李涛[1]2003年在《草原兔尾鼠卵透明带3（ZP_3）DNA疫苗免疫不育的研究》文中研究说明草原兔尾鼠是一种只分布在新疆北部地区荒漠草地的重要害鼠之一，它种群密度高，终年活动，在食物缺乏的季节，啃食植被的根皮，严重影响了新疆农牧业的可持续发展。因此，如何有效地控制草原兔尾鼠的种群数量已成为新疆畜牧业发展的一个重要因素。然而，传统的机械捕杀和化学毒杀等方法，都没有从根本上解决这个问题。随着生殖免疫技术的发展，科学家们发现哺乳动物免疫系统和生殖系统之间存在着密切而又复杂的联系，通过免疫不育技术就可以达到抗生育的目的。使鼠类等有害动物的种群控制进入了一个新的时期。动物种群的免疫不育控制实质上是阻断和破坏动物的正常生殖过程，使其丧失生殖能力。免疫不育技术除能使动物个体不能或降低生殖外，还能使动物继续占有配偶，巢域，消耗资源，保持社群紧张，抑制种群生长，能够起到长期压低种群数量，抑制其超补偿性增殖的作用。在免疫不育技术的运用中，靶抗原的选择是非常关键的。研究者发现所有哺乳动物的卵子外均被卵透明带(ZP)所包被，鼠的卵透明带是由ZP_1、ZP_2和ZP_3这叁种主要的糖蛋白组成。其中ZP_3蛋白是生殖过程中介导精卵结合的关键因子。而抗ZP_3抗体可以阻断精卵的相互作用，因此ZP_3可被用作免疫不育控制有害动物种群数量研究的重要靶抗原。本研究以本实验室克隆的新疆草原兔尾鼠的ZP_3基因为靶抗原构建了重组真核表达质粒DNA疫苗，探讨了用此DNA疫苗免疫草原兔尾鼠，激发草原兔尾鼠体内免疫应答和产生不育的可能性。研究工作主要包括IZP_3表达载体的构建、融合蛋白的表达及免疫不育的初步实验等。 为了免疫草原兔尾鼠制备抗血清，首先构建了真核表达重组质粒pCMV4-1ZP3。方法是：经DNAMAN等生物分析软件分析了连接在测序载体上的1ZP3全长序列和真核表达载体pCMV4的酶切位点后，用KpnI和HindIII双酶切PMD18-T-1ZP3和真核表达载体pCMV_4，回收酶切目的片段，混合连接并鉴定新疆大学生命科学与技术学院硕士学位论文正确后，将此重组质粒pCMV4叫 导入体外培养的Hela细胞中，RT干CR法检测到pCMV4－IZP3质粒DNA在Hela细胞瞬时表达系统中能够特异性地表达IZPa蛋白。这说明构建的pCMV4－IZP3质粒DNA能够进一步地作为DNA疫苗，进行草原兔尾鼠免疫不育的实验。大量制备重组质粒PCMV4－IZP3。将雌性草原兔尾鼠随机分为两组，经盐酸普鲁卡因处理24小时后分别在一侧后肢股四头肌肌肉处注射构建的真核表达重组质粒pCMV4－IZP3及对照质粒pCMV4。注射的DNA量为每次每只草原兔尾鼠50Ug／50UL。分别于1、3、5周免疫H次，每次免疫前一天，于草原兔尾鼠眼后底眶取血，收集抗血清。 为了进一步检测抗血清，根据己测序的连接在pMD＊载体上的IZP3核心片断（IZP3Cf）和原核表达载体GST4TI的多克隆位点序列，分析读码框，确定共用酶切位点 EcoRI和 Sail，将它们双酶切后，混合连接。经双酶切和快速 PCR法鉴定重组质粒GST－IZP3Cf构建正确后，将该质粒转化进入表达菌株大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导后，裂解细胞，用沁S－PAGE鉴定裂解物，检测融合蛋白的表达，纯化融合蛋白，用ELISA法检测制备的IZP3抗血清。结果显示经叁次免疫后，实验组草原兔尾鼠产生了明显的抗IZP3抗体。 免疫六周后，将经pCMV4－IZP3真核表达重组质粒免疫的实验组雌性草原兔尾鼠和对照组雌性草原兔尾鼠分别与未免疫的雄性草原兔尾鼠合笼以检测pCMV4－IZP3质粒DNA疫苗免疫后草原兔尾鼠生育情况。抗生育实验结果表明，接受DNA疫苗的9只雌鼠，有2只在实验中没有生育，而其它7只能生育的草原兔尾鼠产下了正常大小的仔鼠和未成形的胚胎，免疫组平均每只产2．9只正常幼鼠。与此相比较，接受对照质粒pCMV4免疫的草原兔尾鼠全部可生育，且平均每只产5．4只幼鼠。免疫组和对照组之间存在着显着差异（P＜0．05）。研究结果表明IZP3抗体水平的高低与草原兔尾鼠能否产生不育效果有着直接的联系，IZP3可做为控制草原兔尾鼠种群数量的 DNA不育疫苗。为了说明免疫后不育的直接原因，取免疫组和对照组雌性草原兔尾鼠的卵巢，制备石蜡切片进行显微观察。结果表明经重组质粒 PCMV4－IZP3，DNA疫苗免疫后，实验组卵巢结构 第6贞共86页 新疆大学生命科学与技术学院硕士学位论文发生变化，直接影响了生殖能力。 本研究结果表明，利用基因免疫不育技术，以草原兔尾鼠ZP3基因为靶抗原，能在草原兔尾鼠这一物种中降低繁殖率，为进一步利用dP3作为靶抗原制备免疫不育疫苗控制草原兔尾鼠种群数量，保护草原植被，促进新疆的经济发展奠定了科学理论基础。
张钰, 李轶杰, 刘菲, 陈蓉, 郭继华[2]2007年在《草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究》文中提出为探讨不同种类小鼠卵透明带3(zp_3)的免疫不育效果,并筛选高效且具有物种特异性的DNA抗生育疫苗,本研究选择草原兔尾鼠卵透明带3(Lzp_3)和昆明白小鼠卵透明带3(Mzp_3)构建不同的DNA抗生育疫苗表达载体,pcDNA3-mzp_3(pcD-M)、pcDNA3-lzp_3(pcD-L)、pcDNA3-aat- comp-mzp_3(pcD-ACM)和pcDNA3-aat-comp-lzp_3(pcD-ACL)分别免疫NIH小白鼠。研究中用水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染检测小鼠体内真核表达情况,结果表明四种质粒均能在小鼠肝脏中进行表达:ELISA图示表明重组质粒均能使小鼠激发较高水平的特异性抗体;抗生育结果表明四种DNA疫苗均具有免疫不育的效果(P<0.05),其中pcDNA3-aat-comp-mzp_3(pcD-ACM)的免疫效果最好(P<0.01);卵巢病理切片H.E染色结果显示pcD-M和pcD-L组卵巢结构与对照小鼠区别不大,而pcD-ACL和pcD-ACM组卵巢结构发生病理性变化。结果初步说明草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3对NIH小白鼠均有抗生育效果,但不具有物种特异性。
李晨晨, 于继云, 姜敏, 涂亦娴, 马晓林[3]2011年在《草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究》文中认为目的:构建草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3进行小鼠的黏膜免疫,增强该疫苗的免疫不育效果。方法:将两种佐剂分子大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基和C3d基因通过酶切鉴定,构建重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3,采用RT-PCR和W estern b lot技术,检测其在mRNA和蛋白水平的表达,并通过肌肉注射、滴鼻和灌服3种途径免疫雌性C57BL/6小鼠,通过ELISA检测抗体水平及分型。结果:酶切鉴定,RT-PCR和W estern b lot结果表明重组质粒构建正确并可在mRNA和蛋白水平的表达,ELISA结果表明以重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3免疫诱导的特异性IgG、IgA的水平明显高于对照组(P<0.01)。抗生育实验表明该疫苗免疫的小鼠平均生仔数与对照组相比差异极显着(P<0.01)。结论:构建的草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3可高效地激发小鼠特异性免疫应答,提高抗生育的效果。
参考文献：
[1]. 草原兔尾鼠卵透明带3（ZP_3）DNA疫苗免疫不育的研究[D]. 李涛. 新疆大学. 2003
[2]. 草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究[J]. 张钰, 李轶杰, 刘菲, 陈蓉, 郭继华. 分子细胞生物学报. 2007
[3]. 草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究[J]. 李晨晨, 于继云, 姜敏, 涂亦娴, 马晓林. 细胞与分子免疫学杂志. 2011