肝癌，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们常说的肝癌多指原发性肝癌，而原发性肝癌85%-90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，是我国最常见的恶性肿瘤之一。当机体组织细胞不受体内调节机制的控制，发生多次遗传突变和积累，则产生癌变，而从细胞凋亡的角度来看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致。因此，选择性诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗恶性肿瘤的重要手段之一。有研究文献资料表明[1]，全反式维甲酸（Tretinoin, ATRA）可诱导肿瘤细胞分化和凋亡。奥沙利铂（Oxalipatin, L-OHP) 属第3代铂类抗肿瘤化合物,可抑制DNA的合成，产生细胞毒作用及诱导细胞凋亡的作用[2]。本研究通过比较不同样品试剂对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用，探讨ATRA联合L-OHP能否加强对人肝癌细胞的抑制作用，为药物联合使用治疗肝细胞癌提供线索和参考依据。1 材料和方法1.1 材料1.1.1实验材料人肝癌细胞株SMMC-7721购自中科院上海药物研究所；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM高糖培养基均购自美国Hyclone公司；ATRA、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司, 其中，ATRA用无水乙醇配制成浓度为10-2mol/L、MTT用PBS液配制成浓度5 g/L、DMSO除菌后，于-20 ℃冰箱中存储；注射用奥沙利铂（0.1/支），齐鲁制药（海南）有限公司，生产批号：EA2E7001A。1.1.2 实验仪器 BKQ-B50II立式高压蒸汽灭菌器，博科控股集团有限公司；SW-CJ-1BU单人单面净化工作台，浙江孚夏医疗科技有限公司；37XB倒置显微镜,上海永享光学仪器制造有限公司；移液器，上海荣泰生化工程有限公司；GZX-GF-MBS-1电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；TGL-18M高速台式冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；优普UPR-II-5TNZ纯水机，四川优普超纯科技有限公司；BDF-86V158立式实验室冰箱，博科控股集团有限公司；SP-756P紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。1.2实验方法 1.2.1细胞复苏、培养常规消毒超净台，取出装有人肝癌细胞株SMMC-7721的冻存管，迅速放入37℃水浴，轻轻摇动冻存管使细胞悬液融化，于超净台内将细胞悬液移至10mL的离心管内，用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养液稀释至原体积的4倍，1000rpm离心5min，弃上清液后加新鲜培养液，轻轻吹打使沉于离心管底部的细胞变为混悬状态，后将细胞悬液转移至培养瓶内，将培养瓶放置37℃、5%CO2培养箱内培养，保持较高的细胞密度，用0.25%胰蛋白酶消化，传代（观察细胞生长情况，当细胞铺满瓶底或液体变黄，则传代、更换培养液）。1.2.2 细胞分组分组：空白组：无细胞悬液，只添加100μL的培养基；平行对照组：1 mL/L无水乙醇；ATRA组10-5mol/L ATRA（浓度设定参照相关医学研究[3]）； L-OHP组1-L-OHP组3的 L-OHP浓度（浓度设定参照相关医学研究[4]）分别为10mg/L、20mg/L、40mg/L；联合组1：10-5mol/L ATRA、10 mg/L L-OHP)、联合组2：10-5mol/L ATRA、20 mg/L L-OHP；联合组3：10-5mol/L ATRA、40 mg/L L-OHP。选取处于对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，对其经过消化、离心后用含10%标准胎牛血清的DMEM高糖培养基调整到细胞密度为1×105/mL，用加样枪吸取90μL细胞悬液分别移入到96孔板的9个孔内（此前先用适量的含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基铺底，空白组不加细胞悬液），于37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h，确定细胞贴壁并生长状态良好后，按照上述的分组情况添加对应的试剂和药物。1.2.3细胞形态学变化、生长抑制率检测观察细胞形态变化和生长曲线：确定细胞贴壁并生长良好并按照上述的分组情况添加对应的试剂和药物后，于24h、48 h、72 h时在显微镜下观察细胞形态变化。生长抑制率检测：采用MTT法进行细胞生长抑制率检测，分别在24h、48 h、72 h时将5 g/L的MTT溶液20μL加入到9组培养基中，对应的时间段再4h后加入150μL的DMSO振荡10 min，检测490 nm处各孔吸光度(A )值。1.3统计学方法用SPSS 20.0统计学软件处理数据，若P<0.05，则差异有统计学意义。2 结果2.1 细胞形态学变化培养48 h后，平行对照组细胞生长正常；ATRA组部分细胞断裂、凋亡，细胞间隙增宽；L-OHP组1-L-OHP组3基本相同。联合组大部分细胞断裂、凋亡明显,细胞明显减少；但在作用72 h后,各组凋亡细胞增加数量并不显著。2.2人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用在培养48 h时，ATRA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用最明显，其他各组在这一时期对该细胞的抑制作用也最为明显。其中，以采用联合组的抑制作用最为显著，与单一用药相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；L-OHP组1-L-OHP组3之间的差异无统计学意义（P>0.05）；各联合组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1和图1。表1 各组溶液对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用 分组 A 490值 24h 48h 72h 平行对照组 ATRA组 L-OHP组1 L-OHP组2 L-OHP组3 联合组1 联合组2 联合组3 0.841±0.068 0.795±0.065 0.727±0.055 0.706±0.062 0.701±0.056 0.635±0.046 0.634±0.058 0.638±0.066 1.037±0.088 0.938±0.092 0.772±0.082 0.791±0.089 0.787±0.080 0.573±0.049 0.561±0.078 0.550±0.049 1.134±0.108 0.984±0.072 0.883±0.109 0.878±0.101 0.842±0.085 0.628±0.059 0.656±0.038 0.647±0.054 注：单一用药组与联合组比较，P<0．05；L-OHP组1-L-OHP组3之间相比，P>0．05；各联合组之间相比，P>0．05。
图1 各组溶液对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制率曲线3 讨论细胞凋亡（apoptosis）指为了维持机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是一个主动的过程，1972年Kerr等三位科学家首先提出了细胞凋亡这一概念。目前认为，恶性转化的肿瘤细胞生长失控、增殖过度是产生肿瘤的一个途径；细胞凋亡受阻，不能进行正常的组织清除是产生肿瘤的另一个途径。从而导致组织内肿瘤细胞存活延长，使细胞群体内存活与死亡的平衡被破坏，存活大于死亡，肿瘤增长数目的净增长加大[5]。深入研究细胞凋亡的作用机制，有利于开发相应的抗肿瘤药物，从而达到阻断肿瘤发生和发展的可能。目前发现能诱导细胞凋亡的因素也有很多，如射线、药物等，通过这些因素研究出诱导细胞凋亡而达到抑制肿瘤细胞生长的方法越来越多，用于临床抗肿瘤的治疗手段也越来越丰富，效果越来越好，以诱导细胞凋亡的抗肿瘤药物也随之产生而发挥了很好的临床治疗作用。本研究中的药物试剂全反式维甲酸（Tretinoin, ATRA）可促进肿瘤细胞的分化成熟和凋亡，在提高化疗敏感性方面，也具有一定的作用[6]。ATRA是动物体内维生素A的代谢中间产物，是动物肢体再生过程中必不可缺的物质，有着广泛的生理学和药理学活性。奥沙利铂（Oxalipatin, L-OHP)是第三代铂类抗肿瘤化合物，能促进肿瘤细胞内DNA形成链间和链内交联而中断DNA合成,从而抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[7]。由于两种药物对肿瘤细胞作用机制不同，从理论上讲，将ATRA与第三代铂类抗癌化合物奥沙利铂联合起来，能够综合发挥两种药物在人肝癌细胞SMMC-7721抑制方面的优势作用，从而加强对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制，促进肝癌细胞的破裂和凋亡，进而显著降低肝癌细胞的数量[8]。本次研究实验结果，培养48 h后ATRA组与L-OHP组1-L-OHP组3部分细胞断裂凋亡；联合各组细胞明显减少；但在作用72 h后,各组凋亡细胞无显著增加。48 h时各组药物对细胞SMMC-7721的抑制作用最明显；ATRA联合L-OHP各组的作用最显著，与其他组相比，P<0．05；各联合组之间的差异无统计学意义（P>0．05），和相关医学[9]研究结果相符。综合本次实验的研究数据，验证了ATRA联合L-OHP可加强对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用，促进细胞的破裂、凋亡。而联合用药的目的为发挥药物的协同作用以提高疗效；延迟和减少耐药的发生；减少药物剂量，从而减少药物不良反应。用于肿瘤的化疗药物中，大部分药物有较多的不良反应，常见的是胃肠肠道反应（恶心、呕吐），最严重是骨髓抑制。肿瘤化疗方案中多采用联合用药的方式减少药物剂量，达到提高疗效或（和）减少不良反应的目的。本研究的结果显示，ATRA联合第三代铂类抗癌化合物L-OHP对人肝癌细胞SMMC-7721具有显著的抑制作用，且联合组1中较少剂量的L-OHP与其余剂量较高的联合组对肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用相当，无统计学差异，减少药物用量可达到相同的抑制作用。本文结论可为进一步探讨ATRA联合L-OHP使用治疗肝细胞癌提供线索和参考依据，对其是否有确切的临床意义还需进一步的研究论证。参考文献[1]李甲振,张怀栓,镐英杰等.全反式维甲酸联合干扰素-β对人骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用[J].中华实验外科杂志,2012,29(2):308-311.[2]陶晓明,冯翠,李虎生等.三氧化二砷、全反式维甲酸联合化疗治疗初发急性早幼粒细胞白血病的临床观察[J].肿瘤基础与临床,2013,26(1):18-21.[3]邵杰.人参皂苷Rg3及其与奥沙利铂和索拉非尼联合诱导肝癌细胞凋亡的实验研究[J].南京中医药大学，2012,36(7):173-178. [4]杨占风，倪克梁，林万隆等围介手术期联合应用IFN-a及ATRA治疗肝癌的机制探讨[J].中华肝胆外科杂志，2010,28（4）:295-299.[5]杨全会,许荣焜. 细胞凋亡与肿瘤[J]. 生理学科进展, 2006, 37(4): 373-378. [6]朱喜丹,陈梅,冯林等.全反式维甲酸联合三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的疗效观察[J].国际检验医学杂志,2013,34(3):309-310,312. [7]宫经新,孟建波,马悦等.全反式维甲酸联合复方黄黛片序贯维持治疗对急性早幼粒细胞白血病长期疗效的影响[J].中国中西医结合杂志,2012,32(11):1473-1476. [8]李海燕,曹励民,贺红艳等.全反式维甲酸对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制[J].吉林大学学报（医学版）,2013,39(2):232-235,封2,后插1.DOI:10.7694/jldxyxb20130209. [9]Jiang Y, Yu X, Su C, etal.Chitosan nanoparticles induced the antitumor effect in hepatocellular carcinoma cells by regulating ROS-mediated mitochondrial damage and endoplasmic reticulum stress[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019,47(1):747-756.
论文作者:赵品勇,孟祥林,周燕萍
论文发表刊物:《中国保健营养》2019年第8期
论文发表时间:2020/5/7