（1.辽宁电力中心医院 现辽宁中医药大学研究生在读；
2.辽宁中医药大学；3.中国医科大学；4.沈阳陆军总医院）
摘要：目的 研究脂多糖对大鼠腹膜间皮细胞TLR4和IL-6的表达影响及机制，从而为进一步探明腹膜透析相关性腹膜炎发生的机理及防治开辟一条新的途径。方法 胰蛋白酶消化法原代培养大鼠腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：（1）正常对照组（0mg/L LPS）；（2）LPS组：不同浓度的LPS（0，1.0，10，100mg/L）分别作用8小时；1提取细胞分别检测TLR4mRNA，IL-6mRNA的表达，另将细胞消化并制成细胞悬液，用于流式细胞检测膜受体蛋白TLR4。结果 （1）不同浓度LPS作用RPMC后，TLR4mRNA和IL-6mRNA表达显著上调，呈剂量依赖性，与对照组比较，组间差异均有统计学意义（p<0.05）（2）LPS刺激下腹膜间皮细胞TLR4蛋白检测结果 不同浓度LPS作用RPMC后，TLR4蛋白表达上调，呈剂量依赖性，与0mg/L LPS组比较，组间差异均有统计学意义（p<0.05）。结论 腹膜间皮细胞存在TLR4表达，且受LPS刺激后表达显著增强，炎性介质相应增加，提示TLR4可能参与了腹膜透析腹膜炎的过程，为进一步研究通过阻断TLR4传导通路药物减少腹膜透析腹膜炎提供了理论依据。
Toll样受体家族是重要的病原成分识别受体，Toll样受体4（TLR4）作为脂多糖（LPS）信号转导受体，在与LPS反应后可导致NF-κB激活，由此诱导细胞因子、化学趋化因子和其他转录因子的表达，可导致过量炎性介质的释放[1，2]。腹膜透析相关性腹膜炎是导致腹膜透析患者退出和死亡的主要原因[3，4]，腹膜透析肠道细菌容易穿透腹膜进入腹腔，LPS是大肠杆菌的唯一内毒素，腹膜间皮细胞（PMCS）是腹膜最大的细胞群，直接接触腹膜透析液，完整且功能正常的间皮层对维持腹膜透析效能发挥了极其重要的作用[5，6]。本实验通过研究LPS对体外培养的腹膜间皮细胞表达TLR4及炎性因子白细胞介素6（IL-6）的影响，为进一步探明腹膜透析相关性腹膜炎发生的机理及防治开辟一条新的途径。
1.材料和方法
1.动物和试剂：体重120-130g清洁级SD大鼠，由中国医科大学实验动物中心提供。DMEM/F12干粉培养基和胎牛血清（美国Hylone），LPS粉剂（美国Sigma），Trizol试剂（美国Invitrogen），逆转录试剂盒（美国Fermentas），兔抗大鼠TLR4抗体和羊抗兔FTTC抗体（北京中杉），PCR引物由上海生工公司合成。
2.大鼠腹膜间皮细胞的培养、传代及鉴定：
局麻后无菌状态下取大鼠大网膜，在PBS中洗去红细胞，然后用含0．125％胰蛋白酶、0．01％EDTA的PBS液消化20—25 min，之后弃去消化液再加入胎牛血清（FBS）终止消化，吹打收集消化下来的单个细胞，4℃下离心（800 r／min，5 min），得到细胞团，用DMEM／F12培养液（含青霉素、链霉素100 U／ml及20％FBS）重悬细胞，接种于25cm2的培养瓶中，细胞第一次换液在孵育器中孵育24小时，以后每2-3天孵育一次。细胞融合达到80%后，细胞经PBS洗涤一次，室温下用0.125%胰蛋白酶消化3 min，4℃用FBS离心。用DMEM/F12生长液悬浮细胞团。培养24h后，第一次更换溶液，然后每2~3天更换一次。第二代细胞聚集至百分之90，倒置相差显微镜观察，免疫组化染色鉴定细胞角蛋白抗体和波形蛋白抗体。经鉴定为纯度>99％的RPMC。第三代细胞进行实验 [7]。
实验分组：（1）正常对照组：只加1%胎牛血清的DMEM/F12培养基；（2）LPS组：不同浓度的LPS（0，1.0，10，100mg/L）分别作用8小时；检测TLR4mRNA，IL-6mRNA的表达，另将细胞消化并制成细胞悬液，用于流式细胞检测膜受体蛋白TLR4。
RT-PCR法检测TLR4mRNA和IL-6mRNA的表达：以 β-actin为内参照，TLR4引物序列上游：5′AGTGTATCGGTGGTCAGTGTGCTT3；下游5-ATGAAGATGATGCCAGAGCGGCTA3，356bp。IL-6引物序列上游：5′TTGTCGAACAAAGCATGGCACGAG3′，下游：5′ACTTGCCAGCCACATTTCTTGCTG3′710bp。
流式细胞分析仪检测腹膜间皮细TLR4蛋白表达：收集细胞，4%多聚甲醛固定，封闭抗原后，加入兔抗大鼠TLR4抗体4℃过夜，加入羊抗兔FITC抗体孵育45min后上机分析，结果用平均荧光强度（MFI）数字表示。
统计学分析：计量资料数据以均数±标准差表示，组建比较采用单因素方差分析。全部数据采用SPSS18.0进行统计学处理。
2.结果
LPS刺激下腹膜间皮细胞TLR4mRNA及IL-6mRNA表达的变化：
（1）不同浓度LPS作用RPMC后，TLR4mRNA和IL-6mRNA表达显著上调，呈剂量依赖性，与0mg/L LPS组比较，组间差异均有统计学意义（p<0.05），见图1，图2。
图1不同浓度LPS对PMC作用8小时 表达TLR4mRNA的影响
注：与0mg/L LPS比，*P<0.05
（2）LPS刺激下腹膜间皮细胞TLR4蛋白检测结果 （1）不同浓度LPS作用RPMC后，TLR4蛋白表达上调，呈剂量依赖性，与0mg/L LPS组比较，组间差异均有统计学意义（p<0.05）见表1。
3.讨论
本研究表明，通过RT-PCR和流式细胞检测技术，证实培养的腹膜间皮细胞能表达TLR4mRNA及相应的膜蛋白，正常RPMC有少量TLR4表达，LPS能以时间和剂量依赖的方式诱导RPMC表达TLR4上调，并引起炎性介质大量合成，表明LPS可激活RPMC的TLR4信号转导通路。TLR4信号转导通路的激活，可通过激活NF-κB的转录，导致释放IL-6，IL-8，TNF-α等炎性介质，在感染早期对机体起到保护作用，而释放的TNF-α等同时又可作为TLR4的激活因子，形成TLR4激活的自身循环，导致炎性介质大量释放，释放的炎性介质通过介导白细胞激活等作用对腹膜造成损伤[8]。腹膜间皮细胞TLR4的活化早期有利于机体清除外来病原，但过度活化也可能造成腹膜间皮细胞的破坏，引起腹膜透析腹膜炎的发生，在制定腹膜透析相关性腹膜炎的防治策略和措施思路时，了解这一环节，将有助于我们更好的把握腹膜透析腹膜炎的治疗时机和转归，以便寻求促进其恢复的有效措施。
综上所述，腹膜间皮细胞存在TLR4表达，且受LPS刺激后表达显著增强，炎性介质相应增加，提示TLR4可能参与了腹膜透析腹膜炎的过程，为进一步研究通过阻断TLR4传导通路药物减少腹膜透析腹膜炎提供了理论依据。
参考文献
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论文作者:纪晓宁,李志明,马健飞,郑红光
论文发表刊物:《航空军医》2018年2期
论文发表时间:2018/4/12
标签：腹膜论文; 细胞论文; 蛋白论文; 作用论文; 腹膜炎论文; 受体论文; 浓度论文; 《航空军医》2018年2期论文;