（遂宁市中心医院呼吸内科 四川遂宁 629000）
【摘要】目的：探讨IL-21对人外周血γδT细胞增殖及炎症因子表达的影响。方法：从健康志愿者外周血中分离处γδT细胞，并使用IL-21刺激扩增γδT细胞，并设置空白对照组，在第3天、6天、9天使用流式细胞计数检测γδT细胞的增殖数量，使用ELISA法检测炎症因子IL-21、IL-17、IFN-γ的浓度水平；加入IL-21的γδT细胞与处于对数期生长的肺癌A549细胞混合培养， 24小时后用MTT法检测γδT细胞对肺癌A549细胞的细胞毒性。结果：流式细胞计数显示，加入IL-21组γδT细胞的数量较空白对照组显著增加（P＜0.001）；ELISA结果提示IL-21、IL-17、IFN-γ的浓度水平较空白对照组升高(P＜0.01)；γδT细胞对肺癌A549细胞具有较强的细胞毒性作用，加入IL-21组，γδT细胞对肺癌A549细胞的细胞毒性作用较空白对照组增强（P＜0.05）。结论：IL-21能增强γδT细胞的抗肿瘤活性，能促进γδT细胞的增殖及促进γδT细胞炎症因子的释放。
【关键词】γδT细胞；IL-21；炎症因子；肺癌A549细胞
【中图分类号】R36 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）26-0082-02
IL-21对免疫系统具有多效性调控作用，能促进NKT细胞、γδT细胞等免疫性细胞的增殖与分化[1]，并促进γδT细胞释放淋巴因子，且能与γδT细胞表现出共刺激作用[2]，在IL-21对γδT细胞肿瘤活性的影响研究中，发现IL-21能增强γδT细胞的抗肿瘤活性[1,2]，但是其具体的作用机制仍不明确，为了探讨IL-21是否可以调控γδT细胞活性，本研究使用IL-21作用于γδT细胞，分析其对γδT细胞的增殖及对γδT细胞分泌炎症因子IL-21、IL-17、IFN-γ表达的影响，检测IL-21在γδT细胞对肺癌A549细胞毒性实验中的作用，为肺癌等肿瘤患者的免疫治疗提供了一定的理论依据及实验室基础。
1.材料与方法
1.1 材料
IL-21试剂、MTT相关试剂盒及IL-21、IL-17、IFN-γ酶联免疫吸附试验购自购自美国Sigma公司，人淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程研究所，Anti-human gamma delta TCR–FITC、Mouse IgG1 K Isotype Control FITC购自美国eBioscience公司，RPMI1640干粉购自美国Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 γδT细胞的提取 抽取健康志愿者血液100ml，用Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核淋巴细胞，在5%CO2、37oC恒温培养箱中培养3天，经分离浓缩后转入EP管中，加入Anti-human gamma delta TCR–FITC荧光抗体，设置同型阴性对照，用流式细胞仪分离纯化γδT细胞，检测γδT细胞的纯度，将分离获取的γδT细胞用RPMI1640调整细胞浓度至105/ml备用。
1.2.2 IL-2作用于γδT细胞 将γδT细胞培养于6孔板中，每孔中加入1×105个细胞，培养24小时后，随机分为两组：空白对照组（不加入IL-21）、IL-21刺激组（10umol/mL），将处理好的细胞放置于5%CO2、37℃的恒温培养箱中培养，每个实验组设置5个复孔，重复3次，每隔2天换液1次，分别在第3天、第6天、第9天检测上清液中IL-21、IL-17、IFN-γ的浓度。
1.2.3 IL-8、IL-17、IFN-γ浓度测定 取各实验组上清液，参照IL-21、IL-17、IFN-γELISA试剂盒说明书检测IL-21、IL-17、IFN-γ的含量。
1.2.4肺癌A549细胞的细胞毒性检测 在96孔板中，加入肺癌细胞1000个，在恒温培养箱中培养2小时，按照下列方式分组：入γδT细胞2000个（效靶比：20:1）；加入γδT细胞20000个，IL-21（10umol/ml）；加入IL-21（10umol/mL）；在恒温培养箱中培养24小时，然后用MTT法检测细胞凋亡抑制率，每组设置5个复孔，重复3次。
1.3 统计学处理
采用SPSS16.0进行统计学处理，结果以均数±标准差表示，组与组之间采用t检验，结果以P＜0.05有统计学差异。
2.结果
2.1 γδT细胞的总数
在第9天时空白对照组每孔γδT细胞的总数为（2.06±0.39）×105，加入IL-21组每孔γδT细胞的总数为（5.45±1.23）×105，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 细胞因子的浓度
用IL-21刺激γδT细胞后，分别在第3天、第6天、第9天用ELISA检测IL-21、IL-17、IFN-γ的浓度，ELISA结果提示IL-21组IL-21、IL-17升高，较空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与空白对照组相比，IL-21组IFN-γ显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）（见表）。
2.3 A549细胞毒性检测结果
MTT结果显示，未加入IL-15组，肺癌A549细胞凋亡抑制率为0.33±0.05，加入IL-21组凋亡抑制率分别为0.69±0.09，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。
3.讨论
在晚期肿瘤的治疗中，肺癌等肿瘤对放疗、化疗产生抵抗也是肿瘤进一步恶化的关键所在，近年来的研究发现细胞免疫在肿瘤的发生、发展中发挥着越来越重要的作用，尤其是晚期肿瘤[3]。
近年研究发现IL-21对免疫系统具有多效性调控作用，能促进NKT细胞、γδT细胞等免疫性细胞的增殖与分化[1]，并促进γδT细胞等淋巴细胞释放淋巴因子，且能与γδT细胞等淋巴细胞表现出共刺激作用[1,2]，本研究中也发现经IL-21刺激后，γδT细胞分泌IL-21浓度明显升高，得出了相似的结论；还有研究发现IL-21联合NKT细胞作用于肿瘤细胞，极大的增强了NKT细胞的细胞毒性功能、与免疫杀伤作用。而在IL-21对γδT细胞肿瘤活性的影响研究中，发现IL-21能增强γδT细胞的抗肿瘤活性，但是其具体的作用机制仍不明确，而本研究发现，IL-21不仅能对γδT细胞起到刺激扩增作用，还能刺激γδT细胞产生大量的淋巴因子，并且观察到IL-21联合γδT细胞对肺癌A549细胞起到了较强的细胞毒性作用，这也提示IL-21作为免疫调节因子，联合γδT细胞治疗肺癌等肿瘤患者的可能性，但是其具体的作用机制仍然有待进一步明确，且其用药的安全性也有待进一步研究。
【参考文献】
[1]但卫斌，黄小芳，吴大和，等.60例非小细胞肺癌中IL-21R、MMP-2的表达及意义[J].肿瘤学杂志，2017，07:610-614.
[2]傅庆国，李克强，胡锡浩，等.肿瘤HSP70活化的γδTCR+CIK杀瘤活性的实验研究[J].现代实用医学，2009，21（12）：1283-1285.
[3]杜发旺，李琼雅，王娟，等.丙戊酸钠在γδT细胞对肺癌A549细胞免疫中的作用[J].中国免疫学杂志，2013，29（2）：175-179.
论文作者:杜发旺
论文发表刊物:《心理医生》2018年9月26期
论文发表时间:2018/10/9
标签：细胞论文; 肺癌论文; 作用论文; 肿瘤论文; 因子论文; 毒性论文; 浓度论文; 《心理医生》2018年9月26期论文;