关健, 陈杰, 罗玉凤, 高洁[1]2002年在《反义bcl-2和反义survivin对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生长的作用》文中认为目的 研究反义bcl 2和反义survivin(svv)对人神经母细胞瘤 (NB)细胞系SK N MC细胞生长的作用。方法 利用基因重组技术 ,采用定向克隆构建在真核细胞中能够稳定表达反义bcl 2或反义svv的逆转录病毒载体PBabepuro Asbcl 2和PBabepuro Assvv ,并分别经脂质体LipofectamineTM介导转染人NB细胞株SK N MC细胞 ,经嘌呤霉素 (2 .0 μg/ml)筛选得到抗性克隆 ,同时以空载体Pbabepuro转染SK N MC作为对照 ;以免疫组化和Western印迹分析反义bcl 2、反义svv对细胞内源性Bcl 2、SVV蛋白质的表达抑制作用 ,应用MTT法研究细胞 (5× 10 3 /孔 )的生长和增殖情况 ,并接种于裸鼠 (3只 /组 ) ,观察 10 7个细胞在 6周时的成瘤情况 ,以研究反义bcl 2、反义svv对SK N MC细胞生长的作用。结果 反义bcl 2转染后的细胞SK N MC/PBabepuro Asbcl 2中的Bcl 2表达明显降低 ,反义svv转染后的细胞SK N MC/PBabepuro Assvv中的SVV表达也明显降低 ;且这两种细胞均生长缓慢 ,裸鼠移植瘤体积均明显小于SK N MC原始细胞或转染空载体的细胞接种形成的移植瘤。结论 稳定表达的反义bcl 2、反义svv均能够有效抑制SK N MC细胞内源性相应蛋白质Bcl 2、SVV的表达 ,提示这两个基因在NB细胞的肿瘤形成中均具有一定的作用。
关健[2]2001年在《反义bcl-2或反义survivin mRNA对人神经母细胞瘤细胞SK-N-MC、SH-SY5Y生长和凋亡的作用》文中认为神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童常见的恶性肿瘤之一，多起源于交感神经节和肾上腺髓质细胞。该肿瘤的临床表现和肿瘤生物学行为具多样性，可耐受多种治疗手段而呈恶性进展过程，有些肿瘤具有分化趋势，偶尔可自发分化成为良性的神经节瘤。与其它肿瘤相似，神经母细胞瘤的生物学行为有其内在的基因表达特性。文献报道，bc1-2在胚胎神经系统的发育中具有重要的调节作用，与NB肿瘤发生有关，未经治疗的NB中有1／3的肿瘤组织表达bc1-2，而且bc1-2的高表达与肿瘤的恶性生物学行为和预后不良有密切关系。bc1-2是Bc1-2家族中第一个被发现具有抑制细胞凋亡作用的原癌基因，其编码一个26KD的蛋白Bc1-2，是定位于线粒体外膜、内质网和外核膜的整合蛋白。大量研究表明在体外Bc1-2具有抑制包括低氧、射线、Fas抗体、及去血清培养等诸多因素诱导的细胞凋亡的作用。而且在人类的肿瘤中，有一半以上的肿瘤组织中可检测到其过度表达，临床相关研究已经在一些类型的肿瘤证实了Bc1-2与肿瘤细胞的抗药性之间的密切关系，随着Bc1-2表达的升高，患者的生存时间缩短，预后不良。另外经体外实验证实bc1-2的高水平表达的细胞克隆对顺式铂胺和表鬼臼素引起的细胞毒性呈剂量依赖性耐药，通过抑制细胞DNA的断裂，使NB细胞对化疗诱导的凋亡作用产生抗性。实验证实反义bc1-2寡核苷酸能够抑制细胞的生长，并抑制某些肿瘤如非何杰金淋巴瘤、髓细胞白血病和前列腺肿瘤细胞中Bc1-2蛋白的表达，使肿瘤细胞对传统的化疗药物更加敏感，促进细胞的凋亡。与反义寡核苷酸技术相比，转染反义基因后获得稳定表达的反义基因，对研究反义bc1-2的作用则具有明显的优点，目前关于稳定转染的反义bc1-2对NB的生长和凋亡及其相关机制较完整的研究还未见报道。 目前认为与细胞凋亡密切相关的家族还包括IAP(Inhibitor of apoptosis)和Caspase家族。IAP家族是一组同时具有BIR(baculoviral IAP repeat)结构域和抑制细胞凋亡的作用的蛋白。IAP是在杆状病毒感染的宿主细胞中具有抑制细胞死亡的功能而发
文连姬[3]2004年在《靶向封闭凋亡抑制基因Survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的实验研究》文中提出喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，尽管近年来手术技术有了明显的提高、喉癌化疗、放疗及激光治疗卓有成效，但喉癌总的生存率仍很低，尤其对Ⅲ-Ⅳ期及复发、转移的喉癌疗效不容乐观,仍有30%-40%的患者死于复发或转移。因此人们一直在不断地寻求新的更有效的治疗方式。随着近年来肿瘤和基因治疗基础领域研究的不断突破，肿瘤的基因治疗为肿瘤的治疗带来了新的机遇。本文的研究目的是利用反义RNA技术靶向封闭凋亡抑制基因Survivin在喉癌细胞Hep-2中的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡，同时抑制肿瘤细胞的生长，为喉癌的基因治疗寻找新的靶点，开辟一条新思路。越来越多的研究表明恶性肿瘤的发生发展与细胞凋亡、增殖调节失控密切相关。Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族IAP(inhibitor of apoptosis protein)中结构最简单的成员，具有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的作用。它不同于凋亡抑制蛋白家族的其他成员，在正常组织中不表达或低表达，而在人类大多数恶性肿瘤中高表达。现已证实，Survivin在各种类型的肺癌、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肝癌、食道鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、白血病、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤等均有异常表达。Survivin这一独特的组织分布的选择性，使它可能成为肿瘤基因靶向治疗的潜在靶点。也即如能靶向封闭<WP=110>此基因，则可阻断这一抗凋亡途径，只杀伤肿瘤细胞而不伤及正常细胞。反义RNA（anti-sense RNA）是指能够通过碱基互补与目的基因的mRNA特异性结合，抑制靶mRNA的功能，从而调控其表达的一类小分子转录物。近20年来，反义RNA技术不断发展完善，应用反义RNA在调控基因表达、特别是在抑制一些有害的基因表达方面取得了很大进展。与反义寡核苷酸技术相比，反义RNA可以克服反义寡核苷酸基因治疗时细胞对其吸收率低、半衰期短、特异性差、基因传递不完全、对细胞有毒性的缺点。而且，反义RNA技术具有成本较低、作用的长效性等反义寡核苷酸技术无法比拟的优势。本研究的主要内容和成果包括以下几方面：1. 应用免疫组织化学技术检测了42例喉癌组织、20例癌旁组织、20例喉角化症及10例正常喉粘膜中Survivin 蛋白的表达情况，证实了在人喉癌组织中Survivin有较高的表达（66.7%），癌旁组织及喉角化症中Survivin的表达相对较弱(40%、35%)，而在正常喉黏膜中无Survivin表达。这一结果表明，Survivin在喉癌中的异常表达可能与喉癌的发生有关。2. 成功的构建了Survivin反义RNA真核表达载体：根据Genbank中NM-001168 Survivin mRNA 序列应用软件primer 5.0分别针对mRNA大部分编码序列和mRNA3’端非编码区设计了两对引物。1）针对mRNA大部分编码序列 上游引物：5’- GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC- 3’下游引物：5’- AGATCTTTCTTATTGTTGGTTTCC- 3’2）针对mRNA3’端非编码区上游引物： 5'-GAATTCGTCCCTGGCTCCTCTACT-3'下游引物：5' -AGATCTCAAATCCATCATCTTACGC-3'根据真核表达载体pEGFP-C1多克隆酶切位点的位置（Bgl II在前，EcoR I<WP=111>在后），设计以上两对引物上游引物5’端均带有EcoR I酶切位点GAATTC，下游引物5’端带有Bgl II 酶切位点AGATCT，以达到将cDNA反向插入载体的目的。 用Trizol提取喉癌细胞中的总RNA，通过RT-PCR技术从喉癌细胞中钓取针对Survivin mRNA大部分编码序列和mRNA3’端非编码区cDNA。首先与过渡载体pMD18-T载体相连，转化感受态细胞扩增质粒，测序正确后Bgl II和EcoR I双酶切pMD18-T载体和pEGFP-C1载体分别获取插入pMD18-T载体的cDNA片段和线性化pEGFP-C1载体，在T4连接酶的作用下将cDNA片段反向插入pEGFP-C1载体，经测序证实碱基序列的正确性，表明反义Survivin RNA真核表达载体构建成功（分别命名为pEGFP/Survivin-1和pEGFP/Survivin-2）。实验细胞和细胞培养:人喉癌细胞株Hep-2培养于10%RPMI-1640(含小牛血清)完全培养基，37℃、5%CO2孵箱培养。实验细胞取对数生长期的喉癌细胞，2-3天传代一次。转染Hep-2获稳定细胞株：用真核转染技术成功地将上述两对重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2（将重组质粒与脂质体混合，按试剂操作说明进行），并利用G418（300mg/ml的维持浓度）筛选，获得转染pEGFP/Survivin-1和pEGFP/Survivin-2的稳定细胞株（分别命名为HpEGFP/Survivin-1和HpEGFP/Survivin-2），同时将转染空载体pEGFP-C1的稳定细胞株（命名为HpEGFP-C1）作为对照。为后续实验奠定了基础。由于所用的载体pEGFP-C1能编码绿色荧光，因此，可在荧光显微镜下直接观察转染的细胞。4．应用半定量RT-PCR和蛋白免疫印迹Western- blot技术分别从mRNA水平及蛋白水平检测了反义Survivin RNA真核表达载体封闭喉癌细胞Hep-2中Survivin 表达的效果，结果表明，构建的两对反义Survivin载体（pEGFP/Survivin-1和pEGFP/Survivin-2）在Hep-2细胞内分别从mRNA<WP=112>水平及蛋白水平不同程度的抑制了Survivin的表达，抑制率分别为30-40%。5 . 反义 Survivin载体诱导喉癌细胞凋亡和抑制其增殖的体外实验：5.1反义 Survivin载体诱导喉癌细胞凋亡 :通过吖?
包悍英[4]2003年在《凋亡蛋白抑制因子在骨髓增生异常综合征患者及其细胞株MUTZ-1细胞中的作用及意义》文中指出骨髓增生异常综合征(MDS)是一组以血细胞质、量异常和高风险发展成为急性白血病为特征的恶性克隆性造血干细胞病。病人常常表现为髓内异常增生，但外周血细胞减少。这种现象近来被归结于造血细胞的过度凋亡，而MDS向白血病的进展则可能是由于获得性的基因变异抑制细胞凋亡，从而使恶性克隆细胞得以存活。因此，凋亡目前已成为研究MDS发病机制的热点，与凋亡有关的基因也引起人们的广泛关注。近年来的研究表明从海南粗榧提取的有效抗癌药高叁尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)能诱导多种细胞凋亡，它受基因控制并依赖细胞内在的死亡机制。凋亡蛋白抑制因子(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一个抑制细胞凋亡的基因家族，最早发现于杆状病毒，它能抑制由病毒感染而诱导的细胞凋亡，具有结合和抑制半胱天冬酶(caspase)、调节细胞周期和调控死亡受体介导信号传导等多生物学活性，其家族成员分别有XIAP、clAP-1、clAP-2、NAIP、survivin、BRUCE和livin。其中XIAP是X染色体连锁的IAP，其在人体内广泛存在。美国国家癌症研究中心(NCI)使用含阿糖胞苷的化疗方案对AML病人进行疗效及预后评价，结果发现低表达XIAP的病人长期完全缓解及无病生存率则明显高于高表达XIAP的病人，表明XIAP在AML的预后中可能是预测高危因素的指标之一。Survivin是IAPs基因家族中最小的成员，主要表达在各种凋亡调节器官的胚胎发育期，而在正常成人的器官则检测不到，当细胞恶变为肿瘤细胞时，survivin又将会重新表达，因此，survivin被看作是肿瘤相关蛋白。对survivin、XIAP在MDS病人及其细胞株的表达研究国内外文献尚未见报道， 通过对HHT致骨髓增生异常综合征细胞株凋亡及凋亡蛋白抑制因子survivin、XIAP 浙江大学硕士学位论文一在不同表型MDS患者中的表达变化的研究，将有助于了解MDS的发生及发展机制，为临床使用HHT治疗MDS提供实验依据，并为进一步寻找MDS的治疗策略拓宽思路。［方法］l 应用流式细胞仪技术及透射电镜研究HHT诱导人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ－I，人急性红白血病细胞K562，；人淋巴瘤细胞株Jurkat，人骨髓瘤细胞株RMPI及人急性粒细胞白血病细胞株HL60细胞凋亡及形态，MUTZ－1细胞周期的变化。二 半定量逆转录酶－多聚酶链式反应检测MDS患者骨髓单个核细胞、上述细胞株及HHT作用MUTZ－1细胞后凋亡蛋白抑制因子survivin、XIAP及凋亡调节基因k－2、Bax的表达。3 应用反义转染技术研究高叁尖杉酯碱（HHT）和 survivin反义寡聚脱氧核昔酸 （AS－ODN）对MUTZ－l细胞的作用及其机制。［结果］IHHT能诱导 MUTZ－l、K562、Jurkat、RPMI． HL60凋亡，相同浓度 HHTO＊卜g／ml作用 IZh后各细胞株凋亡率不同，其中 K562细胞凋亡率低于 MUTZ－l 和 RPMI细胞 （P＜0刀5），MUTZ．l和 RPMI细胞凋亡率低于 JLllkat和 HL60细胞（P＜0刀5），而 MUTZ－l和 opMI细胞的凋亡率无明显差异，JLrkat和 HL60细胞的凋亡率也无明显差异。不同浓度的HHT（0，05、0．2、0．4、0．印含M）作用于MUTZ·l细胞6h、12h、24h的凋亡率随着浓度增加而增加，差异具有显着性：6h组F二69．71，＊＜o．0卜】Zh组F一163．789，＊＜0刀1；24h组F＝209．277，P＜o．01。各时间组两两间均有显着差异，且随着作用时间的延长凋亡率增加：6h组与12h组比较尸＜0刀卜6b组与24h组比较P＜0刀1；6h组与12h组比较P＜O．01。各细胞株均有不同水平survivin mRNA的表达，其表达水平不同，其中K562表达高于MUTZ－l和 nyMI细胞u＜口刀5），MUTZ－l和 RPMI细胞表达高于 Jurkat和 HL60细胞 （P＜0．05），而 MUTZ－1和 RPMI细胞的表达无明显差异，Jurkat和 HL60细胞的表达也无明显差异，细胞株 survivin mRNA的表达水平与 HHT诱导的凋亡率呈负相关（ry－0．980，p＝0刀03）；各细胞株XIAP表达无明显差异。2 Survivin、Bax、Bcl－2 mRNA在MUTZ－l细胞中的表达与HHT作用的关系 MUTZ－l细胞经 HHT（0．05、0．2、0．4、0．8卜g／ml）处理 6h后，随着 HHT浓度的增加，MUTZ－l细胞survivin mRNA下调，差异具有显着性（F＝78．049，P＜0．of），同时HHT略上调MUTZ－l 2 浙江大学硕士学位论文细胞 Bax mRNA表达，但无明显统计学差异（P＞0刀5），在细胞凋亡过程中，Bcl－2 mRNA、XIAP表达无明显改变（P＞．05）；随着HHT浓度的增加，MUTZ－l细胞survivin mRNA下 调，而细胞的凋亡率增加，采用双因素相关分析发现survivin mRNA下调与细胞的凋亡呈 负相关（卜0．987，P＜0刀5）。3 HHT诱导 MUTZ－l细胞周期的变化 不同浓度的 HHT（0．2、0．4、0．spgAnl）作用细胞 12小时后分析周期的变化，可见随着 HHT浓度增加，细胞凋亡率增高（o，983，P＜0．05），而 GI期细胞逐渐减少（，0．978，P＜0刀5），S期及 GZ／M期细胞增多（f—0．974，P＜0刀5），细胞被阻滞在GZ期。4
刘善廷[5]2007年在《RNAi技术干扰Survivin基因对喉癌Hep-2细胞作用的实验研究》文中研究指明喉癌是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，发病率高，在我国约占全身肿瘤的1—2％，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的11—22％。早期喉癌治疗以手术或放疗为主，中晚期喉癌多采用以手术为主的综合治疗，尽管20世纪80年代以来，喉癌的治疗取得了较大的进展，手术、放疗、化疗和免疫治疗的联合应用，大大提高了患者的5年生存率和生活治疗。但手术、放疗和化疗致残率高、并发症多、毒副作用大，手术后复发和转移仍是喉癌患者的主要致死原因，5年生存率的进一步提高似乎进入瓶颈，难以有突破性进展。因此寻找新的有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为耳鼻咽喉科工作者关注的焦点，尤其是肿瘤形成早期和治疗后肿瘤负荷小的情况下，对亚临床病灶的恰当处理，是避免恶性肿瘤复发、转移，和提高5年生存率的关键。对于手术或放疗后的亚临床病灶的处理，是影响恶性肿瘤预后的关键步骤，也是人们近年来研究的热点。肿瘤生物治疗(Biotheropy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。恶性肿瘤的生物治疗主要有：基因治疗，肿瘤疫苗治疗，生物反应调节剂治疗等。其中基因治疗不仅能够使恶性肿瘤细胞的恶性表型逆转，抑制肿瘤生长，而且可以使受到损伤的细胞得以修复，去除引起突变的始动因素，是一种直接有效的治疗。这种治疗应用于临床，已经取得可喜的成果。但传统肿瘤基因治疗的转染效率低、靶向性差、抗癌基因表达量低的缺点。为解决以上缺点，近年来RNAi干扰技术被应用于恶性肿瘤基因治疗的试验研究。其原理是小片段RNA(siRNA)利用碱基互补的原理，特异性地结合癌基因的mRNA，干扰其翻译、转录形成蛋白质的功能，阻抑癌蛋白的生成。使癌细胞向成熟方向分化或诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。RNAi技术是在核酸水平改变肿瘤操控基因的治疗方法，特异性强，副作用小，有希望成为新的基因治疗途径。Survivin是新近发现的LAP家族成员之一，是目前发现的抗凋亡能力最强的凋亡抑制因子，具有不同于IAP家族其他成员的独特性质和结构，在正常成人组织中不表达而选择性地表达于恶性肿瘤组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，这种独特的表达特性及其与恶性肿瘤发生、发展的密切关系，使其成为恶性肿瘤诊断与治疗的新靶点。基于以下目的：1．探讨survivin基因在喉癌组织中的表达及其与喉癌发生、发展和转移的关系；2．观察利用RNAi技术敲除喉癌细胞中survivin基因对喉癌细胞凋亡的影响，3．RNAi技术作用于活体喉癌细胞的效果；4．RNAi技术应用于活体的安全性。本研究用免疫组织化学方法检测喉鳞癌标本中survivin及其它凋亡相关基因的表达及其和喉癌临床特点的关系，探讨它们在喉癌的发生、发展中的作用。建立以survivin基因为目的基因，质粒为载体的siRNA，脂质体包埋，转染喉癌Hep-2细胞，观察转染后细胞的生长情况、survivin的表达和细胞凋亡。建立Hep-2细胞裸鼠模型，静脉途径给药，观察瘤体增长情况，瘤细胞内survivin的表达和细胞凋亡。方法1．采用免疫组化检测人喉鳞癌细胞中survivin，caspase—3，bcl—2，bax，p53基因的表达。2．采用细胞免疫化学法观察survivin蛋白在喉癌Hep-2细胞系中的表达情况。3．脂质体包埋survivin RNA，转染喉癌hep-2细胞。采用western-blotting方法检测survivin siRNA转染后对喉癌Hep-2细胞中survivin蛋白水平的影响。4．采用RT-PCR方法检测不同浓度、不同作用时间survivin siRNA对survivinmRNA表达的影响。5．采用甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测survivin siRNA转染前后对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。6．紫杉醇、紫杉醇+siRNA转染组作用喉癌Hep-2细胞，应用流式细胞仪对对照组和处理组进行细胞周期和凋亡分析。7．建立裸鼠种植瘤模型。于裸鼠前腿背侧注入Hep-2细胞(2×10~7／ml，0.2 ml／只)，成瘤后随机分为A、B、C叁组，分别给予PBS 200μl，紫杉醇200μl，紫杉醇+siRNA200μl腹腔注射。8．免疫组织化学检测裸鼠种植瘤PBS组、紫杉醇组、紫杉醇+siRNA组survivin蛋白的表达情况。9．应用凋亡的原位酶标记检测(TUNEL)检测裸鼠种植瘤治疗前后细胞凋亡的变化。10．观察给药后各组裸鼠饮食、精神状态；检测血常规及肝肾功能；在光镜下观察到裸鼠的心、肝、脾、肾等主要脏器。判断给药后有无毒副作用。11．应用spss11.0和sas9.0统计软件进行统计学处理。对记数资料采用x~2检验或Fisher精确检验、Spearman相关性分析。计量资料采用均数士标准差((?)±s)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析，两样本均数比较采用t检验。检验水准P=0.05。结果1．人喉鳞癌组织免疫组化检测结果显示：survivn(71.8％)，bcl—2(47.3％)，p53(62.7％)在喉鳞癌细胞中表达增强，caspase—3，bax蛋白表达下降。这种异常表达与喉鳞癌的发病及恶性表型关系密切。2．细胞免疫化学结果显示：survivin蛋白在喉癌Hep-2细胞系中阳性表达。3．western-blotting结果显示：survivin siRNA转染喉癌Hep-2细胞24h、48h、72h后提取细胞蛋白进行western-blotting分析，结果显示随着时间延长survivin蛋白表达水平逐渐降低。4．RT-PCR扩增结果显示：不同时间、不同浓度的survivin siRNA对目的基因mRNA的表达均有影响。随着时间的延长和浓度的增加，survivin mRNA的表达逐渐减弱。5．四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)的结果：不同浓度、不同时间survivin siRNA转染Hep-2细胞后，SDH活性受抑制情况与对照组相比差异有显着性(P＜0.05)。联合应用紫杉醇之后，对Hep-2细胞SDH活性的抑制作用更明显(P＜0.01)。提示二者有协同作用。6．流式细胞仪对细胞周期检测的结果：紫杉醇、siRNA转染、紫杉醇+siRNA转染分别处理细胞48h后的结果显示：S期细胞的百分比各组分别依次为：对照组36.1％，siRNA转染组19.2％，紫杉醇+siRNA转染组13.8％，下降趋势明显(P＜0.05)，紫杉醇+siRNA转染组效果最显着。7．对照组，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组裸鼠体重和肿瘤体积在治疗前具有均衡性。治疗后，对照组，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组体重与对照组相比差异有显着性(23.0g，19.6g，17.9g，p＜0.05)；各组裸鼠肿瘤体积均逐渐增大，对照组肿瘤无限制生长，统计学分析显示治疗结束后，对照组，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组体积缩小有显着差异(1749.5mm~3，863.9mm~3，613.9mm~3，p＜0.05)；紫杉醇+siRNA转染组和其它治疗组相比，肿瘤体积缩小最明显。8．裸鼠肿瘤组织survivin蛋白的免疫组化测定结果显示：对照组survivin蛋白强表达，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组survivin蛋白阳性细胞数减少(311，158，102，p＜0.05)。紫杉醇+siRNA转染组survivin蛋白减弱最明显。9．裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡的检测结果(TUNEL法)：阳性细胞数按对PBS组、紫杉醇组、紫杉醇+siRNA组顺序依次增多(6，35，87)。经统计学处理，组间差异显着(P＜0.05)10．通过对给药后毒副作用观察，发现各组裸鼠饮食正常、精神状态良好；血常规及肝肾功能与治疗前无显着性差异；在光镜下观察到裸鼠的心、肝、脾、肾等主要脏器无异常改变。结论1．人喉鳞癌组织中survivn，bcl—2，p53表达增强，caspase—3，bax蛋白表达下降。这种异常表达可能与喉鳞癌的发生及恶性表型有关。2．survivn siRNA可有效的沉默喉癌Hep-2细胞的survivn基因，下调survivin蛋白及mRNA的表达水平，诱导凋亡并对细胞的增殖有抑制作用。3．survivin siRNA与紫杉醇联合应用，二者具有协同作用，可有效地阻止细胞增殖，促进细胞凋亡。4．成功构建了裸鼠喉癌移植瘤模型。体内研究显示：survivn siRNA可以促进肿瘤细胞的凋亡，抑制裸鼠体内肿瘤的生长，有效起到抗肿瘤作用。5．survivin siRNA应用于小鼠，未见明显毒副作用，不影响正常生长，对重要脏器无明显损伤。
马荣, 陈曦海, 唐丽萍, 耿晓星, 张云艳[6]2006年在《Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究》文中指出目的构建Survivin反义真核表达载体(anti-pcD-NA3-svv),探讨其对卵巢癌的凋亡诱导作用、对多西他赛的化疗增敏作用及逆转耐药的机制.方法采用Survivin反义核酸瞬时电转染法转染卵巢癌细胞系Skov3,筛选出阳性细胞株.以Westernblot检测Survivin蛋白的表达,用流式细胞仪检测其对Skov3的凋亡诱导作用,采用MTT法检测其对多西他赛的化疗增敏作用,并检测实验组细胞(Skov3-SVVanti)MDR-1mRNA的表达.结果稳定表达anti-pcDNA3-svv的Skov3-SV-Vanti其Survivin蛋白表达比未转染者明显降低,Skov3-SV-Vanti组细胞流式细胞仪检测显示其凋亡率为19%,对多西他赛的IC50值为(13.3±2.25)ng/mL,而对照组(Skov3)为(53.2±2.45)ng/mL,差异具有明显的统计学意义(P<0.01).Skov3-SVVanti组MDR-1mRNA表达较Skov3组明显减少(P<0.01).结论Survivin反义核酸可诱导卵巢癌细胞凋亡,并通过降低MDR-1mRNA表达增强多西他赛化疗敏感性.
宋晖[7]2007年在《Survivin基因RNAi对宫颈癌凋亡及放、化疗敏感性影响的实验研究》文中认为细胞增殖与凋亡失衡是肿瘤形成和发展的一个重要机制,而肿瘤细胞的凋亡受阻也是导致其疗效减低的重要原因。细胞凋亡的调控机制非常复杂,涉及多种调节因子和多条反应途径。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族就是一类重要的抗细胞凋亡因子,该家族结构的共同特点是N端含有一个或多个串联的杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat, BIR),C端含或不含有一个环指(RING finger)结构。Survivin是新近发现的IAP家族中的一个重要成员,它不仅具有强大的抗细胞凋亡功能,而且在人类多种恶性肿瘤中均存在高表达。近年来的研究表明survivin与包括宫颈癌在内的多种人类恶性肿瘤的形成、发展及预后有着密切关系,其表达异常升高可能是导致肿瘤放疗抵抗和化疗耐药的重要原因。RNAi(RNA interference)技术是双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的序列特异性的转录后基因沉默,广泛存在于高等植物和动物中,其机制是细胞内的dsRNA被Dicer(一种RNA酶Ⅲ)剪切成双链的小分子干涉RNA (small interfering RNA,siRNA)与RNA诱导的基因沉默复合物结合,降解与之互补的靶mRNA,特异性抑制靶基因表达。自1998年研究者们发现dsRNA能引起特异性基因沉默以来,RNAi技术因其简便易行并且具有特异性和高效性,很快成为研究基因功能和基因表达调控的重要方法。宫颈癌是妇科高发恶性肿瘤,虽然我国对宫颈癌的防治已取得很大成效,但近年来随着人乳头状瘤病毒(HPV)感染率的上升和社会生活的变化,宫颈癌的发病率呈有增高趋势,近20年来发病明显趋于年轻化,且宫颈腺癌比例增加。因为腺癌易早期发生淋巴结转移,对放疗的敏感性较差,对化疗容易产生耐药,因此治疗难度加大,预后不理想。因而寻找一种科学、可行的途径来增强放、化疗疗效,改善预后成为宫颈癌治疗领域研究的热点问题。研究目的观察survivin基因表达下调对宫颈癌凋亡和放、化疗敏感性的影响,并通过寻找其可能作用途径,探讨survivin基因RNAi对宫颈癌放、化疗增敏的可行性,为以survivin为靶基因治疗宫颈癌提供理论依据。研究方法本研究主要分以下叁个部分:①Survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌HeLa细胞survivin表达的影响。根据survivin基因编码序列及RNAi寡核苷酸设计原则,设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(S1-1,2、S2-1,2),退火连接后利用DNA重组技术将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后经脂质体转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达,筛选干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体和稳定转染细胞系进行后续实验。②Survivin基因RNAi对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡及放、化疗敏感性的影响。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期变化,流式细胞仪、Hoechst染色观察细胞凋亡情况,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3(caspase-3)活性变化,免疫荧光检测Ku70蛋白表达变化。平板克隆形成实验、多靶单击模型拟合细胞存活曲线观察细胞放疗敏感性变化;流式细胞仪、MTT比色法检测2GyX线照射24h、48h和72h后细胞凋亡和生长抑制情况。MTT比色法检测细胞存活率并计算顺铂作用72小时的50%抑制浓度(IC50);流式细胞仪、MTT比色法检测5ug/ml顺铂作用后24h、48h和72h后细胞凋亡和生长抑制情况。③Survivin基因RNAi对宫颈癌HeLa细胞裸鼠成瘤、移植瘤生长及其放、化疗敏感性的影响。直接细胞悬液接种法建立HeLa-S2、HeLa-NC、HeLa-U6 neo和HeLa 4种细胞的宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤情况,比较4种细胞的成瘤能力。定期测量移植瘤体积并绘制生长曲线,处死后称取移植瘤瘤重,观察survivin基因RNAi对移植瘤的生长抑制。免疫组化SP法检测各组移植瘤survivin蛋白表达情况。免疫组化SP法检测FⅧRag表达情况,并计算微血管密度(microvessel density,MVD)。HE染色、TUNEL染色检测各组移植瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡指数(apoptotic index,AI)。通过定期测量移植瘤体积并绘制生长曲线,处死后称取移植瘤瘤重,TUNEL染色检测移植瘤细胞凋亡情况,观察survivin基因RNAi对移植瘤X线放射治疗敏感性和顺铂化疗敏感性的影响。研究结果①成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-S1和pSilencer2.1-S2;建立了4组稳定转染细胞系:HeLa-S1、HeLa-S2、HeLa-NC和HeLa-U6 neo。②转染pSilencer2.1-S1和pSilencer2.1-S2的HeLa细胞中survivin mRNA和蛋白表达均呈现不同程度下调,pSilencer2.1-S2的干涉效果较好,其稳定转染细胞系HeLa-S2 survivin mRNA和蛋白表达明显下降,表达抑制率分别为:62.8%和60.1%。③HeLa-S2细胞增殖受到抑制,各检测点A值显着下降(P<0.05);细胞周期发生显着变化,细胞被阻滞于G0/G1期,占(72.7±3.1)%,G2/M期明显减少,占(5.1±2.9)%;细胞凋亡率为:(19.2±1.4)%,明显升高。④HeLa-S2 caspase-3激酶活性增强,A405达1.26±0.04;Ku70蛋白表达明显下降。⑤各组细胞克隆形成率随X线照射剂量升高而下降;同一剂量照射下,HeLa-S2克隆形成率显着降低,细胞存活曲线显示:HeLa-S2 D0、Dq值显着下降,分别为:3.15、1.21,其放射增敏比分别为:2.01(D0值比)、1.77(Dq值比);2Gy X线照射后细胞凋亡率和生长抑制率随时间延长显着增加,各检测点HeLa-S2细胞凋亡率和生长抑制率明显高于未转染HeLa细胞。⑥各组细胞存活率随顺铂药物浓度升高而下降;在同一药物浓度下,细胞存活率明显下降,顺铂作用72小时的IC50值为(0.74±0.02)ug/ml;5ug/ml顺铂作用后细胞凋亡率和生长抑制率随时间延长显着增加,各检测点HeLa-S2细胞凋亡率和生长抑制率明显高于未转染HeLa细胞。⑦成功建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种HeLa-S2组裸鼠成瘤较晚,且肿瘤生长缓慢,其平均成瘤时间为(21.33±0.51)天,与接种HeLa组裸鼠[(7.22±0.37)天]相比差异显着(P<0.05)。⑧接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积在每个检测点均明显小于接种HeLa组;观察结束时,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:(0.369±0.043)g和(1.150±0.136)g(P<0.05)接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤生长抑制率为:67.9%。⑨免疫组化结果显示:接种HeLa-S2组裸鼠survivin蛋白表达显着下降;接种HeLa-S2组裸鼠FⅧRag表达亦显着下降,MVD值降至23.38±3.14。HE染色、TUNEL染色结果显示:接种HeLa-S2组裸鼠细胞凋亡明显增多,AI值达(22.73±1.37)%。⑩X线放疗后不同检测点接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:( 0.407±0.056 ) g和(1.381±0.289)g(P<0.05);接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:(30.06±0.98)%和(4.17±0.64)%(P<0.05)。(11)顺铂化疗后不同检测点接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:( 0.323±0.058 ) g和(1.347±0.173)g(P<0.05);接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:(37.38±1.01)%和(5.19±0.61)%(P<0.05)。结论①Survivin基因RNAi可成功阻抑人宫颈癌HeLa细胞中survivin mRNA和蛋白表达。②Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。③Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,调节细胞周期分布,使细胞阻滞于G1期,并下调Ku70蛋白表达水平,降低DNA损伤修复能力,进而显着提高细胞对X线放射治疗的敏感性。④Survivin基因RNAi可增加X线照射诱导的细胞凋亡,增强放射治疗对细胞的生长抑制。⑤Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,增强caspase-3激酶活性,诱导细胞凋亡,并显着提高细胞对顺铂化疗的敏感性。⑥Survivin基因RNAi可增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对细胞的生长抑制。⑦Survivin基因RNAi可通过抑制HeLa细胞增殖降低其成瘤能力。⑧Survivin基因RNAi可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达降低其MVD,从而抑制移植瘤生长并促进其凋亡。⑨Survivin基因RNAi可增加X线放射治疗诱导的细胞凋亡,增强放射治疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤的放疗敏感性。。⑩Survivin基因RNAi可增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤的化疗敏感性。
戴德坚, 吴丹, 孟化, 陆才德[8]2005年在《反义survivin-脂质体复合物对肝癌细胞生长凋亡和细胞周期的影响》文中研究指明目的探讨反义survivin-脂质体复合物(survivin-ASODN)对肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用及其机制,为肝癌及survivin阳性肿瘤的治疗提供理论依据。方法用脂质体介导survivin-ASODN转染肝癌细胞系HepG2细胞;通过RT-PCR和Westernblot检测survivin表达水平;以MTT法测量细胞生长情况;以流式细胞术测定caspase-3活性及凋亡率,电镜观察细胞形态学变化,并应用流式细胞仪同步分析survivin-ASODN对肝癌细胞系HepG2增殖周期的影响。结果surviving-ASODN可有效下调survivin表达水平,并呈剂量依赖关系,其IC50值为250nmol/L,最大效应浓度为600nmol/L;可抑制细胞生长,激活caspase-3活性,诱导细胞凋亡,使其出现凋亡形态学变化,如胞浆空泡变性、核浓缩和核碎裂。细胞周期的同步分析显示,surviving-ASODN对HepG2细胞增殖周期有明显影响,HepG2先出现细胞周期阻滞,紧接着出现细胞凋亡;低浓度处理后,可将细胞先后阻滞在S期和G2/M期;高浓度时,S期阻滞被加强,可快速诱导细胞凋亡,并且,细胞凋亡率随着药物浓度的增加和作用时间的延长明显上升。结论surviving-ASODN对肝癌细胞有强的生长抑制效应,其机制是与阻断细胞周期及诱导细胞凋亡有关。
阮菲, 解先宽, 刘少阳[9]2004年在《Survivin反义寡核苷酸诱导人卵巢癌耐药细胞株COC_1/DDP凋亡的实验研究》文中提出目的 :探讨经脂质体介导的survivin反义寡核苷酸诱导人卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP凋亡的作用。方法 :将脂质体介导的survivin反义寡核苷酸 (survivin ASONs)作用于COC1/DDP细胞 ,采用一步法RT PCR检测survivin、bcl 2mRNA的表达 ,并进行细胞核DNA梯形电泳 ,检测caspase 3活性 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。结果 :经survivin ASONs作用后COC1/DDP细胞中survivin等抗凋亡基因的表达下降 ,细胞核DNA电泳呈现凋亡细胞特有的梯状条带 ,caspase 3活性增加且呈时间依赖性 ,细胞凋亡率达33.18% ,细胞周期G2 /M及S期明显下降而多阻滞于G0 /G1期 ,与对照组差异有显着性(P <0 .0 5 )。结论 :survivin ASONs反义寡核苷酸能诱导人卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP细胞凋亡 ,且效果显着
陈涛, 田伏洲, 蔡忠红, 尹致良[10]2003年在《Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用》文中提出目的 用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化,激酶活性检测方法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化。结果 脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Ⅰ～Ⅵ组(空白对照、正义对照、400、600、800、1000ng/ml反义转染组)细胞内p38MAPK活性分别为7.03、7.07、13.47、16.37、43.97及47.87;caspase-3活性分别为0.015±0.010、0.014±0.002、0.026±0.003、0.042±0.001、0.093±0.001及0.100±0.001;Ⅳ～Ⅵ组细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高。转染后细胞发生G_2/M期阻滞,Ⅰ～Ⅵ组细胞凋亡率分别为0.70％、0.76％、2.43％、7.82％、23.11％及31.35％,各实验组细胞凋亡较对照组明显增加。细胞内微丝形态结构破坏,Ⅰ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度分别为189.69±6.68、184.23±8.76、173.14±8.15、99.48±6.57、76.69±10.05及63.80±6.79,Ⅳ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度较对照组明显降低。结论 脂质体介导转染survivi
参考文献：
[1]. 反义bcl-2和反义survivin对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生长的作用[J]. 关健, 陈杰, 罗玉凤, 高洁. 中华医学杂志. 2002
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[3]. 靶向封闭凋亡抑制基因Survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的实验研究[D]. 文连姬. 吉林大学. 2004
[4]. 凋亡蛋白抑制因子在骨髓增生异常综合征患者及其细胞株MUTZ-1细胞中的作用及意义[D]. 包悍英. 浙江大学. 2003
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[7]. Survivin基因RNAi对宫颈癌凋亡及放、化疗敏感性影响的实验研究[D]. 宋晖. 第四军医大学. 2007
[8]. 反义survivin-脂质体复合物对肝癌细胞生长凋亡和细胞周期的影响[J]. 戴德坚, 吴丹, 孟化, 陆才德. 中华肿瘤杂志. 2005
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[10]. Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用[J]. 陈涛, 田伏洲, 蔡忠红, 尹致良. 中华肝脏病杂志. 2003
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