毒病原学研究的深入，从基因水平探讨病毒的生物学特性，是研究其致病机理与构建新型疫苗的必由之路。 但是乙脑病毒为RNA病毒，和其它非逆转录RNA病毒一样，在复制过程中不形成DNA中间体。要利用分子生物学技术通过对病毒RNA直接进行重组、突变等方法在基因水平研究病毒的分子生物学特性存在着一定的困难，因为突变、重组、克隆等分子生物学技术都是在DNA水平上的操作。体外转录制备感染性RNA(感染性转录体)技术为RNA病毒的分子生物学研究开辟了新路。该技术是将病毒的RNA逆转录成cDNA，把全长的cDNA置于RNA聚合酶启动子的下游，在RNA聚合酶的作用下在体外转录出全长的正链RNA，经转染易感细胞后即可复制出子代病毒颗粒。由于这种子代病毒是来自cDNA，这样人们就可以在DNA水平上进行操作。重组或突变将被转录到子代病毒的RNA中，从而实现人为改造病毒达到研究其复制、表达
李世华[3]2011年在《乙型脑炎病毒反向遗传学系统的建立及应用》文中研究说明流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是一种严重的急性神经系统传染病,主要通过携带乙型脑炎病毒的蚊媒叮咬传播,病死率高,后遗症严重。该病主要流行于东南亚地区,但是目前有扩散的趋势,对人类健康和公共卫生构成严重威胁。我国研制的乙型脑炎病毒减毒活疫苗至今已接种3亿人份,其安全性及有效性俱佳。用于乙型脑炎减毒活疫苗生产的毒株是SA14-14-2,它是由亲本野毒株SA14经过在细胞和动物中不断传代和多轮蚀斑纯化获得的疫苗株。与野毒株SA14相比,疫苗株SA14-14-2的毒力明显减弱,对鼠和猴等动物的致病性几乎完全丧失,但是其减毒的分子机制并不明确。在本研究中,我们首先利用分子生物学技术构建乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的亚基因组复制子,并利用该复制子初步观察乙型脑炎病毒E蛋白羧基末端氨基酸序列对于复制子复制的影响;在疫苗株复制子的基础上,我们构建并拯救含有乙型脑炎病毒强毒株SA14的E基因的嵌合病毒,观察该嵌合病毒的生物学特征,为乙型脑炎病毒疫苗株的减毒机制研究奠定基础。一、乙型脑炎病毒亚基因组复制子的构建我们首先利用分子生物学技术构建获得了乙型脑炎病毒复制子,将复制子经体外转录后转染BHK21细胞,用间接免疫荧光和RT-PCR的方法对复制子进行了鉴定,发现其可以在转染细胞内进行自身RNA的复制和蛋白表达。为了进一步检测复制子的复制能力,我们构建了含有GFP报告基因的复制子,转染细胞后发现其可以在细胞内正常表达GFP。同时,为了探讨乙型脑炎病毒E蛋白羧基端氨基酸长度对病毒复制的影响,我们分别构建了一系列保留E蛋白羧基端不同数目氨基酸残基的报告基因复制子。将获得的复制子质粒线性化并体外转录后转染BHK-21细胞,通过检测报告基因的活性来观察复制子复制能力和表达外源蛋白的能力。结果显示,所构建的复制子可自主复制和表达外源蛋白,在BHK-21细胞中可持续表达绿色荧光蛋白达10天以上,并且细胞无明显病变。但是不同的复制子,在不同时间点转染细胞中的绿色荧光强度不同,这表明复制子的复制能力有差异,因此我们认为,E蛋白羧基端保留的氨基酸数目对复制子的复制具有一定的影响。总之,我们在本部分中成功构建了乙型脑炎病毒疫苗株的亚基因组复制子,并且证实其可以进行自主复制并且持续表达外源蛋白。二、乙型脑炎嵌合体病毒的构建及其生物学特征嵌合病毒是由结构功能相似的同源或者异源病毒相互替换部分结构基因而3获得的病毒,主要应用于病毒致病和减毒机理及新型疫苗的研究。在本研究中,我们在已经构建好缺失了prM/E基因的SA14-14-2亚基因组复制子的基础上,将乙型脑炎强毒株SA14的prM/E结构基因嵌合到复制子的骨架上,通过反向遗传学技术构建并获得了嵌合全长感染性克隆,并对该乙型脑炎嵌合病毒的生物学特征进行了观察。首先,我们对嵌合病毒在不同细胞系中的生长特性进行测定,结果发现其与亲本病毒株相比无显著差异。其次,通过对嵌合病毒的蚀斑特征及在动物体内的神经毒力和神经侵袭力进行测定,结果显示嵌合病毒的蚀斑大小介于两亲本株之间,其神经毒力和神经侵袭力与强毒株较为接近。最后,我们通过比较嵌合病毒及其亲本病毒株在调控I型干扰素信号通路方面的差异来探讨乙脑病毒疫苗株的减毒机制。结果发现,嵌合病毒与强毒株一样可以抑制STAT1分子的磷酸化及STAT1分子的核转运进程,进而抑制I型干扰素诱导的重要信号转导通路—JAK-STAT通路。随后我们将嵌合病毒及其亲本病毒株通过腹腔途径接种于正常129小鼠和I型干扰素基因敲除的A129小鼠,结果发现:在正常129小鼠中嵌合病毒与SA14一样可以使感染的小鼠死亡,而疫苗株不致病;在敲除了IFN-α/β基因的A129小鼠中,嵌合病毒,强毒株和疫苗株均可以使小鼠在感染后3天内死亡。这说明,在正常129小鼠中,疫苗株由于无法抑制I型干扰素通路因而被免疫系统快速清除,而嵌合病毒和强毒株一样可以抑制I型干扰素通路,无法快速被清除。当敲除I型干扰素基因后,疫苗株则与嵌合病毒及强毒株一样可以不受I型干扰素的影响,在小鼠中能正常复制并且使小鼠发病死亡。由于嵌合病毒与疫苗株仅在E蛋白上具有氨基酸差异,因此我们推断,乙型脑炎强毒株与疫苗株在E蛋白上的差异在一定程度上影响病毒对于I型干扰素通路的拮抗作用,而这也有可能是疫苗株的减毒机制之一。综上,本研究首先利用反向遗传学技术构建了可以自主复制和表达外源蛋白的乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的复制子,并在此基础上成功拯救了乙型脑炎病毒的同源嵌合病毒,通过对嵌合病毒及其亲本株病毒生物学特征的鉴定和比较,我们发现乙型脑炎病毒包膜E蛋白很大程度上决定病毒的毒力、侵袭力及对I型干扰素信号通路的拮抗能力。乙型脑炎病毒反向遗传学系统的建立为乙型脑炎病毒的基因组结构功能研究以及新型疫苗的研制奠定了基础。
汤德元[4]2004年在《乙脑病毒的分离鉴定和全长基因克隆的研究》文中指出乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus，JEV)引起的人和动物共患的一种由蚊虫为媒介传播的病毒性疾病，对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失；猪是JEV的扩增宿主，带毒猪是本病的主要传染源，因此，防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失，而且也是防制乙脑的重要措施。 乙脑病毒基因为单股正链RNA，长约11kb，有单一开放的阅读框，能编码、翻释、加工成多种结构蛋白和非结构蛋白，其病毒的结构蛋白有3种：囊膜蛋白E、膜蛋白M(由膜前体蛋白PrM加工而来)，以及衣壳蛋白C和7种非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5；其中M蛋白参与病毒囊膜的构成，对维持E蛋白的结构是十分必要的，E蛋白在保护性免疫及防制病毒感染起作重要作用；JEV基因组结构的研究，为乙脑病毒的基因工程疫苗的进一步研究提供了理论基础。本论文研究的主要内容包括： 1．乙型脑炎病毒的分离与鉴定 通过收集母猪流产死胎和库蚊为病料，用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离出病毒，采用血凝(HA)实验、荧光抗体染色技术(间接法)、电镜实验、血清学实验及RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定，结果表明所分离的病毒CQRC-1和SCNJ-1均为乙脑病毒；通过RT-PCR扩增CQRC-1株的PrM／E基因，并将PrM／E克隆、测序，与GenBank发表的JEV SA14(U14163)和SA14-14-2(AF315119)基因序列进行比较，分析结果显示：CQRC-1株与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2的同源性分别为98％和97％。 2．乙型脑炎病毒CQRC-1株全长感染性克隆、测序及恢复病毒的获得 根据乙脑病毒强毒SA14株基因组序列，设计覆盖全长的6对重叠引物，以Trizol法提取CQRC-1株的病毒RNA为模板，使用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒扩增出6个片段，并对它们进行测序、连接，然后将全长DNA克隆到质粒载体pET-32a(+)中，构建流行性乙型脑炎病毒CQRC-1株基因组全长cDNA克隆，经体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞，重新获得JEV的恢复病毒，通过生物学特性、分子生物学水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定结果：获得了稳定的全长DNA克隆，转录子转染BHK-21细胞后，第4天开始出现细胞病变(CPE)，第5～6天时CPE为+++，经过BHK21细胞进一步放大培养后，间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性，证实了构建的JEV的全长cDNA克隆具有感染性，为进一步的研究奠定了基础。 3.乙脑病毒CQRC一株PrM/E基因的克隆、表达及生物信息分析 根据JEV SA14株PrM/E基因序列设计并合成了一对引物Pl/PZ，采用RT一PCR从CQRc一1株的RNA中扩增出ZOO0bP目的片段，并将其克隆到pMD18一T克隆载体中，将pMo 28一T一PrM/E经BamHI/Sall双酶切后定向克隆于经同样酶切处理的pET一32a(+)原核表达载体上，获得重组质粒pET一CDNA转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得高效表达，产物经SDS一PAGE电泳结果显示，表达产物分子量约为7Ikoa，Western blot分析表明表达产物具有免疫学活性。 根据己在GenBank上登记的E基因核酸序列采用CLUSTALW软件运用邻接法(neighborj。ining)进行分析并绘制基因树，分析表明分离株CQRC一l和我国大部分分离株属于基因型工11;通过对E蛋白氨基酸序列作多序列比较，表明分离株CQRC一在E蛋白氨基酸序列上符合强毒特征。在JEv基因组5‘端477~2477的长ZOO0nt的决定JEv抗原性的PrM/E区中，CQRC一株与SA14株有40个碱基不同，其中28个单碱基突变为同义突变，另外12个为错义突变，导致相应的氨基酸序列(666个)中的4个氨荃酸发生了突变，其中有2个氨基酸出现在含有关键的抗体和决定簇的E蛋白内，但不影响其功能表达。 本研究成功地分离出乙脑病毒，测定了CQRC一株全长序列，获得其全长感染性克隆，并将其PrM/E基因克隆到pET一32a(+)原核表达载体上，通过大肠杆菌表达系统高效表达了该基因，为乙脑病毒PrM/E蛋白亚单位疫苗、单克隆抗体的制备和诊断试剂的研究及分子流行病学的调查提供了依据。
叶青[5]2015年在《乙脑减毒活疫苗关键功能位点分析及相关病毒载体应用研究》文中提出乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),简称乙脑病毒,是乙型脑炎(简称乙脑)的病原体,主要流行在东南亚和太平洋地区,在全球范围内每年引起约68,000例乙脑病例,死亡约10,000例。乙脑病毒主要以三带喙库蚊为媒介在脊椎动物宿主之间传播。病毒感染严重危害中枢神经系统,约有50%的幸存者患有伴随终生的神经系统后遗症。近年来,乙脑病毒引起的感染范围正在扩大。乙脑已成为世界上最严重的病毒性脑炎类疾病之一,严重威胁人类健康。疫苗接种是预防乙脑的有效手段。乙脑减毒活疫苗SA14-14-2于1989年在中国被批准上市,已有超过3亿儿童接种了该减毒活疫苗。研究显示,该疫苗株具有良好的减毒特性与安全性,生产成本低,单次免疫即能有效诱导产生保护性中和抗体,而且免疫力持久。2013年,该疫苗株通过了世界卫生组织疫苗生产预认证,被推荐在世界范围内使用。但目前对乙脑活疫苗的减毒机制尚不完全清楚。乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属,是有包膜的单股正链RNA病毒。其基因组编码3种结构蛋白【衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白(pr M/M)和包膜糖蛋白(E)】和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白主要参与病毒吸附、侵入和组装,非结构蛋白主要负责病毒基因组的复制。研究表明,黄病毒的非结构蛋白NS1能够以细胞表面、细胞内以及细胞外分泌等多种形式表达,与病毒的复制、组装以及宿主的免疫应答调节密切相关。相关研究还发现,乙脑血清亚组各成员在感染过程中还表达一种NS1相关蛋白NS1′,生物信息学分析显示该蛋白是位于NS2A基因上程序性-1核糖体移码的产物。目前,该血清亚组特有的NS1′蛋白在乙脑病毒致病过程中的表达及功能尚未明确。另一方面,近年来乙脑病毒的流行范围和分布区域发生了较大的改变。基因I型病毒已经逐渐取代原有的基因III型病毒成为当下主要的流行株,而现有的所有乙脑疫苗都来源于基因III型病毒。有研究显示,来源于III型的灭活疫苗诱导宿主产生针对其他基因型病毒株的中和抗体能力明显降低。乙脑减毒活疫苗对目前的I型病毒流行株的保护作用是否受到影响尚有待研究,发现并确认影响乙脑疫苗株保护效力关键的中和位点对乙脑的防控和治疗具有重要的意义。此外,乙脑疫苗株高度减毒,具有良好的安全性及免疫原性,因此有望发展为新的病毒类表达载体。针对上述科学问题,本研究首先对决定NS1′蛋白表达的关键因素以及NS1′蛋白在乙脑病毒致病过程中发挥的作用进行了探讨,进一步发现并确认了影响乙脑疫苗株诱导中和抗体效价的基因型特异中和位点,最后对该疫苗株表达外源基因的可行性和特性进行了评估。本研究主要包括三个部分:一、乙脑病毒非结构蛋白中的毒力位点鉴定与分析为寻找决定NS1′蛋白表达的关键因素及其对病毒毒力的影响,本研究将野生型乙脑病毒SA14与减毒疫苗株SA14-14-2感染BHK-21与C6/36细胞,通过Western blot检测感染细胞中NS1与NS1′蛋白的表达。结果表明,SA14能够在感染细胞中同时表达2种形式的NS1蛋白,而在SA14-14-2感染细胞中仅能检测到NS1蛋白的表达。通过核苷酸序列比对发现,与JEV血清亚组的病毒分离株相比,在疫苗株SA14-14-2 NS2A基因第66位核苷酸存在一个沉默突变(G→A),称为G66A。对乙脑病毒基因组相应区域进行RNA结构预测发现,G66A核苷酸突变影响了位于NS2A基因上的假结结构稳定性,而该假结结构是NS1′蛋白形成的必要条件。为证实该沉默突变对NS1′蛋白表达及病毒毒力的影响,我们在乙脑病毒SA14全长感染性克隆的基础上引入G66A核苷酸突变,拯救获得携带该突变的恢复病毒(G66A)。评价SA14与突变病毒G66A感染细胞中NS1相关蛋白的表达发现,与SA14相比,G66A丧失了NS1′蛋白的表达能力而只能表达NS1。随后,通过比较SA14与G66A突变病毒在小鼠模型上的致病性发现,突变病毒G66A的神经毒力与神经侵袭力均明显弱于SA14,且在鼠脑中的增殖能力也低于SA14。上述研究结果表明,乙脑病毒NS2A的第66位核苷酸突变G66A影响了假结结构依赖的移码,进而抑制了NS1′蛋白的表达,是乙脑病毒的一个新的关键毒力位点。二、乙脑病毒基因型特异中和位点的鉴定与分析为了分析乙脑疫苗株对不同基因型病毒株的保护效力,本研究首先评价了16份减毒活疫苗免疫人血清样品对疫苗株SA14-14-2以及乙脑病毒分离株FJ03、SX06、SC04和SH53的中和效价。结果表明,免疫血清对乙脑病毒分离株的中和效价要显著低于疫苗株。为进一步分析影响中和抗体效价的关键因素,本研究对基因I型和基因III型乙脑病毒的E蛋白氨基酸序列进行了比对,发现第222和327位氨基酸是基因型特异的氨基酸位点。进一步利用反向遗传学技术将A222S与S327T氨基酸突变引入到基因III型乙脑病毒感染性克隆中,拯救携带相应氨基酸突变的恢复病毒(A222S、S327T和A222S/S327T)。突变病毒的蛋白表达效率、蚀斑形态、体外增殖特性和病毒毒力与野生型病毒相比无明显差异,而蚀斑减少中和试验结果表明,乙脑疫苗SA14-14-2免疫血清对突变病毒的中和效价与野生型病毒相比有所降低,该结果表明A222S与S327T突变可能影响了减毒活疫苗免疫诱导的中和抗体效力。本研究进一步将相应的氨基酸突变引入到乙脑减毒活疫苗中,并评价了突变疫苗株对基因I型病毒分离株SX06和SH53的保护效力。结果显示,携带A222S与S327T氨基酸单点突变的疫苗株免疫小鼠诱导的中和抗体效价与原疫苗株相比较高,且突变疫苗株保持了较好的遗传稳定性与减毒特性,表明E蛋白中基因型特异氨基酸位点可能是乙脑病毒潜在的重要中和位点,将A222S与S327T氨基酸突变引入减毒活疫苗基因组中有助于提高其对基因I型病毒流行株的保护效力。三、基于乙脑减毒株的病毒表达系统的建立与应用本研究以乙脑减毒株感染性克隆为基础,通过反向遗传学技术,将基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)的结构基因E3-E2 Domain A片段与脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点序列引入乙脑病毒基因组C基因下游,并在CHIKV基因编码区末端添加终止密码子,构建了携带CHIKV抗原基因的重组病毒感染性克隆。体外转录制备的相应RNA转染细胞后能够导致典型的细胞病变效应,RT-PCR结果显示外源基因被成功插入到乙脑病毒基因组中。重组病毒在BHK-21细胞上形成的蚀斑明显小于乙脑减毒株,且在细胞上的增殖能力有所降低。间接免疫荧光实验证实重组病毒能够有效表达CHIKV外源蛋白。上述结果表明,本研究成功构建了携带CHIKV抗原基因的重组乙脑病毒,并证实了乙脑减毒株作为病毒载体的可行性,该表达系统为新型重组病毒类疫苗的设计和研发奠定了基础。综上,本研究以乙脑病毒感染性克隆为基础,将生物信息学技术与反向遗传学突变分析相结合,证实了乙脑减毒活疫苗SA14-14-2非结构蛋白NS2A中的G66A核苷酸突变破坏了假结结构依赖的核糖体移码,从而抑制了NS1′蛋白的表达,最终降低了病毒的神经毒力以及神经侵袭力;本研究还系统分析了病毒E蛋白中基因型特异氨基酸位点对中和抗体效价的影响。最后,本研究建立了以乙脑减毒株为病毒载体的表达系统,成功实现了外源抗原的重组表达。上述研究结果不仅加深了我们对乙脑病毒致病机制的理解,而且为乙脑疫苗株免疫效力的优化提供了新的思路,同时也为基于乙脑疫苗株的新型病毒重组表达系统的建立和优化奠定了坚实基础。
李世华[6]2015年在《基于乙脑病毒2'-O甲基转移酶的靶向减毒机制研究》文中研究表明乙型脑炎病毒属于黄病毒科,黄病毒属,主要由蚊虫传播,临床上可以引起严重的病毒性脑炎症状。乙型脑炎主要流行于东南亚地区,但近些年来该病的流行区域不断扩大,现已扩展到日本和澳大利亚等地区。全球每年约有35,000~50,000乙脑病例报告,其中约10,000~15,000人死亡,幸存者中约30%~50%的病人留下不可逆的神经系统症状和认知障碍等精神疾病。尽管目前针对乙型脑炎病毒有相应的疫苗进行接种预防,但它的高致死性及区域扩散性依然引起国际社会的广泛关注。乙型脑炎病毒为单股正链RNA病毒,基因组长度约为11,000nt,包括5'非编码序列(5'NCR),3'非编码序列(3'NCR)和中间的单一开放阅读框(ORF)。ORF可以编码三种结构蛋白C,pr M,E以及七种非结构蛋白NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5。病毒基因组5'端有I型帽子结构(m7Gppp Am G)但是其3'端缺少多聚腺苷酸poly(A)尾巴。帽子结构对于m RNA的转运,翻译以及稳定性至关重要。m RNA的加帽过程一般需要四种酶,分别是RNA三磷酸酶,鸟苷酸转移酶,N7和2'-O甲基转移酶。由于黄病毒在宿主细胞质中复制,不能利用宿主的N7和2'-O甲基转移酶,因此进化出了自己的甲基转移酶系统。黄病毒NS5蛋白的N端具有甲基转移酶活性,可以催化病毒RNA帽子结构的N7和2'-O甲基化。目前对于黄病毒甲基转移酶以及病毒RNA帽子甲基化的了解主要来自于对西尼罗病毒和登革病毒的研究,但是乙型脑炎病毒的相关研究却较为滞后,其甲基转移酶体外活性分析方法也尚未建立。因此本研究的目的是建立乙脑病毒N7和2'-O甲基转移酶体外活性分析体系,并筛选出对甲基转移酶活性具有影响的关键位点,进而测定2'-O甲基转移酶功能缺失对于病毒生物学特征的影响,最后探索将2'-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒作为减毒活疫苗候选株的可行性。1.乙脑病毒甲基转移酶体外活性分析方法的建立及酶活性关键位点筛选为了建立乙脑病毒甲基转移酶体外活性分析方法,首先我们在大肠杆菌中重组表达并纯化了乙脑病毒的甲基转移酶蛋白,纯化后的重组蛋白大小约为35 k Da,纯度大于95%。然后我们通过PCR和体外转录获得乙脑病毒5′UTR起始190nt的ppp A-RNA,将其作为加帽反应的底物。继而利用牛痘病毒的加帽酶系统对ppp A-RNA进行加帽,获得G*ppp A-RNA或者m7G*ppp A-RNA(*表示后面的第一个P被放射性标记)分别作为N7和2'-O甲基化反应的底物。在登革病毒甲基转移酶活性测定方法的基础上,我们对乙脑病毒RNA的N7和2'-O甲基化反应的盐离子浓度,温度,时间等条件进行优化,建立了测定乙脑病毒N7和2'-O甲基转移酶体外活性的最佳反应条件和分析方法。在此基础上,我们通过定点突变的方法测定NS5蛋白K61-D146-K182-E218四分体氨基酸位点突变对于乙脑病毒N7和2'-O甲基转移酶功能的影响。结果显示,乙脑病毒NS5蛋白的K61A,D146A,K182A,E218A位点突变均会完全破坏2'-O甲基转移酶功能,而对于N7甲基转移酶活性,除D146A完全破坏外,其它三个突变位点K61A,K182A和E218A均保留了部分N7甲基转移酶活性。这些结果表明K61,D146,K182和E218位点对于乙脑病毒2'-O甲基转移酶执行其功能是必需的,而D146对N7甲基转移酶执行其功能是必需的。2.2'-O甲基转移酶功能缺失对乙脑病毒生物学特征的影响为了研究2'-O甲基转移酶功能的缺失对于乙脑病毒生物学特征的影响,我们通过定点突变的方法将K61A,D146A,K182A和E218A分别引入到乙脑病毒全长感染性克隆的质粒上,经线性化和体外转录后,我们将病毒转录体RNA转染BHK-21细胞,最终获得了K61A和E218A两株2'-O甲基转移酶功能缺陷型重组乙脑病毒(D146A,K182A致死)。进而,我们测定了突变型和野生型乙脑病毒的生物学特征,包括病毒蛋白的表达,噬斑形态,在细胞上的增殖特征,基因组的遗传稳定性,在小鼠中的神经毒力和神经侵袭力以及对干扰素和IFIT(IFN induced proteins with tetra-tricopeptide repeats)的敏感性等。结果发现,在转染等量病毒RNA的BHK-21细胞中,突变病毒E蛋白的表达水平与野生型相当;突变病毒的噬斑远小于野生型;突变病毒在多种细胞系中均可以良好的复制,复制效率略低于野生型;突变病毒具有良好的遗传稳定性;突变病毒在小鼠上丧失神经侵袭力,并且神经毒力较野生型病毒明显降低;小鼠感染突变病毒后无病毒血症出现,同时突变病毒在小鼠颅内的复制效率降低;突变病毒在神经细胞上的增殖能力与野生型相比降低;机制上,我们发现突变病毒对干扰素和IFIT的抗病毒作用与野生型病毒相比更为敏感。综上,2'-O甲基转移酶功能缺失使乙脑病毒显示出良好的减毒特征,而这种减毒特征可能与突变病毒对宿主干扰素以及IFIT的抗病毒作用更为敏感有关。3.2'-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒的免疫原性和免疫保护性研究为了探索将2'-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒作为减毒活疫苗候选株的可行性,我们继而对其免疫原性和免疫保护性进行了研究。将104 PFU的重组突变病毒以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠,在免疫后的二周和四周分别采血并测定血清中Ig G抗体及JEV特异性中和抗体水平,同时测定诱导产生的细胞免疫水平。结果发现,单次免疫即可诱导小鼠产生高水平的Ig G抗体以及JEV特异的中和抗体,其中免疫四周后的中和抗体滴度高达1:97。同时脾细胞增殖和IFN-γ产生实验结果说明,重组病毒免疫还可以诱导产生一定的细胞免疫。为了验证免疫的效果,我们用致死剂量的异型的野生型乙脑病毒感染免疫后的小鼠,结果发现,PBS对照组的小鼠全部死亡,而重组突变病毒免疫组的小鼠全部存活。这说明2'-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒单次免疫即可对小鼠产生完全保护。综上所述,本研究建立了乙型脑炎病毒N7和2'-O甲基转移酶体外活性分析体系,在此基础上测定了保守关键位点突变对甲基转移酶功能的影响以及2'-O甲基转移酶功能缺失对于病毒生物学特征的影响。这些研究完善了我们对黄病毒甲基转移酶及RNA帽子结构甲基化的了解,同时深化了对病毒和宿主的相互作用关系的认识。另一方面,2'-O甲基转移酶缺陷型乙脑病毒在细胞中复制良好,在体内和体外高度减毒而且减毒机制明确,遗传稳定性好,同时具有很好的免疫原性和免疫保护性。因此,它可以被作为一种理性设计的减毒活疫苗候选株,同时这种基于2'-O甲基转移酶的靶向减毒策略也可以应用于其他病毒。
韦艳[7]2009年在《以乙脑病毒SA_(14)-14-2为载体构建乙脑/登革2型嵌合病毒的研究》文中研究表明登革病毒(DV)是黄病毒科黄病毒属成员,包含四个血清型,通过伊蚊传播。DV感染是当今人类中流行最广的虫媒病毒病,几乎在所有的热带、亚热带地区都有分布。登革病毒感染后可导致登革热、登革出血热、和登革休克综合征。据WHO估计,全球有25～30亿人口面临感染登革病毒的危险,每年因登革病毒感染死亡的人数是2.5万。关于登革病毒及其感染还有许多迄今未了解和解决的问题,严重制约了登革病毒疫苗的研制,因此至今尚无安全有效的疫苗推广应用。在感染性克隆技术基础上发展而来的嵌合病毒技术为黄病毒疫苗的研究提供了—条新的思路。乙脑病毒与登革病毒都同属黄病毒科黄病毒属的成员,为单股正链RNA病毒,基因组长约11kb,含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5'NCR—C-PrM/M-E-NS1-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR3',共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中prM/E基因编码的M蛋白及E蛋白是病毒的膜蛋白,与诱导产生中和抗体有关,非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。乙脑病毒SA14-14-2株是我国自行研制的减毒活疫苗株,具有良好的安全性。本研究的主要目的是以SA14-14-2为基因骨架,用DV2病毒的prM/E基因替换其相应基因,构建乙脑/登革2型病毒,为研制登革病毒新型疫苗进行探索。本课题组既往已成功构建JEV SA14-14-2株的感染性克隆pBRF,本研究在此基础上,将结构蛋白prM/E基因缺失,替换为多克隆位点,以插入外源基因。为了避免引起致死性的删除,在缺失结构蛋白时,采取了两种方案：一种完全缺失prM/E基因,获得的载体命名为pFull△prM/E;另一种保留了E蛋白C端的71个氨基酸,因为这部分序列为NS1蛋白的信号肽序列,对于NS1蛋白表达与分泌可能会有影响,获得的载体命名为pPartial△prM/E。序列分析结果表明,构建的两个复制子载体都保留了NS2B-63、NS3-105、NS4A-225这3个位于非结构蛋白上的可能减毒位点。为了解所构建复制子载体pFull△prM/E及pPartial△prM/E的自主复制能力及表达外源蛋白的能力,我们进行了如下研究：(1)pFull△prM/E及pPartial△prM/E经单酶切线性化后,通过体外转录获得RNA。将RNA转染BHK细胞,并于转染后24h、48h、72h、96h收获细胞,提取RNA后反转录合成cDNA。每一时段的cDNA实施real time PCR检测,结果发现RNA拷贝数持续增加,以96h后增加倍数最多。表明构建的两个复制子均具有自主复制能力。(2)在pFull△prM/E Replicon和pPartial△prM/E Replicon载体的多克隆位点处插入YFP报告基因,并将带报告基因的体外转录RNA转染BHK细胞,结果在荧光显微镜下,可以看到荧光信号的持续增强。于转染后24h、48h、72h、96h收获细胞,流式细胞仪检测结果显示表达YFP的阳性细胞率逐渐增加,与镜下观察结果一致。表明所构建的两个复制子载体均能表达外源蛋白。在上述研究的基础上,进一步构建了乙脑/登革2型嵌合体克隆,并对嵌合病毒进行了拯救。采用RT-PCR技术获得DEN2(NGC株)的prM/E全长基因以及去除了prM/E基因3’端213nt的基因片段(1770nt)。前者克隆入pFull△prM/E载体,后者克隆入pPartial△prM/E载体(将登革prM/E基因C端的71个氨基酸替换为乙脑的相应部位),获得了pJED2及pJED2-1770两个嵌合体克隆。将pJED2及pJED2-1770采用单酶切线性化后,体外转录获得RNA,用RNA转染BHK细胞,与转染后5-7天可观察到典型的CPE,成功拯救出了两株嵌合病毒JED2V和JED21770V。(?)哿收集的P1代毒在BHK-21细胞中作连续传代,结果盲传5代均不能检测到病毒。而在C6/36细胞中培养的嵌合病毒JED2V及JED21770V可使细胞在感染5天左右出现典型病变,RT-PCR、IFA、Weston-blot鉴定结果表明所拯救的病毒具有嵌合RNA,能表达DV2的包膜蛋白。将嵌合病毒免疫Balb/C小鼠,四周后收集小鼠血清行抗DV2E蛋白IgG抗体及血清中和抗体效价检测,结果表明,嵌合病毒能使Balb/C小鼠产生特异的抗DV2E蛋白IgG抗体,血清中和抗体效价达1：10左右。进一步地,以乳鼠为实验对象,观察了嵌合病毒对乳鼠的神经毒力。将嵌合病毒JED2V、JED21770V及DV2、JEV从10-5TCID50/200ul开始,做10倍系列稀释,共设5个剂量梯度,每种病毒的每个剂量均脑内接种乳鼠,连续观察14天。各组小鼠的平均存活时间及相同剂量情况下的不同病毒组别间的生存曲线的Log-rank检验结果显示,两株嵌合病毒在各剂量水平的生存率均低于JEV相应组别(p<0.05)；与DV2相应组别比较,在有的剂量水平,生存率没有显著差异,而在有的剂量水平,生存率也较低(p<0.05)。说明我们获得的两株嵌合病毒并非减毒株。综上所述,本研究成功构建了JEV SA14-14-2株SA14-14-2株的复制子载体,并引入了方便外源基因克隆的多克隆位点,构建的JEV复制子载体经证实具有自主复制能力和表达外源基因的能力,为JEV载体的进一步应用奠定了基础。在此基础上成功拯救的乙脑/登革2型嵌合病毒具有嵌合的核酸、能表达DV2包膜蛋白、并能使Balb/C小鼠产生特异的抗DV2E蛋白抗体,尽管未得到理想的减毒效果,却也为采用反向遗传学技术研究登革病毒新型疫苗进行了有益的探索。随着研究的深入,可将获得的嵌合体感染性克隆作系列定点突变,以期获得减毒嵌合病毒,同时也可在一定程度上作为乙脑病毒及登革病毒致病机理的分子模型。
参考文献：
[1]. 乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究[J]. 黄庆生, 马文煜, 姜绍谆, 樊英茹, 张富泉. 中国病毒学. 2000
[2]. 乙脑病毒全长cDNA的扩增、克隆及体外转录制备感染性转录体的研究[D]. 黄庆生. 第四军医大学. 1999
[3]. 乙型脑炎病毒反向遗传学系统的建立及应用[D]. 李世华. 中国人民解放军军事医学科学院. 2011
[4]. 乙脑病毒的分离鉴定和全长基因克隆的研究[D]. 汤德元. 四川农业大学. 2004
[5]. 乙脑减毒活疫苗关键功能位点分析及相关病毒载体应用研究[D]. 叶青. 中国人民解放军军事医学科学院. 2015
[6]. 基于乙脑病毒2'-O甲基转移酶的靶向减毒机制研究[D]. 李世华. 中国人民解放军军事医学科学院. 2015
[7]. 以乙脑病毒SA_(14)-14-2为载体构建乙脑/登革2型嵌合病毒的研究[D]. 韦艳. 中国疾病预防控制中心. 2009
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