符幸涛[1]2007年在《实验室诱导志贺菌属耐喹诺酮类抗生素靶基因突变时序检测》文中研究表明志贺菌属细菌又称痢疾杆菌，是感染性腹泻的主要病原体之一。它所引起的细菌性痢疾是一种全球流行的急性肠道传染病，在全世界年病例数超过2亿，年死亡人数约60万人，其中2／3是儿童。尽管世界各国在菌痢防治上付出了巨大努力，但由于志贺菌菌型多、菌株易变迁、感染后免疫力不持久、型间无交叉免疫等等原因，在卫生条件相对落后的发展中国家，菌痢仍难以预防；而在治疗上，随着现代医学技术的发展，特别是近年来由于滥用抗菌药物，志贺菌频繁发生变异产生耐药株，且耐药率高、耐药产生速度快、耐药范围广，不断给细菌性痢疾的治疗带来新的挑战。由此，细菌性痢疾的耐药性问题已成为临床和流行病学菌痢防治上的重要课题。喹诺酮类抗生素是目前治疗菌痢的主要药物。上世纪80年代喹诺酮类药物应用于临床，志贺菌属细菌起初对其敏感性较高，达95％以上，菌痢的疗效曾一度改观。但近年来已发现敏感性降至85％以下。鉴于菌痢在肠道传染病防治工作中的重要地位及喹诺酮类药物目前在临床治疗感染性腹泻的重要性，研究志贺菌属细菌的耐药性，尤其对喹诺酮类药物的可能机制显得十分必要。喹诺酮耐药机制研究的最新成果显示，细菌耐受喹诺酮类药物的机制可能有以下四个方面：①靶基因突变，主要是编码DNA促旋酶A亚基的基因gyrA和编码拓扑异构酶Ⅳ的C亚基的基因parC突变；②主动外排系统；③细菌细胞膜通透性的改变；④质粒介导的耐药。其中前叁种耐药机制均为染色体突变介导的。目前认为，靶基因突变在细菌对喹诺酮类耐药中起重要作用，而另两种机制是细菌产生包括喹诺酮在内的多重耐药的主要机制。虽然到目前为止，对志贺菌属细菌耐喹诺酮类药物机制的研究，包括了临床分离耐药株和体外诱导耐药突变株，而且对各种机制的研究都有所涉及，但是对各种机制在志贺菌属细菌耐药形成中各自的地位与相互关系尚需进一步探明。为了解喹诺酮类各种耐药机制在志贺菌属细菌耐药形成中各自的地位、作用特点与相互关系，本研究以药物选择性——基因突变——耐药形成理论为出发点，采用人工诱导的方式，用氟喹诺酮类抗生素诺氟沙星对志贺菌敏感株进行体外诱导，使之逐步产生耐药性，通过测定诺氟沙星、四环素、氯霉素、氨苄青霉素对各代菌株的最低抑菌浓度检测耐药程度的变化及多重耐药性的获得，并对各代菌株的gyrA基因和parC基因进行N末端编码区的聚合酶链反应(PCR)扩增，运用PCR-SSCP对其突变性进行检测，对检测出的突变菌株进行核酸序列分析，以明确靶基因突变位点及方向，探讨耐药程度与突变位点之间的关系，为指导临床早期发现耐药菌株的存在，合理、有效地应用喹诺酮类抗生素，防止其耐药性进一步增加提供依据，同时也为喹诺酮类新药品种的开发提供一定依据。并用能量抑制剂碳酰氰间氯苯腙(Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)抑制主动外排作用，观察此过程中诺氟沙星对细菌最低抑菌浓度(MIC)的变化，探讨主动外排系统在志贺菌多重耐药中的作用及其与靶基因突变机制在志贺菌属细菌喹诺酮耐药形成中的关系，为菌痢的防治提供理论依据和对策。方法1．菌株的复苏与鉴定：对我教研室4℃冰箱中以半固体穿刺法保存的48株志贺菌在LB平板上划线复苏并重新进行生化及血清学鉴定，以保证菌株的可靠性。2．敏感野生株的筛选：采用Kirby-Bauer纸片法进行菌株对四环素、氯霉素、氨苄青霉素、萘啶酸、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星的药敏试验，以对以上抗菌药物均敏感的菌株为敏感野生株(wild type，WT)，从中选择一株作为实验诱导株。3．诱导方法：诺氟沙星浓度从1／4×MIC_0(诺氟沙星对诱导株原代的最低抑菌浓度)开始，以2倍递增，每一浓度诱导两代。当诺氟沙星浓度达到1μg／ml后，浓度以1μg／ml递增，直至诱导剂浓度大于或等于256×MIC_0。当诱导剂的浓度达到4、8、16、32μg／ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不继续诱导传代，先作4次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，以保证耐药菌株为非适应性耐药。4．抗菌药物最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration，MIC)测定：用琼脂稀释法测定抗菌药物诺氟沙星、四环素、氯霉素、氨苄青霉素对实验诱导株各代的最低抑菌浓度。5．喹诺酮类作用的靶基因gyrA和parC的单链构象多态性(PCR-SSCP)分析：PCR扩增各代菌株的gyrA和parC基因，扩增产物经限制性内切酶HinfⅠ消化，变性后经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据单链带数目和位置判断有无基因突变。6．突变菌株PCR产物的DNA测序。7．能量抑制剂CCCP对实验诱导多重耐药志贺菌主动外排作用的抑制：用于琼脂稀释法药敏试验的M-H培养基中加入能量抑制剂CCCP(10μg／ml)，测定诺氟沙星最低抑菌浓度MIC，观察各代菌株加入抑制剂前后对抗菌药物的MIC。结果1．菌株复苏与鉴定：共复苏菌株48株，其中江西铜鼓福氏志贺菌11株，郑州福氏志贺菌13株，郑州宋内志贺菌8株，郑州痢疾志贺菌3株，商丘睢县福氏志贺菌12株，宋内志贺菌1株。2．敏感野生株筛选：48株志贺菌中筛选出3株敏感野生株，N8、Z10、Z11，占菌株总数的6.25％。选择N8作为实验诱导株。3．诱导结果：共诱导传代74代，诺氟沙星终浓度达32μg／ml，诺氟沙星对诱导株的最低抑菌浓度由0.125μg／ml上升到128μg／ml，是原来的1024倍。同时其他叁种结构不同的抗生素TE、C、Am对其的最低抑菌浓度值也相应上升为原来的128、64、32倍，诱导菌株由敏感野生株逐步转变为多重耐药株。4．gyrA基因、parC基因PCR扩增：N8经诺氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp和469bp长度的片段，分别是gyrA和parC基因的扩增产物。5．gyrA基因、parC基因的单链构象多态性(PCR-SSCP)分析：对各代菌株研究，发现gyrA基因和parC基因分别呈现叁种单链构象图谱，gyrA基因的突变可能发生在第12代和第55代，parC基因的突变可能发生在第21代和52代。6．突变菌株PCR产物的核酸序列分析：与N8原代的序列比较，gyrA基因在第12代即发生编码第87位氨基酸的单个碱基突变(GAC→TAC)，在第55代发生了编码第221位氨基酸的碱基突变(GGA→GCA)；parC基因在第21代发生编码第80位氨基酸的碱基改变(AGC→AGA)，在第52代又有编码第84位氨基酸的碱基改变(GAA→GCA)。7．CCCP对受试菌MIC的影响：加入能量抑制剂CCCP后，敏感菌与耐药菌的MIC均有不同程度的降低。结论1．本研究从基因突变时序和耐药程度的变化直接证实压力环境与细菌形成耐药的关系，为药物选择性——基因突变——耐药形成理论提供直接的科学依据。2．GyrA可能是喹诺酮类药物作用的第一靶位，ParC可能是第二靶位。耐喹诺酮类药物程度不同的菌株，其靶基因突变数量、涉及靶酶范围不同。耐药株靶基因突变存在多态性。3．诱导株多重耐药性的产生可能是由于激活了它的包括AcrAB在内的主动外排系统。主动外排机制和靶基因突变共同存在导致志贺菌属细菌耐喹诺酮类药物。
朱静媛[2]2002年在《志贺菌属细菌耐药性及其耐喹诺酮类药物机制的研究》文中认为志贺菌属细菌是细菌性痢疾(简称菌痢)的病原体。菌痢在全世界年病例数超过2亿，年死亡人数约60万人，其中2／3是儿童。在我国菌痢至今仍是影响人民健康的主要肠道传染病之一。志贺菌属细菌的耐药性历来为人们所重视，60年代以来志贺菌属细菌对四环素等多种传统抗生素普遍耐药，80年代以来又对喹诺酮类药物敏感性降低，喹诺酮类药物治疗急性细菌性痢疾疗效下降明显。鉴于菌痢在肠道传染病防治工作中的重要地位及喹诺酮类药物目前在临床治疗感染性腹泻的重要性，研究志贺菌属细菌的耐药性，尤其对喹诺酮类药物的可能机制显得十分必要。研究发现：志贺菌属细菌DNA旋转酶A亚单位基因(DNA gyrase A subunit，gyrA)突变与其对喹诺酮类药物耐药有关；拓扑异构酶ⅣC亚单位基因(topoisomerase Ⅳ C subunit，parC)突变曾在实验室诱导耐药株中获得，未在临床耐药株中证实；另外主动流出机制也可参与志贺菌属细菌对喹诺酮类药物耐药的形成。本研究目的即了解志贺菌属细菌的耐药状况、其耐喹诺酮类药物菌株中gyrA基因、parC基因突变情况，进而分析志贺菌属细菌的耐药特点、靶基因突变特点及二者之间关系，以期为志贺菌属细菌耐药性的防治及喹诺酮类药物的正确应用提供参考郊州大学公共卫生学院2002届硕士毕业沦文 志贺菌属细菌耐药仕及其耐喳诺酮类药物机制的研究依据。 方法临床分离的志贺菌属菌株共73例，其中福氏志贺菌54例、宋内志贺菌15例、痢疾志贺菌4例；来自江西铜鼓县的临床分离株共3O例（均为福氏志贺菌），来自郑州的临床分离株共43例（包括 24例福氏志贺菌、15例宋内志贺菌和 4例痢疾志贺菌人采用改良Kirby丑 纸片法进行包括4种喳诺酮类药物在内的门种抗生素的药敏试验；4种嘻诺酮类药物包括毗腑酸 （PIPemidic adcid，PI）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、诺氟沙星（Norfloxacin，NOR）禾环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）。另7 才 抗生素是四环素（Teracycline，TE）、氯霉素 （ChloramPhenicol，C）、链霉素（Streptomycin，S）、磺胺甲基异恶哇（Sulfamethoxazole，SMX）、氨芋西林（Ampicillin，Am ）．庆大霉素（Gentamicin，GM）和头抱唾吩（Cephalothin，CF）。对73例志贺菌属细菌DNA旋转酶的gyrA基因、拓扑异构酶IV的 ParC基因的哇诺酮类药物耐药决定区…uinolone十esistancedetermining region，QmR）进行 N末端编码区的聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增、卜制性片段长度多态性（restriction fragment length polymofphism，RFLP）分析、单链构象多态性（single strand conformatlon polymorphism，SSCP）分析及部分菌株的核酸序列分析。PCR－yLP分析是根据PCR产物酶切片段的变化，判断PCR扩增区间DNA上有无新酶切位点的产生或原有切点的消失，从而判断有无基因突变的一种方法。PCR七SCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酚胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。和核酸序列分析一样，它们都是基因诊断研究的有力工具。 二 郑州大学公共卫生学院2002届硕士毕业论文 志贺菌属细菌耐药性及其耐喳诺酮类药物机制的研究 结果1．福氏志贺菌对传统抗生素TE、C、S、SMX、Am 耐药率在 70．8％刁％之间，对 CF耐药率为 36．7％；宋内志贺 菌对传统抗生素TE、S、SMX的耐药率在53．3％66刀％之间， 对Am、CF的耐药率为26．7％、13．3％。2．PI、CIP、NOR。 OFL耐药率分别为79．5％、60．3％、41．l％、36．9％；PI与CIP。 CIP与NOR耐药率差异有显着性p值均小于0刀5人3．江西 铜鼓福氏志贺菌多重耐药率100％，郑州福氏志贺菌多重耐药率 79．2％，郑州宋内志贺菌多重耐药率40％，差异有显着性u值 均小于0刀5人4．江西铜鼓福氏志贺菌4耐率（耐4种嘻诺酮类 药物菌株占喳诺酮类药物非敏感菌株中的比例）为60％，郑州志 贺菌属细菌4耐率为21．9％，差异有显着性仟1刀5卜5．首次 在临床分离的耐喳诺酮类药物福氏志贺菌中发现parC基因突 变；序列分析证实耐药福氏志贺菌626存在parC基因5个碱基 点突变导致编码氨基酸改变如下：丝氨酸门CC）刁29一丙氨酸 （GCC入亮氨酸（CTG）l～颗氨酸（GTG人丝氨酸（AGC） l 一甘氨酸（GGC人 丙氨酸（GCT）J41一濒氨酸（GTC人 亮氨酸（TTG）刁 一甲硫氨酸（ATG人 6．靶基因 默rA及 parC）在喳诺酮类药物非敏株中总突变率达97％，其中gyrA基 因突变率达92．5％，parC基因突变率达7．5％。7．耐哇诺酮 类药物程度不同，靶基因突变数量、涉及靶酶范围不同：耐药株 ZS对＊、CIP耐药，对NOR、OFL中度敏感，测序分析发现存 在gyrA基因编码87位氨基酸的碱基突
侯瑞娟[3]2012年在《志贺菌属细菌耐药相关质粒的耐药性研究》文中认为细菌耐药,是指细菌能在杀死它们或削弱它们的药物中获得生存的本能。细菌耐药性的来源有两个途径,即自身基因突变和耐药基因的获得。外源性耐药基因的获取,是细菌耐药性广泛散播的主要原因,一般通过可移动遗传元件完成,如质粒、转座子、整合子、插入序列共同区(ISCR)等。质粒是一种独立的、可自我复制的遗传元件,自身可携带耐药基因,亦可作为其他可移动遗传元件的载体,介导菌株间基因水平转移,在耐药基因的扩散过程中扮演着关键角色。因此研究质粒DNA的结构,分析质粒所携带的功能基因及质粒与细菌耐药性的关系,对细菌耐药分子机制的深入研究具有重要意义。为了系统研究基因的水平转移,本课题组已选用对抗生素敏感的一株福氏志贺菌Z23作为受体菌,以临床分离的耐多药大肠杆菌E667为供体菌,通过接合转移实验构建了多重耐药转移菌株ZT,并通过抑制性消减杂交实验筛选出一部分序列,斑点杂交试验结果表明这些序列在供体菌及转移菌株的质粒上均存在,克隆转化实验发现这些序列与细菌耐药有关(故之后称这些序列为耐药相关序列)。但是含有这些耐药相关序列的质粒是否为耐药质粒,是否为接合质粒,介导供体菌和受体菌之间耐药性的传递,仍需进一步验证。故本课题将通过转化实验获得含有该质粒的转化子,分析该质粒与耐药性的关系,对该质粒上的耐药基因进行筛选,检测该质粒上所存在的与耐药相关的可移动遗传元件,以探索该质粒在耐药过程中所起的作用及其耐药机制,为更全面的了解质粒所介导的耐药分子机制提供基础资料。方法1阳性克隆的获得：通过改进分子克隆上面的质粒转化实验方法,降低预培养转速、预培养温度及延长预培养时间,将实验室储存的志贺菌属细菌质粒(该质粒来源于通过接合转移实验获得的耐多药的志贺菌属转移株ZT,供体菌为临床分离的耐多药的大肠杆菌E667,受体菌为敏感的福氏志贺菌Z23)转入感受态大肠杆菌DH-5α中,分别涂布在含单一抗生素的培养基上,抗生素包括头孢噻吩(CF)、磺胺甲恶唑(SMZ)、诺氟沙星(NOR)、庆大霉素(GM),浓度分别为最小抑菌浓度(MIC)、1/2最小抑菌浓度(1/2MIC),过夜培养18h-24h后,挑取板上的单克隆,进行菌落PCR扩增耐药相关序列T2G6(本课题组前期研究筛选的位于质粒上的耐药相关序列之一),以筛选阳性克隆。2质粒提取：将阳性克隆挑至含NOR的LB液体培养基中,过夜培养,通过离心收集菌体,进而使用Axygen生物公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒,然后在O.5%的琼脂糖凝胶上与原质粒进行电泳比对。3药物敏感试验：以纸片法抗菌药敏试验标准及美国国立临床实验室标准委员会(NCCLS)指南为参照,采用Kin-Bauer:纸片琼脂扩散法进行药敏鉴定,抗生素药敏纸片包括：头孢噻吩(CF)、头孢唑啉(CFZ)、头孢呋辛钠(CXM)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶／克拉维酸(CAZL)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTXL)、头孢唑肟(ZOX)、头孢哌酮(CFP)、氨曲南(AZT)、磺胺甲恶唑(SMZ)、甲氧苄啶(TMP)、诺氟沙星(NOR)、阿莫西林(AMX)、氨苄西林(AMP)、氯霉素(CHL)、四环素(TET)、链霉素(STR)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IPM)等。所用质控菌株为大肠杆菌ATCC25922.4耐药基因筛选：根据药敏结果参考相关文献设计引物筛选质粒上可能存在的耐药相关基因：喹诺酮类耐药相关基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qurS、 qepA、aac(6')-Ib-cr,头孢菌素类耐药相关基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、 Ampc,磺胺耐药基因sull及氯霉素乙酰转移酶基因cat等的引物,PCR相关基因,并将获得的PCR产物送至生物公司测序鉴定,经BLAST比对后对基因进行确认。5耐药相关的可移动遗传元件的筛选：参考相关文献设计引物筛选质粒上可能存在的可移动遗传元件相关基因,包括插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCR1;整合酶基因intl1、intI2及intI3;接合质粒遗传标记traA、trbC。PCR相关基因,并将获得的PCR产物送至生物公司测序鉴定,经BLAST比对后对基因进行确认。结果1质粒鉴定：通过对抗生素培养板上的单克隆进行菌落PCR耐药相关序列T2G6,在含NOR(1/2MIC)I的LB固体培养基上获得阳性克隆；质粒凝胶电泳比对结果显示转化子质粒即为所转化的志贺菌属细菌质粒。2药敏鉴定：感受态大肠杆菌对所有的抗生素敏感,转化子对CAZ、AZT耐药,对CTX、ZOX中介耐药,对其他抗生素则敏感。转化子与感受态大肠杆菌相比：CTX、CFP、ZOX、FEP、NOR、CIP、LVF、SMZ、TMP、CHL的抑菌环直径减小5mm以上；CFZ、CXM、AMP、AMX、GM、STR、TET、IPM抑菌环直径的变化在5mm内。ESBLs确证实验表明该转化子为非产ESBLs菌株。3耐药基因的筛选：该质粒上存在耐药基因TEM-116、sull及cat,未检测到喹诺酮类抗生素耐药相关基因。4耐药相关可移动遗传元件的筛选：1类整合子酶基因检测阳性：接合质粒遗传标记trbC筛选阳性：未检测到插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCRl的存在结论1该质粒为广宿主接合质粒,可介导大肠杆菌与志贺菌属细菌间耐药性的传递。2该质粒为多重耐药质粒,可介导细菌对头孢类抗生素及单环内酰类抗生素耐药；与喹诺酮类抗生素、氯霉素、磺胺类等抗生素耐药性的产生有关。3该质粒上所含有的耐药基因及耐药相关的可移动元件不能完全解释其耐药表型,其作用机制有待深入研究。
朱静媛, 段广才, 郗园林[4]2004年在《志贺菌对喹诺酮类药物耐药分子机制的研究》文中提出目的 研究志贺菌对喹诺酮类药物耐药性及其耐药基因gyrA和parC的变异。方法对73株临床分离的志贺菌及标准株51573进行吡哌酸(PI)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)4种药物的药敏试验,对其DNA旋转酶gyrA基因、拓扑异构酶ⅣparC基因N末端编码区分别进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,对grA基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,对parC基因进行RFLP及单链构象多态性(SSCP)分析。结果 标准株51573对4种喹诺酮类药物均敏感;73株临床分离的志贺菌属细菌对PI、CIP、NOR、OFL的耐药率分别为79.5％、60.3％、41.1％和36.9％;67株(91.8％)菌株对喹诺酮类药物敏感性降低,其中gyrA基因突变率为91％,parC基因突变率为7.5％,6株临床敏感株及标准株51573均未检测出以上两基因突变。结论 志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重;靶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一,以DNA旋转酶gyrA基因突变为主,拓扑异构酶ⅣparC基因突变次之。
王小妮[5]2011年在《志贺菌属产ESBLs基因型检测及ERIC-PCR分析特征》文中提出目的：志贺菌属引起的细菌性痢疾是最常见的急性感染性腹泻之一,随着全球超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum beta-lactmases,ESBLs)的广泛传播及抗生素的选择压力,志贺菌产ESBLs也逐渐增多。为了解本地区志贺菌ESBLs特征及产ESBLs株流行特征,本课题选取天津地区叁家叁级甲等医院志贺菌属分离株作为研究对象,研究志贺菌属血清学分群变化和耐药变化特征；分析产ESBLs株志贺菌属的耐药特征、可传递耐药质粒及主要流行基因型；调查天津地区志贺菌分离株分子流行病学情况,以便正确掌握细菌耐药的发展趋势及提供临床解读。方法：收集2009年6月至2010年9月天津市叁所叁级甲等医院肠道门诊分离的136株志贺菌作为受试菌,鉴定不同血清学类型,明确优势血清分群,采用K-B法对所有菌株进行药敏试验,并分别比较不同血清群之间志贺菌及不同年龄组菌群对多种不同抗菌药物的耐药率；采用ESBLs初筛及纸片确证实验检测产ESBLs菌株,并分析产酶菌的耐药情况；采用叁维试验检测产AmpC酶菌株；进行质粒接合试验以了解可转移耐药质粒携带情况,并比较供体菌及接合株的药敏情况；对产ESBLs阳性菌株用PCR方法扩增相关耐药基因以确定其基因型；根据实验结果,抽取阳性PCR产物若干个进行测序,测序结果在genbank上进行同源性比对。以肠杆菌科基因间的重复序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR, ERIC-PCR)方法对收集的产ESBLs志贺菌进行流行病学分析。结果：1.从136株分离菌中血清学鉴定出99株宋内志贺菌、34株福氏志贺菌、2株鲍氏志贺菌及1株痢疾志贺菌。天津地区细菌性痢疾的病原菌以宋内志贺菌为主。药敏结果显示：福氏志贺菌与宋内志贺菌均对亚胺培南100%敏感,对氨苄西林、哌拉西林、四环素、链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药率均高于75%,对喹诺酮类(诺氟沙星、左氧氟沙星)耐药率不足3%。这两组血清群对部分药物的耐药性有统计学差异(P<0.05),福氏志贺菌对叁、四代头孢类(头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟)、氨曲南、氯霉素的耐药率明显高于宋内志贺菌,两者对其余药物(头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星)不同血清分群间耐药率无差异。不同年龄组人群的志贺菌在相同血清学分群下对多种抗菌药物的耐药率一致。2.纸片确证试验产ESBLs菌株共20株,总检出率为14.7%,叁维试验未发现产AmpC酶志贺菌。PCR扩增结果显示20株产ESBLs菌株中,11株产TEM-1型β-内酰胺酶,16株产CTX-M-14亚型ESBLs,4株产CTX-M-15亚型ESBLs,未检测到SHV、CTX-M-2组、CTX-M-8组、OXA组β-内酰胺酶。CTX-M型ESBLs累计检出率100%。产ESBLs菌株对传统抗生素：甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、链霉素、四环素显着耐药(70-90%)；对庆大霉素与氯霉素耐药率在30%-50%；对第四代头孢菌素中头孢吡肟、阿米卡星、喹诺酮类(诺氟沙星与左氧氟沙星)耐药率低,不足30%；对亚胺培南100%敏感。质粒接合试验获得16株接合株,药敏显示接合株对β内酰胺类抗生素呈现不同程度的耐药,对氨基糖苷类部分耐药。产CTX-M型ESBL菌株的传播机制以质粒介导为主。质粒提取图谱显示：转接合子多数只携带一个被转移的天然质粒。ERIC-PCR分型显示,以质粒介导的CTX-M-14亚组酶在本地有聚集和流行趋势。结论：136株志贺菌中血清学鉴定以宋内志贺菌为主,志贺菌不同血清分群之间的耐药性有一定差别；不同年龄组人群收集的志贺菌在相同血清学分群下的的耐药率一致。天津地区志贺菌产ESBLs菌株总检出率为14.7%,主要基因型以CTX-M型为主,产ESBLs是β-内酰胺类抗菌药物耐药主要原因,耐药传播机制以质粒介导为主。天津地区志贺菌产ESBLs以CTX-M-14亚型为主。
王春新, 谢国强, 赵琪[6]2005年在《儿童细菌性痢疾志贺菌属的血清型分布及耐药性分析》文中提出目的调查引起儿童细菌性痢疾的志贺菌属的血清型分布及其耐药性,指导临床合理用药。方法对2000年6月～2003年10月门诊及住院患儿大便培养分离所得359株志贺菌进行血清学分型和抗生素敏感试验。结果儿童细菌性痢疾福氏志贺菌感染占71.0%,宋氏志贺菌感染占29.0%;总耐药率为27.0%,其中福氏为31.4%,宋氏为16.2%。志贺菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、诺氟沙星、复方新诺明耐药严重。结论福氏志贺菌是儿童痢疾主要的血清型,临床治疗宜根据药敏结果用药。
陈洁, 朱国献, 金巧菲, 岑立冲, 赵立夫[7]2007年在《杭州地区细菌性痢疾菌谱分布及耐药性调查》文中研究指明目的调查1996-2005年杭州地区细菌性痢疾菌谱分布及其耐药情况,为临床合理用药提供依据。方法分析1 332株志贺菌属的菌型及对18种抗菌药物的耐药情况。结果检出弗氏志贺菌最高为1 235株,宋内志贺菌次之为97株;志贺菌属对氨苄西林、复方新诺明、氯霉素、诺氟沙星耐药严重,氨基糖苷类抗菌药物及喹诺酮类抗菌药物的耐药率较低,出现对第叁代头孢类抗菌药物耐药及多重耐药现象,多重耐药的比例从1996年的6.0%上升到2005年的65.0%(P<0.01,χ2=6.14)。结论弗氏志贺菌是杭州地区优势菌,为减少耐药及多重耐药现象,临床治疗宜合理使用抗菌药物。
李光庭, 林湛, 柯水源, 冯家伍[8]2007年在《医院感染性腹泻菌群及耐药性变迁的研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨2004年~2006年医院感染性腹泻菌群及耐药性变迁,为临床合理用药提供依据。方法:回顾性分析门诊及住院的腹泻患者大便标本培养阳性及药敏试验的临床资料。结果:共检测出病原菌184株,分离率38.1%,排在前叁位的分别是志贺菌(35.9%)、埃希大肠杆菌(17.4%)、绿脓杆菌(13.6%)。耐药性检测结果显示致病菌对多种抗生素均耐药。结论:肠道病原菌菌型变迁及其耐药性监测很重要,对抗菌药的选用有着重要的意义。
朱静媛[9]2010年在《志贺菌属细菌整合子与多重耐药性研究》文中认为志贺菌属(Shigella)是感染性腹泻的重要病原,它引起的细菌性痢疾(菌痢)发病率在我国居传染病发病率的前叁位,是我国传染病防治工作的重点。抗生素应用于临床治疗菌痢历史已久,不仅可以减轻病情、缩短病程,还能减少病人排菌,避免进一步传播。然而随着抗生素的广泛使用,临床频繁出现耐药志贺菌属菌株,而且呈现为多重耐药(multi-drug resistance, MDR)。多重耐药志贺菌引起的感染不仅在发展中国家,在发达国家也成为影响临床治疗的关键因素。多重耐药志贺菌属不仅给细菌性痢疾的防治带来新的挑战,对细菌耐药性的传播也产生重要影响。因此,志贺菌属细菌的多重耐药问题和耐药机制引起了人们的广泛关注。志贺菌属获得某种抗生素抗性主要通过两种机制,一是细菌自身染色体基因发生突变,如抗生素靶位点的突变、调控基因突变引起膜蛋白表达的异常或主动流出泵系统的激活等,使细菌对抗生素从敏感变成抗性；另一机制则是细菌从外部获得耐药基因,即耐药基因的水平转移,这是目前人们认为临床多重耐药株产生的主要原因。许多可移动基因单元如质粒、转座子等,携带抗生素耐药基因,使得耐药基因在细菌属、种、株间传播,加快了耐药菌株的形成。近年发现整合子系统参与耐药基因的传播。整合子包括整合酶、基因盒和特异性重组位点,整合酶可以不断地从周围环境捕获耐药基因盒或从整合子上切除基因盒。整合子作为一种遗传元件,它自己不能自由移动,但它可以位于质粒、转座子或者染色体上,通过其他可移动元件,整合子促进了耐药基因的扩散,自身的广泛分布与肠道菌多重耐药性的形成有关。研究表明,含有整合子的细菌菌株比不含有整合子的菌株更多的显示出对不同抗生素的耐药性,整合子—基因盒系统与志贺菌属多重耐药性有关。国内外对志贺菌属整合子的研究发现多重耐药志贺菌携带2类整合子多见,而1类整合子检出率相对较低。对于耐药基因盒类型而言,在志贺菌属中发现的类型相对较单一。不论整合子的类型还是携带耐药基因盒的种类,都与志贺菌属菌株的多重耐药表型没有一一对应关系。因此,探索整合子-耐药基因盒系统与志贺菌属多重耐药的关系、评价其在志贺菌属细菌多重耐药机制中的作用和地位是十分必要的。本研究对临床分离的83株福氏志贺菌和7株宋内志贺菌进行抗生素敏感性测定,比较不同类型整合子及耐药基因盒在志贺菌属的分布、构成差异,并对典型整合子-耐药基因盒系统进行克隆和功能分析,以期了解整合子-耐药基因盒系统与志贺菌属多重耐药性之间的关系、正确评价整合子-耐药基因盒系统在志贺菌属多重耐药机制中的作用和地位。方法1药敏实验用纸片扩散法(disc diffusion test)测定所有菌株对以下抗生素药敏纸片的抑菌环：氨苄青霉素(AMP)、四环素(TET)、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(SXT)、氯霉素(CHL)、萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GEN)和头孢唑林(CFZ)。采用琼脂稀释法测定以下抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration, MIC):TET、AMP、CHL、CIP、链霉素(STR)、甲氧苄啶(TMP)和磺胺异恶唑(SSS)。2 PCR方法检测整合子的整合酶基因PCR-RFLP分析整合子的可变区基因分别针对1、2、3类整合子的整合酶基因设计引物,煮沸法提取菌株总DNA进行PCR扩增检测整合酶基因。用试剂盒分别提取菌株的基因组DNA和质粒DNA,分别用针对典型1类整合子的可变区引物hep58-hep59.针对非典型1类整合子的可变区引物hep58-ISVR、针对2类整合子的可变区引物hep74-hep51,进行整合子的可变区基因PCR扩增检测。选用合适的限制性内切酶,对得到相同长度大小的PCR产物进行RFLP (restrictive fragment length polimorphism)分析,得到相同内切酶图谱的片段被认为是序列相同的片段。3 Southern杂交按Roche公司地高辛标记和检测试剂盒(Dig DNA Labeling and Dection)的操作说明书进行操作。首先将整合酶基因intI 1和intI 2的PCR产物经凝胶回收纯化后定量,用随机引物法获得地高辛标记探针。将提取的细菌基因组DNA分用BamHI、PstI双酶切,将酶切产物和质粒DNA分别进行0.8%琼脂糖凝胶电泳。用毛细管虹吸法将琼脂糖凝胶中的DNA转移至尼龙膜,120℃烤箱干烤0.5h,将DNA固定于尼龙膜。经过预杂交、探针杂交、洗膜、避光显色等步骤,照相记录结果。4质粒接合传递实验以E. coli DH5a空菌为受体,以90株志贺菌为供体分别进行。分别挑取纯化的供体菌、受体菌单个菌落用LB液体培养基37℃振荡培养过夜,10倍稀释入2 ml新鲜的LB液体培养基,连续37℃振荡培养1-3 h使得OD600值约为0.6左右。吸取供体菌、受体菌各100μl于1 ml的新鲜LB液体培养基中,于37℃静止培养16-18h,划线接种于麦康凯固体培养基平板,37℃恒温培养箱内培养16-18h。观察菌落形态,在无色半透明菌落中夹杂的红色菌落即为接合子,挑取单一的红色菌落接种LB液体培养基,37℃振荡培养过夜。再次划线接种麦康凯固体培养基平板,37℃恒温培养箱内培养16-18h后观察形态以再次确认。提取质粒DNA,进行琼脂糖水平凝胶电泳检测。对获得确认的接合子进行纸片法药敏试验。5整合子-耐药盒基因的序列测定和系统发生分析针对典型1类整合子整合酶和可变区整个区域、非典型1类整合子的可变区区域、2类整合子整合酶和可变区整个区域分别进行PCR扩增,PCR产物测序后采用Blastn软件检索Genbank数据库,进行序列的同源性比较和分析。从所有识别度在99%-100%的序列中,选取来自不同菌纲、菌目和菌属的多个序列,用ClustalX软件对核苷酸序列进行多重序列比较,用MEGA 4.1软件作系统进化树分析。构建方法分别选择基于距离的邻近法(neighbor joining, NJ)和最大简约法(maximum parsimony, MP)。两种方法均选择了Bootstrap法进行进化树的验证分析。6整合子-耐药盒基因的克隆及克隆子的功能分析选择典型菌株,用PCR方法分别扩增位于可接合传递质粒上的典型1类整合子耐药基因盒基因pvl、位于基因组DNA上的2类整合子耐药基因盒基因pv2和整个2类整合子基因intI2pv2,分别将它们与克隆载体puc18连接,转化大肠杆菌DH5a,提取质粒酶切并进行特异PCR鉴定阳性克隆子。分别检测阳性克隆puc-pv1和puc-pv2对抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration, MIC)。分别用阳性克隆puc-intI2pv2和DH5a空菌作为受体菌,与供体菌志贺菌05100进行质粒接合传递实验,比较耐药性传递情况。7多重耐药志贺菌的无抗生素压力连续传代实验对耐药谱不同的、携带整合子不同的10株福氏志贺菌,进行无抗生素的多次传代培养。将所选菌株挑单个菌落经LB肉汤过夜增菌后,1：100倍LB肉汤稀释,继续37℃,200rpm振荡培养3-4h,至OD600值约为0.08-0.12之间后,继续1：100倍LB肉汤稀释37℃,200rpm振荡培养3-4h后,再次继续1：100倍LB肉汤稀释37℃,200rpm振荡过夜培养。如此1日3次,连续培养10日。在此期间,每隔5次传代就进行菌株的分离,并进行MIC的药敏实验和整合子的PCR检测。结果1志贺菌属耐药性和整合子分布的检测90株志贺菌(83株福氏志贺菌,7株宋内志贺菌)对TET、NAL、AMP、SXT和CHL的耐药率较高,分别为93.3%、92.2%、91.1%、82.2%和75.6%；多重耐药率达95.6%(86/90),最常见的耐药谱为AMP-TET-SXT-CHL-NAL(31/90,34.4%)。整合酶基因阳性率为87.8%(79/90),其中intI1单独阳性率3.3%；intI2单独阳性率10%；intI1和intI2同时阳性率为74.4%,3类整合子整合酶基因未检出。多重耐药菌的整合酶阳性率89.5%(77/86)。intI2阳性率在多重耐药株和非多重耐药株中分布差异有统计学意义(p<0.05)。2志贺菌属中整合子-耐药基因盒的特征分析共发现4种整合子耐药基因盒,序列提交Genbank获得登录号分别为FJ895301、FJ895302、GQ214137和EF634237。56株多重耐药志贺菌同时携带3种整合子-耐药基因盒系统：位于可接合传递质粒上的典型1类整合子耐药基因盒dfrA17-aadA5或dfrA12-orfF-adA2、位于染色体DNA上的非典型1类整合子耐药基因盒blaoxa-30-aadA1和位于染色体DNA上的2类整合子耐药基因盒dfrA1-sat1-aadA1非典型1类整合子耐药基因盒laoxa-3o-aadAl在对AMP-TET-CHL联合耐药菌中的阳性率高于非联合耐药菌,差异有统计学意义(p<0.05)3志贺菌属整合子-耐药基因盒的序列测定和系统发生分析序列分析和系统发生分析发现,除整合酶基因intll和非典型1类整合子耐药基因盒blaoxa-30-aadA1外,1类整合子耐药基因盒dfra17-aadA5、dfaA12-orf-aadA2以及2类整合子整合酶intI2基因、耐药基因盒dfrAl-satl-aadAl都存在基因分化现象。4志贺菌属整合子-耐药基因盒的克隆及克隆子功能分析1类整合子耐药基因盒dfrA17-aadA5阳性克隆使DH5a对STR的MIC从0.5μg/ml提高至4μg/ml,对TMP的MIC从2μg/ml提高至64μg/ml。2类整合子耐药基因盒dfrA1-Sat1-aadA1阳性克隆使DH5a对STR的MIC从0.5μghn1提高至32μg/ml,对TMP的MIC从2μg/ml提高至64pg/ml。通过质粒接合传递实验,来自志贺菌05100含有1类整合子耐药基因盒dfrA17-aadA5的质粒未对受体菌DH5a的抗生素敏感性产生影响,而来自志贺菌06208含有1类整合子耐药基因盒dfrA12-orf-aandA2的质粒使得受体菌DH5a获得对SXT和AMP的耐药性。对于相同供体菌福氏志贺菌05100而言,含有2类整合子克隆的大肠杆菌,与大肠杆菌空菌一样,经质粒接合传递后,多种抗生素的MIC并无变化。5多重耐药志贺菌的无抗生素压力连续传代实验无抗生素压力的连续30次传代实验发现：志贺菌05015、05105、06208分别丢失了对CHL、SXT和CIP的单一耐药性,其整合子-耐药基因盒系统无变化；志贺菌06218丢失了原有的全部耐药性(TXT.SXT和AMP),同时其仅有的位于基因组上的2类整合子-耐药基因盒系统,即intl2基因以及耐药基因盒dfrA1-Snt1-aadA1,也发生了丢失。结论1.志贺菌属细菌对常用抗生素普遍耐药,多重耐药现象严重(95.6%)。intl2基因阳性与志贺菌属多重耐药有关；非典型1类整合子耐药基因盒blaoxa-30-aadA1阳性与志贺菌属AMP-TET-CHL联合耐药有关。2.首次报道多重耐药志贺菌可同时携带3种不同整合子-耐药基因盒：位于可接合传递质粒上的典型1类整合子、位于染色体上的非典型1类整合子和2类整合子。3.来自不同菌属的整合酶基因和耐药基因盒在系统发生方面存在不同程度的分化。4.志贺菌属整合子携带的耐药基因盒仅针对特定抗生素产生特异性耐药,不同耐药基因盒致耐药程度不一。5.志贺菌属含整合子的质粒可接合传递与整合子无关的其他抗生素耐药性。6.志贺菌属2类整合子-耐药基因盒系统可能通过参与其他基因元件的移动和活动,来参与多个耐药基因结构的聚集或切除,从而与志贺菌属的多重耐药表型之间产生复杂的间接关联。
陈洁[10]2010年在《杭州部分地区肠道致病菌的分布及耐药状况》文中认为研究目的：感染性腹泻是对全世界人民健康的一大威胁。在世界大部分地区,感染性腹泻仍是重要的医学难题之一。由于各地区感染性腹泻病原菌的组成及耐药状况有差异,并且可靠有效的疫苗尚在研制中,故监测本地区感染性腹泻病原菌的组成及耐药状况,为当地的感染性腹泻的流行病学研究、疫苗制备及临床合理使用抗生素提供理论依据显得尤为重要。本课题的研究目的是监测杭州部分地区感染性腹泻病原菌的组成及耐药状况,为本地区感染性腹泻的流行病学研究、疫苗制备及临床合理应用抗生素提供参考资料。研究方法通过对2007～2009年杭州市第六人民医院门诊或住院的786例腹泻患者(包括来自其他综合性医院的确诊或疑诊病例)的大便做常规培养,通过志贺菌及沙门菌(SS)琼脂、庆大霉素琼脂、麦康凯琼脂、TCBS琼脂以及伊红-美兰培养基,筛选出病原菌254株后经生化及血清学进一步鉴定到种、群或血清型,并以纸片扩散法测定病原菌对抗菌药物的敏感性。研究结果：1.年龄分布特点：检出病原菌的腹泻患者各年龄段均有,但以儿童和青少年为主。不同年龄组腹泻病原菌的优势菌存在差异,年龄小于10岁组以志贺菌属较为常见。0-10岁组和11-20岁组差异有显着性(P<0.005,x2=74.409)。2.季节分布特点：季节分布主要在夏秋季,7-10月为发病的高峰,占全年的62.60%。3.致病菌的组成及耐药情况：本地区细菌性腹泻的主要致病菌是志贺菌(61.81%),其中以B群(福氏)志贺菌为主(63.06%),其次是D群(宋内)志贺菌(35.67%),C群(鲍氏)志贺菌(1.27%),未发现A群(痢疾)志贺菌。B群(福氏)志贺菌包括13种血清型,以F2a最多为59株(59.60%),其次F4b为13株(13.13%),紧随其后的是F4a和F1a,分别为9株(9.09%)和5株(5.05.1%)。沙门菌属亦占相当数量(25.20%),包括16个菌种(血清型),弧菌属居第叁位(9.06%),包括副溶血弧菌9株,O1群霍乱弧菌小川型12株,O139群霍乱弧菌2株。大肠埃希菌及单胞菌属较少见,分别占2.76%及1.18%。4.不同菌种对各种抗生素耐药情况有所不同。志贺菌属对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、磷霉素、头孢噻肟、头孢曲松及头孢吡肟敏感性较好；沙门菌属对磷霉素、庆大霉素、头孢吡肟、头孢哌酮／舒巴坦及氧氟沙星敏感性较好；弧菌属对上述抗菌药物敏感性均较好。3株大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、亚胺培南等耐药率较高,但对氨基糖苷类(如庆大霉素、阿米卡星)及喹诺酮类(如诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星)全部敏感；1株气单胞菌对上述药物均敏感。研究结论：1.有年龄、季节的分布特点。腹泻患者以儿童和青少年为主。主要在夏秋季,7-10月为发病的高峰。故在高发季节,应对这些人群加强卫生宣教和预防。2.病原菌种类多,各菌属、菌种的耐药性不同。主要致病菌是志贺菌,其中主要是B群(福氏)志贺菌为主,其次是D群(宋内)志贺菌,C群(鲍氏)志贺菌,未发现A群(痢疾)志贺菌。B群(福氏)志贺菌包括13种血清型,以F2a最多。沙门菌属亦占相当数量,包括16个菌种(血清型),弧菌属居第叁位,包括副溶血弧菌,O1群霍乱弧菌小川型,O139群霍乱弧菌。大肠埃希菌及单胞菌属较少见。各菌属、菌种的耐药性不同。故不仅要加强对常见的志贺菌属、沙门菌属和弧菌属监测,也应重视对其他菌属、菌种的监测,尽可能地分离鉴定。为本地区腹泻病原菌的流行病学监测、疫苗制备及临床合理用药提供依据。
参考文献：
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[10]. 杭州部分地区肠道致病菌的分布及耐药状况[D]. 陈洁. 浙江大学. 2010
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