汪家敏[1]2003年在《胸腺肽α1ELISA检测方法的建立及其临床应用》文中研究说明研究背景：胸腺肽α1(thymosin α1，简称Tα1)是含有28个氨基酸的酸性多肽，具有乙酰化的氨基端。它最早是由牛胸腺中提取的一种称为胸腺组分5中分离出来的多肽，普遍存在于哺乳动物的各种组织细胞中，具有极强的提高免疫功能的活性。它可诱导T细胞表面标志的产生，诱导包括巨噬细胞移动抑制因子、干扰素和白细胞介素等淋巴因子的产生，从而发挥调节机体免疫功能的作用。已有的研究表明，在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎患者中，Tα1表达水平低于正常水平，而在肿瘤患者中有高水平的表达。因此，Tα1有可能在许多疾病状态中发挥一定的作用。 目的：建立检测Tα1的特异的酶联免疫吸附检测方法，并检测正常和病理状态下成人血浆或血清Tα1的水平，了解Tα1的水平与病理状态的关系。 方法：制备兔抗Tα1的抗血清，建立Tα1的ELISA检测方法。分别检测正常成人、慢性ITP、非免疫性血小板减少、肿瘤、糖尿病以及肾脏疾病患者的血浆或血清Tα1水平。并对慢性ITP患者血浆Tα1水平与血小板相关抗体水平的相关性进行了研究，同时观察了Tα1水平与肿瘤的恶性程度、浸润、转移以及不同的治疗干预措施的关系。 结果：ELISA法检测Tα1的最小可测值为0.16μg／L，平均回收率为108.8％，批内及批间CV分别为(7.05±2.89)％和(11.44±2.84)％。63名健康成人血浆Tα1的水平为(0.78±0.34)μg／L，64例健康成人血清Tα1水平为(0.69±0.24)μg／L，健康成人随着年龄的增长Tα1水平有所下降，但无显着性差异。与健康成人相比，慢性ITP患者血浆Tα1水平降低，为(0.60±0.34)μg／L，差异有高度显着意义(P＜0.001)；而非免疫性血小板减少患者血浆Tα1水平与健康成人相比无明显改变，慢性ITP患者与非免疫性血小板减少患者血浆Tα1水平之间存在高度显着性差异(P＜0.05)。良、恶性肿瘤患者血清Tα1水平均较正常成人明显增高(P＜0.001)，其中又以恶性肿瘤患者Tα1水平增高更为显着，良性肿瘤和恶性肿瘤患者之间差别有显着性(P＜0.05)。恶性肿瘤患者中，Tα1水平与肿瘤的恶性程度、肿瘤的浸润、转移以及不同的治疗干预有关。与正常对照组胸腺肤。IELIsA检测方法的建.’l_及〕训臼床应用中文摘要相比，1型糖尿病患者血浆Tal水平明显低于正常对照组(P<0.01)，而2型糖尿病患者血浆Tal水平与正常对照无明显差异，1型和2型糖尿病患者相比血浆Tal水平之间的差异有显着意义(P<0.05)。肾脏疾病患者的血浆Tal水平均低于正常对照组(P均<0.01)，而与肾功能无明显相关性。免疫性肾脏疾病血浆Tal水平明显低于非免疫性肾脏疾病和正常对照组，差异有显着性 (P<0.001)，非免疫性肾脏疾病和正常对照组相比无显着性差异。 结论:首先在国内建立了Tal的酶联免疫吸附检测方法，该方法敏感性好、特异性高、重复性好，准确性也较高。血清或血浆Tal的检测有助于反映免疫性疾病和肿瘤的病理状态，提示可以作为一种新的免疫性指标和新的肿瘤标志物。
马云龙[2]2008年在《胸腺肽α1作用于树突状细胞的抗肿瘤免疫机制的实验研究》文中认为胃肠道肿瘤是临床上最常见恶性肿瘤之一,常规的治疗手段,包括手术、化疗和放疗,均未能有效提高病人尤其晚期病人的治愈率和生存率。近年,在肿瘤免疫学研究领域,树突状细胞(DCs)为基础的免疫治疗被认为是诸多肿瘤疫苗策略中最具希望者之一。DCs作为效力最强的抗原呈递细胞(APCs),具有高效摄取、加工、提呈肿瘤相关抗原(TAA),并激活初始免疫反应的独特功能。然而,许多研究表明肿瘤具有免疫逃逸的生物学特性,在肿瘤微环境中未成熟DCs因分化成熟受限而积聚增加,成熟的功能性DCs数量下降,诱导T淋巴细胞失能或调节性T细胞(Tregs)产生,最终导致抗肿瘤免疫抑制形成。己有大量的人和动物实验证明,应用外周血单核细胞来源的DCs在体外诱导活化,可使其功能从肿瘤微环境下的免疫抑制状态完全恢复,并负载肿瘤抗原制备为DCs疫苗回输体内,能够观察到TAA-特异性T细胞抗肿瘤免疫反应,并在部分病人获得了肿瘤部分消退的临床效果。尽管这些研究结果令人鼓舞,但迄今为止,DCs疫苗在癌症患者体内所诱导的免疫反应尚未足以达到非常突出的治愈性的临床治疗作用。所以,DCs疫苗的效力尚需进一步提高,以期成功应用于临床。增强DCs疫苗抗肿瘤免疫效应的策略包括:①调整DCs的成熟过程;②增强CD4+ T细胞免疫;③阻断调节性免疫抑制途径;④靶向肿瘤形成中的有效抗原靶点。肿瘤的成功治疗需要多种方法结合,多个步骤依次进行,DCs疫苗与免疫佐剂类活性物联合应用可以解决其免疫效力不足的问题。实验表明,辅以CD40L、IL-12、IL-2、热休克蛋白Hsp70等活性因子治疗,可增强并延续DCs诱导的CD4+Th1细胞反应和特异性CTLs杀伤作用,但临床应用存在毒副作用较大的问题。胸腺肽α1(Tα1)是一种功能强大的免疫调节剂,已应用于临床多年,毒副作用小,其可促进T淋巴细胞分化成熟和增殖,增加IL-2、IL-6、IFN-γ分泌,且研究报道对小鼠骨髓和正常人外周血来源DCs分化成熟有促进作用,可刺激DCs分泌IL-12和增强Th1反应。DCs疫苗制备大多采用负载肿瘤细胞裂解物或总mRNA等肿瘤细胞全抗原的治疗方案。此方案的优势在于疫苗有可能诱导激活多克隆T细胞扩增和多肿瘤抗原特异性的CTLs,而且应用病人自体全肿瘤抗原无需进行HLA配型,疫苗的安全性也已得到一定验证,临床试验很少观察到自身免疫的发生。构建适宜的动物模型是实验研究的重要组成部分,本研究中经尾静脉注射人T淋巴细胞,借助先天性T细胞免疫功能缺陷的荷瘤裸鼠,构建人源化T细胞免疫动物模型,通过体内、外实验,对Tα1促进DCs分化成熟以及增强DCs疫苗的抗肿瘤效应进行客观评估,进一步探讨Tα1新的免疫作用途径和靶细胞,以期为开展临床DCs疫苗抗肿瘤免疫治疗提供一种有效的、具有免疫佐剂活性的辅助免疫因子。本研究共分以下四个方面:第一部分胃肠肿瘤患者外周血树突状细胞功能学及其与CD4+CD25+T细胞失衡相关性的研究目的:探讨胃肠肿瘤(GIC)患者外周血单个核细胞(PBMCs)来源树突状细胞和CD4+CD25+T细胞(Tregs)的免疫功能状态、两者的相关性,以及与肿瘤临床病理分期和手术的关系。方法:收集早期胃肠癌(Ⅰ/Ⅱ期)患者术前、术后第7天、以及晚期癌(Ⅲ/Ⅳ期)患者外周血,以健康成人外周血为对照。提取PBMCs,流式细胞术(FACS)分别检测Tregs占CD4+T细胞的比例。PBMCs经贴壁法分离提取DCs,经rhGM-CSF、rhIL-4体外扩增培养至第5天,获得未成熟DCs (imDCs),FACS检测表型;imDCs经rhTNF-α诱导培养至第7天,获得成熟DCs (mDCs),MTT法和ELISA法分别检测mDCs与自体T细胞混合培养时mDCs刺激T细胞增殖能力以及上清液中IFN-γ的含量。结果:晚期胃肠癌患者imDCs表型HLA-DR、CD80及CD86均显着低于健康成人和早期癌患者(P<0.01);早期胃肠癌术后第7天患者imDCs表型HLA-DR及CD86表达显着低于健康成人(P<0.05)。晚期胃肠癌患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力与健康成人相比均有所减弱(P=0.073,P= 0.182),CD4+T细胞中Tregs的比例显着低于健康成人和早期癌患者(P<0.001);早期胃肠癌患者术后Tregs比例略低于术前(P=0.148)及健康成人(P=0.068)。HLA-DR、CD86表达与Tregs比例呈负相关性。结论:胃肠肿瘤患者尤其晚期和术后患者外周血DCs功能失调以及Tregs失衡可能和机体抗肿瘤细胞免疫耐受密切相关。第二部分胸腺肽α1对胃肠肿瘤患者外周血树突状细胞功能和CD4+CD25+ T细胞失衡影响的实验研究目的:探讨Tα1治疗前、后GIC患者外周血PBMCs来源DCs的免疫功能状态及CD4+CD25+ T细胞失衡的变化。方法:早期胃肠癌(Ⅰ/Ⅱ期)手术患者于术后第1~6天连续皮下注射Tα1,1.6mg/次/日,于术日和术后第7天晨分别采集外周静脉血;晚期患者入院后第4~9天连续皮下注射Tα1,1.6mg/次/日,并于入院后第4、10天晨分别采集外周静脉血。提取PBMCs,FACS分别检测Tregs占CD4+T细胞的比例。PBMCs经贴壁法分离提取DCs,经rhGM-CSF、rhIL-4体外扩增培养至第5天,获得未成熟imDCs,FACS检测表型;imDCs经rhTNF-α诱导培养至第7天,获得mDCs,MTT法和ELISA法分别检测mDCs与自体T细胞混合培养时mDCs刺激T细胞增殖能力以及上清液中IFN-γ的含量。结果:晚期胃肠癌患者imDCs表型HLA-DR、CD80及CD86治疗后均显着高于治疗前(P<0.01);早期胃肠癌术后第7天患者imDCs表型HLA-DR及CD86治疗后均显着高于治疗前(P<0.05)。晚期胃肠癌患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力治疗后与治疗前相比均显著增强(P<0.01),CD4+T细胞中Tregs的比例治疗后略低于治疗前(P=0.065);早期胃肠癌术后第7天患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力治疗后与治疗前和未治疗组相比均显著增强(P<0.05),Tregs比例较治疗前及治疗组基本无变化。结论:Tα1治疗胃肠肿瘤患者尤其晚期和术后患者外周血可以改善DCs免疫功能。第叁部分胸腺肽α1对负载结肠癌肿瘤抗原的树突状细胞功能影响的体外实验研究目的:观察Tα1对结肠癌细胞裂解物(TuLy)负载DCs(LyDCs)的表型和功能的影响。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导培养imDCs,并负载TuLy后制备LyDCs疫苗。Tα1体外刺激imDCs、LyDCs,FACS检测DCs表型变化;ELISA法检测LyDCs与自体T细胞共培养时,Tα1对LyDCs分泌IL-12以及活化T细胞分泌IFN-γ水平的影响;MTT法检测LyDCs经Tα1刺激后所诱导的细胞毒活性的变化。结果:Tα1刺激后的imDCs、LyDCs表型HLA-DR、CD80、CD86、CD83均上调(P﹤0.01);Tα1刺激组上清液中细胞因子IL-12和IFN-γ的水平较未刺激组增加(P﹤0.05,P﹤0.01);LyDCs经Tα1刺激后诱导的CTLs细胞毒活性较未经Tα1刺激组增强(P﹤0.01)。结论:Tα1可促进DCs分化成熟,并能增强LyDCs诱导的CD4+Th1细胞反应和CTLs的杀伤效应。Tα1与LyDCs疫苗联合应用时具有较好的免疫佐剂活性。第四部分胸腺肽α1联合树突状细胞疫苗对人源化免疫重建裸鼠结肠癌免疫抑制效应的体内实验研究目的:观察Tα1联合结肠癌细胞裂解物致敏树突状细胞LyDCs对人源化免疫重建裸鼠结肠癌的免疫治疗效应。方法:常规未成熟DCs负载结肠癌细胞裂解物制备LyDCs疫苗。HT-29结肠癌裸鼠成瘤后,经尾静脉注射人外周血T淋巴细胞6×106/只,2天后,流式细胞仪检测裸鼠人源性CD4+、CD8+T细胞;将人源化免疫重建裸鼠随机分为3组,分别用LyDCs+Tα1、LyDCs和生理盐水皮下免疫注射治疗;治疗后7天,体外观察各组裸鼠脾脏淋巴细胞的肿瘤杀伤作用及IFN-γ、IL-4分泌水平,实验结束时,观察LyDCs联合Tα1对结肠癌裸鼠的体内抑瘤作用。结果:免疫重建裸鼠均检测到人源性CD4+、CD8+T细胞;LyDCs+Tα1组裸鼠脾脏T淋巴细胞的肿瘤杀伤作用与LyDCs组比较差异显着(P﹤0.01),LyDCs+Tα1组T细胞的IFN-γ分泌水平与LyDCs组比较差异显着(P﹤0.01);接种HT-29细胞58天后,LyDCs+Tα1组、LyDCs组抑瘤率分别为60.41%、37.20%,两组之间抑瘤效应比较差异显着(P﹤0.01),两组的抑瘤效应与对照组比较分别(P﹤0.01)。结论:Tα1能增强LyDCs诱导的CD4+Th1细胞反应和CTLs杀伤效应,对DCs疫苗的抗肿瘤免疫治疗功效具有明显的放大作用。
李保东[3]2007年在《胃癌总RNA转染树突状细胞及联合胸腺肽α1抗胃癌免疫的体内外实验》文中提出恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,是人类死亡的主要死因之一。在全球范围内,胃癌发病率在男/女性恶性肿瘤中分别居第二、四位。胃癌是我国常见的恶性肿瘤,每年新发胃癌患者约为40万人,2005年中国胃癌发病率在男性中为37.1/10万,而且正呈不断上升趋势,死亡人数在所有恶性肿瘤中居首位。在诊断时,大多数胃癌患者已有局部淋巴结和器官的转移,对于无法手术切除的胃癌转移患者目前尚无有效的治疗手段,外科手术仍是胃癌的主要治疗手段。尽管外科手术、放疗和化疗有了很大进展,但进展期胃癌预后仍然很差,其治疗方法有限。另外,化疗毒副作用导致患者死亡和继发肿瘤发生。因此,有必要寻找一个更为有效的治疗方法。树突状细胞(DCs)是目前已知功能最强专职抗原提呈细胞,能摄取、加工和将抗原提呈给幼稚T细胞。DCs具有激活幼稚T细胞的特点,作为疫苗有效载体,已经用于肿瘤免疫治疗。随着DCs由外周血单核细胞和CD34+干细胞体外诱导分化、培养技术的建立,已使DCs疫苗应用于临床实践。肿瘤免疫治疗的一个重要进展就是DCs负载不同肿瘤抗原,如肿瘤裂解物、肽、肿瘤总RNA和肿瘤mRNA等,作为DCs疫苗诱导产生抗肿瘤免疫应答。近年来国外相继开展了用DCs疫苗治疗恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、宫颈癌和结直肠癌等肿瘤的Ⅰ、Ⅱ期临床试验。例如,2007年Bleaumer等报道用CA9肽和KLH负载成熟DCs治疗进展期、对细胞因子抵抗的肾细胞癌患者的Ⅰ期临床试验,结果表明患者对DCs疫苗有良好的耐受性。2006年Kyte等报道用单核细胞来源DCs转染自体肿瘤mRNA治疗恶性黑色素瘤的;2005年Yamanaka等报道用自体肿瘤裂解物负载单核细胞来源DCs治疗复发恶性胶质瘤;2006年Burgdorf等报道利用自体DCs负载肿瘤裂解物治疗进展期结直肠癌;2006年Nakai等报道利用肽或肿瘤裂解物致敏成熟的单核细胞来源DCs用于治疗对传统方法无效的恶性黑色素瘤;台湾Lee等于2005年报道用自体肿瘤裂解物负载外周血单核细胞来源DCs治疗进展期肝癌;2005年Hus等报道利用异体单核细胞来源DCs负载肿瘤裂解物或凋亡小体治疗早期B细胞慢性淋巴细胞白血病;2003年SuZ等报道利用肾肿瘤RNA转染DCs治疗转移性肾癌;2004年Caruso报道用肿瘤RNA负载单核细胞来源DCs治疗复发的脑肿瘤等等。总之,这些Ⅰ、Ⅱ期临床试验结果表明DCs疫苗治疗肿瘤是安全可行的。还有一些DCs疫苗的临床试验仍在进行,为今后改善DCs疫苗疗效奠定基础。但是,DCs疫苗治疗胃癌尚处于基础研究阶段。随着对肿瘤免疫和DCs疫苗的临床试验,将有助于我们在不久的将来找到一个更为有效的疫苗治疗肿瘤。胸腺肽α1(Tα1)在临床已广泛用于治疗慢性乙肝、丙肝和AIDS等,也辅助用于治疗非小细胞肺癌、肝癌和恶性淋巴瘤等肿瘤。已有研究表明:Tα1能影响T细胞成熟、分化和功能,促进NK细胞恢复活性,减少化疗时的肝毒性,增强机体的免疫调节作用。但Tα1对DCs的作用知之不多,2004年Huang等报道Tα1对小鼠骨髓来源DCs成熟、分化和功能具有调节作用。然而,Tα1对肿瘤患者外周血单核细胞来源DCs的作用尚未见报道,而且对于肿瘤免疫治疗联合应用Tα1也无相关报道。本研究共分以下四部分:第一部分胸腺肽α1对胃癌患者外周血单核细胞来源树突状细胞分化、成熟及免疫功能的影响目的:探讨Tα1体外对胃癌患者外周血单核细胞来源树突状细胞分化、成熟及功能的影响。方法:选择胃癌患者6例,其中女2例,男4例,均经病理检查证实为胃腺癌。利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),在体外经100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4诱导,隔天半量换液,并添加rhGM-CSF和rhIL-4,培养5天后产生不成熟DCs,第6天分为5组,其中实验组3组,分别加不同终浓度Tα1(Ⅰ组0.5ng/ml、Ⅱ组5 ng/ml、Ⅲ组50 ng/ml);阳性对照组(B组),加rhTNF-α20ng/ml;空白对照组(A组),不加rhTNF-α和Tα1;均继续培养2天。第8天,收集悬浮细胞用于体外实验。利用倒置相差显微镜观察moDCs形态;台盼蓝染色检测moDCs活力;流式细胞仪检测moDCs表型分子CD1a, CD80, CD86, CD83 and HLA-DR的表达;MTT法检测混合淋巴细胞反应中moDCs刺激T细胞增殖能力。结果:①Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与B组相比,moDCs的形态无明显区别,细胞活力无统计学意义(P>0.05);②Tα1能上调moDCs表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,与A组相比差异有统计学意义(P<0.01),但与B组相比无统计学意义(P>0.05);③Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组moDCs刺激T细胞增殖能力与Tα1呈剂量依赖性(P<0.05, P<0.01, P<0.01),均明显高于A组(P<0.01),但与B组相比无统计学意义(P>0.05),且随效靶比增加而增强。结论:Tα1能促进胃癌患者moDCs的分化、成熟和免疫功能;Tα1有可能作为一种药物,应用于促进DCs成熟;moDCs可能是Tα1体内作用的一个靶细胞。第二部分荷人胃癌皮下移植瘤及细胞免疫功能重建的裸鼠模型构建目的:探讨荷人胃癌皮下移植瘤及细胞免疫功能重建的裸鼠模型构建及其特征。方法:裸鼠饲养于SPF环境,实验前经1周检疫。人外周血T淋巴细胞利用尼龙毛柱法分离。10只4周龄裸鼠随机分为实验组(n=5):腹腔注射人外周血T淋巴细胞和皮下接种人胃癌细胞BGC-823,对照组(n=5)腹腔注射PBS和皮下接种胃癌细胞BGC-823。观察肿瘤的潜伏期、成瘤率和肿瘤体积,肿瘤大小用游标卡尺每2天测量1次。流式细胞仪检测裸鼠外周血中人源性T细胞,并观察移植物抗宿主病。MTT法检测实验组裸鼠脾T细胞的体外杀伤作用;皮下移植瘤的病理组织学检查。结果:①两组潜伏期分别为(11.2±1.9)天和(9.4±1.5)天,无统计学意义(P﹥0.05),成瘤率为100%;第4周未,两组瘤体积分别为(1495.6±111.6)mm3和(1649.6±128.0)mm3,相比无统计学意义(P﹥0.05);②第4周未,实验组鼠外周血中人CD3+、CD4+和CD8+T细胞分别为(46.86±9.14)%、(31.68±10.17)%和(17.91±1.38)%,而对照组鼠外周血中则无人T细胞;当效靶比为20:1和40:1时,实验组裸鼠脾T细胞的特异性杀伤率分别为(15.37±1.58)%和(19.86±2.86)%,且随效靶比增高而增强(P﹤0.05)。在观察期间,未发生GVHD。③两组荷瘤裸鼠均无肝、肺转移;胃癌细胞保持亲代细胞的形态学特征。结论:腹腔注射HuPBTL和皮下接种人胃癌细胞的方法成功构建人胃癌-HuPBTL-裸鼠模型,能模拟具有一定细胞免疫功能的胃癌患者的荷瘤状态,是研究胃癌DCs疫苗免疫治疗较理想的动物模型。第叁部分胃癌总RNA转染树突状细胞在人源化裸鼠体内的抗肿瘤免疫作用目的:探讨树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫作用。方法:用TRIzol试剂盒提取胃癌总RNA,并对纯度、含量和完整性进行鉴定,密度梯度离心法分离PBMCs,利用体外直接混合法制备DCRNA疫苗。建立人源化裸鼠模型,30只裸鼠随机分为免疫保护组和免疫治疗组,在免疫保护组中:15只裸鼠随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组,每组5只,分别用DCRNA、DCs和PBS皮下注射免疫2次,间隔1周,末次免疫后3天皮下接种人胃癌细胞BGC-823。在免疫治疗组中,15只裸鼠也随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组,每组5只,皮下可触及结节时,分别用DCRNA、DCs和PBS皮下注射免疫2次,间隔1周。观察裸鼠皮下瘤的生长、体积和瘤重。用酶联免疫吸附法检测IL-12和IFN-γ水平。结果:(1)肿瘤总RNA量约600μg,总RNA未降解。(2)在免疫保护组:DCRNA组瘤体积(574.20±95.73)mm3明显小于DCs组(847.76±113.91)mm3和PBS组(969.25±131.8)mm3(P﹤0.05);DCRNA组瘤重(0.464±0.156)g明显小于DCs组(0.750±0.220)g和PBS组(1.002±0.138)g(P<0.05, P<0.01),但DCs组和PBS组差异无统计学意义(P﹥0.05),DCRNA组抑瘤率(53.7%)显着高于DCs组(25.1%)(P﹤0.05)。DCRNA组IL-12水平(387.0±53.6)pg/ml明显高于DCs组(279.2±42.7)pg/ml和PBS组(24.7±5.1)pg/m(lP﹤0.01);DCRNA组IFN-γ水平(986.4±163.7)pg/ml明显高于DCs组(713.2±121.8)pg/ml和PBS组(57.9±9.3)pg/m(lP﹤0.05, P﹤0.01)。(3)在免疫治疗组:DCRNA组瘤体积(814.7±173.6)mm3明显小于DCs组(1089.3±196.8)mm3和PBS组(1258.6±257.3)mm3(P﹤0.05),但DCs组与PBS组无统计学意义。DCRNA组瘤重(1.027±0.236)g明显小于DCs组(1.458±0.390)g和PBS组(1.679±0.358)g(P<0.05, P<0.01),但DCs组和PBS组差异无统计学意义(P﹥0.05),DCRNA组抑瘤率(38.8%)显着高于DCs组(13.2%)(P﹤0.05)。结论:DCRNA疫苗在人源化裸鼠体内能诱导产生较强的抗胃癌免疫保护及治疗作用。第四部分胸腺肽α1联合树突状细胞疫苗的抗胃癌免疫治疗作用目的:观察Tα1联合树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫作用,探讨Tα1能否提高抗肿瘤活性。方法:提取肿瘤总RNA并进行鉴定,体外直接转染DCs制备DCRNA疫苗,腹腔注射人外周血T淋巴细胞建立人源化裸鼠模型,随后20只裸鼠随机分为PBS组(Ⅰ组)、DCRNA组(Ⅱ组)、Tα1组(Ⅲ组)和Tα1联合DCRNA组(Ⅳ组),每组5只,分别用PBS、DCRNA、Tα1以及Tα1联合DCRNA皮下注射,免疫2次,间隔1周,末次免疫后第3天于裸鼠皮下接种胃癌细胞。观察荷瘤鼠的瘤体积、瘤重和抑瘤率;采用酶联免疫吸附法检测IL-12分泌水平。结果:(1)Ⅱ组、Ⅳ组的肿瘤体积分别为(814.7±173.6)mm3和(672.1±126.8)mm3,明显小于Ⅰ组(1258.6±257.3)mm(3P﹤0.05或P﹤0.01)。Ⅱ组、Ⅳ组的瘤重分别为(1.027±0.236)g和(0.758±0.223)g,明显小于Ⅰ组(1.679±0.358)g(P﹤0.01)。(2)Ⅳ组的抑瘤率(54.85%)大于其理论抑瘤率(53.99%)。(3)Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组IL-12水平分别为(387.0±53.6)pg/ml、(182.3±36.2)pg/ml和(543.9±91.8)pg/ml,均明显高于Ⅰ组(24.7±5.1)pg/ml(P﹤0.01),Ⅳ组和Ⅱ组相比差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:DCRNA疫苗与Tα1在人胃癌-HuPBTL-裸鼠体内均具有一定的抗肿瘤作用,Tα1与DCRNA疫苗联合应用具有协同作用,为Tα1辅助DCs疫苗用于胃癌免疫治疗的临床研究提供理论依据。
卢高峰[4]2007年在《干扰素α、恩替卡韦和胸腺肽α1对慢性乙肝患者树突状细胞功能的体外影响》文中研究指明背景和目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一全球性的公共健康问题，我国是乙型肝炎高流行国家。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者往往迁延不愈，常由肝炎发展为肝硬化，甚至肝癌，在此过程中机体免疫反应发挥着重要作用。研究证明，乙肝慢性化的重要机制之一是HBV抗原特异性T细胞免疫耐受，患者不能产生针对HBV特异的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫反应，所以不能清除体内病毒。造成CHB免疫耐受的重要原因之一是患者体内树突状细胞(dendritic cell，DC)缺陷，不能把病毒抗原的信号有效传递给机体免疫系统。因此，恢复DC数量或加强DC抗原递呈功能，充分激活机体免疫反应已成为治疗CHB的重要途径之一。DC是能激活初始化T淋巴细胞的重要抗原递呈细胞，在抗病毒细胞免疫中起重要作用。通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)体外诱导、扩增可以获得足够的外周血单核细胞来源DC(monocyte-derived DC，MoDC)。CD1a主要表达于人胸腺细胞和DC，是人DC相对特征性标志，CD83是成熟DC的重要标记，CD80、HLA-DR是其表面重要的共刺激分子。干扰素α(interferon-α，IFN-α)和核苷(酸)类似物是目前国内外公认的慢性乙肝抗病毒治疗药。IFN-α除直接抑制HBV复制外，通过增强机体对HBV的免疫力也是一重要的途径，其机制较复杂；恩替卡韦(entecavir，ETV)是一新型口服核苷类药物，在细胞内经磷酸化后，与脱氧胞嘧啶核苷(dCTP)竞争进入病毒合成中的DNA链，终止病毒DNA的复制。胸腺肽α1可增强非特异性免疫功能，多用于联合治疗CHB。但这些药物对于CHB患者DC的影响，文献报道较少，尤其是ETV作为目前临床上最强的CHB抗病毒药，对于机体免疫系统的影响未见报道。本研究以IFN-α、ETV和胸腺肽α1分别与CHB的外周血MoDC体外共孵育，通过测定DC表面CD1a、CD83、CD80、HLA-DR等表型分子的表达，检测DC培养液中IL-6、IL-12含量和同种异体混合淋巴细胞反应等一系列指标观察它们对CHB的DC生物学特性的影响，为临床上应用以上药物及其与DC疫苗相结合治疗CHB寻找实验依据。材料与方法采集CHB患者及健康人外周新鲜静脉血以肝素抗凝后通过淋巴细胞分离液体外密度梯度离心分离获得单个核细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬单个核细胞后接种到24孔细胞培养板静置2小时，轻轻洗脱未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基(含10ng/ml rhGM-CSF和5ng/ml rhIL-4)诱导扩增，37℃、5％CO_2饱和湿度的细胞培养箱中培养。隔天半量换液。第5天收集DC，将CHB来源DC分别加入一定浓度的IFN-α(300U/ml)、胸腺肽α1(0.1μg/ml)和ETV(0.05μg/ml)分为IFN-α组、胸腺肽α1组、ETV组和IFN-α+胸腺肽α1组，同时设健康对照组和CHB对照组，继续共培养，第8天收获各组DC进行以下相关检测：1．倒置显微镜下动态观察细胞形态变化。2．流式细胞仪(FCM)测定DC表型分子CD1a、CD83、CD80及HLA-DR的表达。3．同种异体混合淋巴细胞反应法测定DC刺激淋巴细胞增殖能力。4．ELISA法检测DC培养上清中IL-12、IL-6含量。结果1．培养第8d观察各组细胞，健康对照组培养液中漂浮着较多云雾状的DC细胞团，表面突起丰富；各药物处理组均可见表面突起丰富的DC；CHB对照组DC多呈不规则形、多角形；健康对照组和各CHB药物处理组细胞分化形态优于CHB对照组。2．培养第8d的各组DC表型分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表达，在健康对照组明显高于CHB对照组和各CHB药物处理组(P＜0.05)；CHB对照组低于各CHB药物处理组(P＜0.05)；IFN-α+胸腺肽α1组、IFN-α组和胸腺肽α1组无统计学差别(P＞0.05)，但均高于ETV组(P＜0.05)。3．健康对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最强；CHB对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最弱；各CHB药物处理组强于CHB对照组；IFN-α+胸腺肽α1组、IFN-α组和胸腺肽α1组无统计学差别(P＞0.05)，但均高于ETV组(P＜0.05)。4．各组DC培养上清液中IL-12含量为健康对照组最高，其次为各CHB药物处理组，CHB对照组最低(P＜0.05)；IL-6含量与之相反(P＜0.05)。结论1．采用rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导的方法可以成功地从外周血单核细胞中体外诱导分化成DC，为进一步实验研究提供足量的细胞。2．CHB的DC与健康人相比其分化较差，膜表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR表达降低，刺激淋巴细胞增殖能力及分泌IL-12的能力低下，提示其功能缺陷，可能是HBV慢性感染的重要原因之一。3．IFN-α、ETV和胸腺肽α1都可以不同程度提高CHB的DC表面分子CD1a、CD83、CD80、HLA-DR的表达，促进其分泌细胞因子IL-12和增强DC刺激淋巴细胞增殖能力，提高细胞免疫的功能。4．在促进DC功能方面，ETV较IFN-α和胸腺肽α1作用弱；IFN-α联合胸腺肽α1与单用IFN-α或胸腺肽α1差别无统计学意义。
万健, 单怡, 单红卫, 赵良, 林兆奋[5]2011年在《胸腺肽α1对脓毒症小鼠调节性T细胞的免疫干预》文中指出目的观察胸腺肽α_1对脓毒症小鼠调节性T细胞数量、比例、凋亡及生存率的影响,探求胸腺肽α_1免疫调节作用的新机制。方法SPF级KM雄性小鼠,按随机数字表法分为假手术组(Sham)、脓毒症组(CLP)和胸腺肽α_1干预组(Th)叁组,每组按拟定标本采集时间再分随机分为2h、6h、12h、24h、48h、72h 6个亚组,每组20只小鼠(72h亚组30只);以盲肠结扎穿孔术(CLP)制作脓毒症小鼠模型;Sham组不结扎盲肠,Th组于CLP术后腹部皮下注射胸腺肽α_1100μg·kg~(-1);CLP组仅行盲肠结扎穿孔术。分别在预定时间点处死该亚组存活的小鼠并采集全血、远端回肠等标本;流式细胞仪检测血中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞(Treg)计数及其占CD4~+T细胞的百分比、CD4~+CD25~+T细胞凋亡率,ELISA法测定血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的浓度,苏木素-伊红(HE)染色光镜检测回肠病理形态变化,并对72h亚组进行生存率计算。用SPSS14.0 for Windows软件对数据作统计分析。结果Th组72h生存率明显高于CLP组(P=0.0184)。流式细胞术检测显示,Sham组术后Treg几无变化;Th组术后各时间点血中Treg占CD4~+T细胞的比例均明显低于CLP组(P<0.05或P<0.01):相反地,Th组CD4~+CD25~+T细胞的凋亡率显着高于CLP组(P<0.01);术后6～24h时间段CLP组CD4~+CD25~+T细胞的凋亡率甚至低于Sham组(P<0.05或P<0.01)。叁组术后血清细胞因子IL-2、TNF-α和IL-10、TGF-β均有变化,但Sham细变化幅度最小;与CLP组相比,Th组术后IL-2、TNF-α前期上升较小,后期降幅也小(P<0.01),而IL-10、TGF-β虽然也呈持续升高走势,但其升高幅度显着低于CLP组(P<0.01)。组织形态学检测显示相同时间点上Th组远端回肠的病理损害明显比CLP组减轻。结论胸腺肽α_1能有效调控脓毒症小鼠的炎症反应强度,提高72小时生存率。促进Treg的凋亡,降低脓毒症小鼠血中Treg的比例,可能是胸腺肽α_1发挥免疫调理作用的又一重要机制。
郭冬生[6]2004年在《家蚕生物反应器高效表达人干扰素α—胸腺肽α1融合基因、干扰素β与干扰素β突变体基因及其产物生物活性的初步研究》文中研究说明1 Southern—blotting证明IFN-THY已插入Bm-BacPAK6中(4kb左右的杂交带)；将重组病毒Bm-BacPAK-IFN-THY感染家蚕细胞，5龄家蚕幼虫和蚕蛹进行表达。SDS-PAGE、Western-blotting证明IFN-THY在家蚕细胞，家蚕幼虫和蚕蛹中均得到了表达(分子量为23kD左右)，而且表达产物具有IFN蛋白的免疫原性；微量细胞病变抑制法显示细胞表达产物中96小时表达样品IFN活性为3.72×10~4IU／ml，120小时表达样品IFN活性为3.10×10~5IU／ml，而24-72小时表达样品活性较低；蚕血淋巴表达产物中144小时活性最高，达到3.81×10~6IU／ml；120小时活性次之，为1.53×10~5IU／ml；96小时生物活性为2.44×10~4IU／ml；而24—72小时活性较低；蚕蛹表达产物中120小时活性最高，达到6.10×10~5IU／ml：96小时活性次之，为4.57×10~4IU／ml；24—72小时活性较低。玫瑰花结法显示细胞表达产物中与对照组相比，表达样品提高了玫瑰花结形成率，48—120小时表达产物的玫瑰花结形成率均在10％以上；蚕血淋巴表达产物中与对照组相比，表达样品提高了玫瑰花结形成率，48—144小时表达产物的玫瑰花结形成率均在10％以上；蚕蛹表达产物中与对照组相比，表达样品提高了玫瑰花结形成率，48—120小时表达产物的玫瑰花结形成率均在12％以上。结果表明融合基因在家蚕细胞，家蚕幼虫和蚕蛹中均得到了高效表达，表达的融合蛋白具有IFN-α2b和THY-α1的双重生物活性。小鼠口服试验表明，高剂量组口服15分钟后在小鼠血清内可检测到IFN活性，15分钟以后IFN活性逐渐降低；低剂量组在小鼠血清中IFN活性较低。家蚕生物反应器高效表达人干扰素Q一胸腺肤。1融合基因、干扰素p与干扰素p突 变体基因及其产物生物活性的初步研究 2用基因重组技术和PCR定点突变技术构建了人干扰素p及其突变基因，克隆到pBaepAKS上，获得重组转移载体pBaepAK一IFNp和pBa。PAK一IFN日517。与线形化Bm一BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞，经过体内重组，筛选到重组病毒Bm一BaePAK一IFN日和Bm一BaePAK一IFN p 517。将Bm一BaePAK一IFNp和Bm一BacPAK一工FN p 517分别感染家蚕细胞和家蚕幼虫进行表达。Southern一blotting证明IFN日和IFN旦517均已插入B介BaePAK6中(3.gkb左右的杂交带);SDS一PAGE、Western一blotting证明IFNp和IFN日517均在家蚕细胞和家蚕幼虫中得到了表达(分子量为ZOkD左右)，且具有IFN蛋白的免疫原性;微量细胞病变抑制法显示，1):IFNp细胞表达产物中120小时表达样品IFN活性最高，为1.03xl0‘IU/ml，144小时表达样品IFN活性为8.76XIO3IU/ml，96小时表达样品工FN活性为1.35xl护工U/ml，而24一72小时表达样品活性较低;蚕血表达产物中144小时活性最高，达到3.97 xl了IU/m1:120小时活性次之，为3.ssxlo5lu/ml:96小时生物活性为5.43xlo4lu/mI;24一72小时活性较低。2):IFN日517细胞表达产物中96小时表达样品IFN活性为1.08XIO3IU/ml，120小时表达样PaP IFN活性为2.62汉10‘IU/ml，144小时表达样品IFN活性为6.55x 103IU/ml，24一72小时表达样品活性较低。蚕血表达产物中144小时活性最高，达到4.32 x 106 Iu/ml;一20小时活性次之，为l.ssxlo5lu/mz;96小时生物活性为5.73 xl护形/ml:而24一72小时活性较低。结果表明两种基因在家蚕细胞，家蚕幼虫中均得到了高效表达，表达的蛋白均具有IFN的生物活性。
张国梁[7]2009年在《注射用重组人胸腺肽α1免疫药效学及相关机制的研究》文中研究指明本研究目的是检测由北京诺斯兰德药业有限公司提供的注射用重组人胸腺肽α1(Recombinate-thymosin alpha-1 by injection, rh-Tα1)对小鼠免疫功能的药效学作用及其相关机制的探讨。在提高免疫抑制小鼠的免疫功能实验中,将实验小鼠分组为免疫抑制对照组、正常组、rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组及已上市的同类产品日达仙对照组等。除正常组外,利用环磷酰胺将其余各组实验小鼠建立成免疫抑制模型,注射相应药物一段时间后,进行各项免疫指标的测定。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用明显;小鼠T淋巴细胞转化功能的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用显着;小鼠B淋巴细胞转化功能的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用显着;小鼠NK细胞活性的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用明显;小鼠IL-2水平的检测,rh-Tα1 0.4 mg/kg、0.8mg/kg剂量组作用明显。在提高正常小鼠的免疫功能实验中,将实验小鼠分为正常组和rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组,注射相应药物一段时间以后进行各项免疫指标的测定。小鼠脾指数的检测,rh-Tα1 0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组作用明显;小鼠胸腺指数的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组作用显着;小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用明显;小鼠T淋巴细胞转化功能的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用显着;小鼠B淋巴细胞转化功能的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg剂量组均作用显着;小鼠NK细胞活性的检测,rh-Tα1 0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量组均作用显着;小鼠IL-2水平的检测,rh-Tα1 0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.8mg/kg剂量组均有显着作用。
陈建清, 吴晓安, 骆锦忠, 朱玲[8]2009年在《胸腺肽α1对成人急性非淋巴细胞性白血病诱导化疗免疫功能的影响》文中认为目的研究胸腺肽α1对成人急性非淋巴细胞性白血病(adultANLL)诱导化疗免疫功能的影响。方法采用流式细胞仪(FCM)检测诱导化疗前后患者的外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞,采用ELISA方法检测IFN-γ的水平,随机分为治疗组(应用胸腺肽α1+诱导化疗组)和对照组(诱导化疗组),每组各27例,进行对照比较。结果诱导化疗前治疗组外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD16CD45与对照组接近(P>0.05),但CD3+、CD8+、NK数值诱导化疗2疗程后治疗组高于对照组,差异有显着性(P<0.05),而诱导化疗1疗程及诱导化疗2疗程后CD4+/CD8+、CD4+及短期CR组差异无显着性(P>0.05)。所有患者与正常组差异均有显着性(P<0.01);ANLL患者IFN-γ水平与正常人差异有显著性,均较正常组明显下降(P<0.01),但治疗组与对照组差异无显着性(P>0.05)。结论应用胸腺肽α1可以提高成人急性非淋巴细胞性白血病诱导化疗免疫功能,利于患者康复及进一步治疗,延长患者生存期。
王伟[9]2016年在《胸腺肽α1对严重脓毒症患者的疗效观察回顾性研究与体外实验》文中研究指明研究背景在美国,每年每10万人中发生脓毒症例数超过200例,发生严重脓毒症的例数也高达50-95例,且脓毒症发病率逐年增高,在过去的20年里,美国住院患者中,脓毒症的发病率每年以8.7%的速度递增。尽管人们一直致力于脓毒症的预防与治疗,严重脓毒症的病死率仍高达20-50%,严重脓毒症已成为重症监护病房中患者的主要死亡原因。起初人们认为强烈的炎症反应是导致脓毒症患者的主要死亡原因,然而,大量的针对早期炎症介质的目标治疗,如抗肿瘤坏死因子a抗体、白介素1受体抗体治疗并没有改善脓毒症患者的临床预后。目前,淋巴细胞凋亡和免疫抑制越来越多的被认为在脓毒症的发病机制中起到关键的作用,有脓毒症动物模型实验和临床试验指出,阻止淋巴细胞凋亡和加强免疫功能可以改善受试者的预后。肿瘤坏死因子a被认为是脓毒症重要的促炎症反应介质之一,但Docke et al指出,肿瘤坏死因子a分泌水平的增加表明单核细胞功能及抗微生物反应能力的恢复,体外脂多糖刺激后肿瘤坏死因子α的分泌量可以作为一个有效的指标来评估脓毒症患者的免疫状态。Hall et al也指出体外刺激全血后引起肿瘤坏死因子α的分泌量可以作为一个有用的生物标志物来监测脓毒症患者的免疫功能。胸腺肽α1是胸腺分泌的一种激素,最早于1972年由Goldstein等首次发现并对其特征进行了描述。胸腺肽a1被认为是一种免疫调节多肽,在临床上已广泛应用于慢性乙型肝炎及丙型肝炎的免疫调理治疗。胸腺肽α1在免疫系统中有很多生物学活性,如激活自然杀伤细胞,刺激T淋巴细胞的增殖、分化和成熟,阻止淋巴细胞凋亡。因此,作为一种免疫调节剂,胸腺肽α1可以用于脓毒症的治疗。有相关临床研究发现,胸腺肽α1治疗严重脓毒症可以取得有益的治疗效果。然而,由于严重脓毒症患者的异质性,胸腺肽α1或许对有些患者有效,对有些患者疗效不明显,这些研究没有指出哪些严重脓毒症患者用胸腺肽α1治疗更有效。本研究主要观察胸腺肽α1对哪些严重脓毒症患者的治疗效果更好,及胸腺肽α1对严重脓毒症患者APACHEⅡ评分、SOFA评分、淋巴细胞计数的影响,同时用脂多糖体外刺激严重脓毒症患者的外周血单个核细胞后分泌的肿瘤坏死因子α的浓度,来评估胸腺肽α1对严重脓毒症患者免疫功能的影响。研究目的1.探讨胸腺肽α1对严重脓毒症患者28天死亡率及生存时间的影响；2.探讨胸腺肽α1对严重脓毒症患者APACHEII评分、SOFA评分、淋巴细胞计数的影响；3.探讨胸腺肽α1对严重脓毒症患者免疫功能的影响。研究方法1.伦理学标准收集2013年1月至2014年12月住入我院重症医学科的严重脓毒症患者为回顾性研究,统计数据时为匿名分析,故免签知情同意书。用脂多糖体外刺激严重脓毒症患者的外周血单个核细胞后分泌的肿瘤坏死因子α的浓度,来评估胸腺肽α1对严重脓毒症患者免疫功能的影响,此体外实验抽取患者血液时均由患者或直系亲属签署知情同意书。本研究符合医学伦理学标准,经医院伦理委员会批准,批准号：2014一ZZYXK-003。2.研究对象收集2013年1月至2014年12月住入我院重症医学科,符合2001年国际脓毒症定义会议制定的严重脓毒症诊断标准的患者。排除标准：年龄小于18岁、妊娠期妇女、患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病(如再生障碍性贫血、白血病等)、或在过去1个月内使用过激素、免疫抑制剂或其他免疫刺激剂的患者,失访的患者。最终,244例患者纳入本研究。其中男169例,女75例,平均年龄(63.0±16.4)岁。引起严重脓毒症的原发感染灶为：肺部感染183例,腹部感染32例,泌尿系感染11例,其他部位感染18例。体外实验选择2015年1月诊断为严重脓毒症且不符合上述排除标准的患者12例进行抽血。3.数据收集通过浏览患者的临床病历资料,收集患者的性别、年龄、引起严重脓毒症的原发感染灶、APACHEII评分、SOFA评分、淋巴细胞计数和预后等指标(或者电话联系患者家属以获取患者的预后信息)。(以上检测指标均有我院检验科及重症医学科完成)。4.分组(1)244例患者中,根据患者确诊严重脓毒症后是否给予胸腺肽α1治疗分为胸腺肽α1组和非胸腺肽α1组,非胸腺肽α1组根据2008年国际严重脓毒症诊疗指南采用常规治疗方案,胸腺肽α1组在常规治疗基础上联合应用胸腺肽α1皮下注射1.6mg,每12小时1次,连用7天。(2)胸腺肽α1组和非胸腺肽α1组患者根据确诊严重脓毒症后第1天淋巴细胞计数分为叁个亚组：≥1.00×109/L亚组,0.50-1.00×109/L亚组和≤0.50×109/L亚组。5.体外实验方案(1)严重脓毒症患者的外周血单个核细胞分离分别抽取12例严重脓毒症患者血液4m1于抗凝真空采血管中,加等体积磷酸缓冲盐溶液稀释,另加3m1人Ficoll分离液至离心管中,然后将稀释后的血液迭加到Ficoll分离液上层。将离心管在水平离心机中离心,2000转/min离心30min,取出离心管,管内液体分为3层,用吸管取出中层含有外周血单个核细胞的Ficoll液,放入另一离心管中,再加等体积磷酸缓冲盐溶液稀释后再离心,1000转/min离心10min,弃去含有血小板的上层液,离心管中沉淀物即为外周血单个核细胞。(2)胸腺肽α1对脂多糖刺激外周血单个核细胞分泌肿瘤坏死因子α的影响将含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基平均分成3组：对照组、脂多糖组和脂多糖+胸腺肽a1组,在脂多糖+胸腺肽α1组中加入胸腺肽a1使其浓度达到200μg/ml,对照组和脂多糖组分别加入等体积磷酸缓冲盐溶液,每一组培养基中均加入外周血单个核细胞使其浓度达到106个细胞/ml,然后将3组培养基均置于37℃5% CO2培养箱中培养8小时。结束后,脂多糖组和脂多糖+胸腺肽a1组分别加入含脂多糖的磷酸缓冲盐溶液,使脂多糖终浓度为10μg/ml,对照组加入等体积磷酸缓冲盐溶液,继续培养6小时。结束后,分别取各组细胞培养上清液,用ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α的浓度。6.统计方法全部数据用SPSS 19.0进行统计分析,对计量资料进行正态性检验,成正态分布者用均数±标准差(x±s)表示,采用两独立样本均数的t检验；呈偏态分布者用中位数与四分位数表示[M(QR)],采用两独立样本的mann-whitney U秩和检验；分类变量用频率表示,采用x2检验；患者的生存时间用Kaplan-Meier分析并使用log-rank进行检验；肿瘤坏死因子α的浓度比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。以上检验均以P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.一般资料244例患者纳入本研究,其中胸腺肽a1组127例,非胸腺肽α1组117例患者,胸腺肽a1组与非胸腺肽α1组两组患者的性别、年龄比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)、确诊严重脓毒症后第1天虽然胸腺肽a1组患者APACHEII评分、SOFA评分高于非胸腺肽α1组、淋巴细胞计数低于非胸腺肽a1组,但两组比较,差异也均无统计学意义(均P>0.05),根据淋巴细胞计数分层后,两组中各亚组间比较,以上指标差异也均无统计学意义(均P>0.05)。2.患者预后比较胸腺肽a1组与非胸腺肽α1组患者28天死亡率分别为42.5%、50.4%,两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组中淋巴细胞计数≥1.00×10札亚组和0.50-1.00×109/L亚组患者的28天死亡率比较,差异也均无统计学意义(均P>0.05),但在淋巴细胞计数≤0.50×109/L亚组,胸腺肽α1组患者28天死亡率显着低于非胸腺肽a1组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.患者生存时间比较胸腺肽a1组与非胸腺肽a1组患者生存时间比较,差异无统计学意义(log-rank检验,P>0.05),两组中淋巴细胞计数≥1.00×109/L亚组和0.50-1.00×109/L亚组患者生存时间比较,差异也均无统计学意义(log-rank检验,均P>0.05),但在淋巴细胞计数≤0.50×109几亚组,胸腺肽α1组患者生存时间显着长于非胸腺肽α1组,差异有统计学意义(log-rank检验,P<0.05)。4. 严重脓毒症第7天与第1天各指标动态变化值胸腺肽α1组与非胸腺肽α1组比较胸腺肽α1组与非胸腺肽α1组APACHEII评分在诊断严重脓毒症后第7天均显着低于第1天(均P<0.05),胸腺肽α1组比非胸腺肽α1组降低更显着(P<0.05),胸腺肽a1组SOFA评分在诊断严重脓毒症后第7天显着低于第1天(P<0.05),非胸腺肽α1组SOFA评分在诊断严重脓毒症第7天虽低于第1天,但差异无统计学意义(P>0.05),胸腺肽α1组与非胸腺肽α1组SOFA评分变化值比较,差异无统计学意义(P>0.05),胸腺肽α1组与非胸腺肽α1组淋巴细胞计数在诊断严重脓毒症后第7天均显着高于第1天(均P<0.05),但胸腺肽α1组比非胸腺肽α1组变化更显着(P<0.05)。5.体外实验结果对照组、脂多糖组和脂多糖+胸腺肽al组叁组中肿瘤坏死因子α的浓度比较,差异有统计学意义(P<0.05),脂多糖+胸腺肽α1组肿瘤坏死因子α的浓度显著高于对照组与脂多糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。脂多糖组肿瘤坏死因子α的浓度也显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论1.胸腺肽αl可以显着降低淋巴细胞计数≤0.50×109/L的严重脓毒症患者的28天死亡率,延长患者的生存时间；2.胸腺肽α1能够显着降低严重脓毒症患者的APACHEII评分、SOFA评分,提高患者的淋巴细胞计数,改善患者的病情；3.胸腺肽α1能够显着改善严重脓毒症患者的免疫功能。
陈军, 刘艳艳, 张明, 温振杰, 刘建凌[10]2016年在《胸腺肽α1对脓毒症脑病大鼠脑组织TNF-α的影响》文中研究指明目的探讨胸腺肽α1对脓毒症脑病大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响。方法盲肠结扎穿刺法制造SD大鼠脓毒症模型,根据神经行为学评分判定脓毒症脑病(septic encephalopathy,SE)大鼠16只,随机分为SE实验组8只,SE对照组8只,另取有脓毒症无SE症状的8只大鼠作为非SE对照组。SE实验组大鼠给予皮下注射胸腺肽α1,其他两组注射等量生理盐水。评估大鼠的神经行为学评分、水迷宫平均逃离潜伏期,观察脑组织病理变化并用ELISA方法测定脑组织中TNF-α的含量。结果 SE实验组较SE对照组神经行为学评分升高,水迷宫平均逃避潜伏期缩短,脑组织TNF-α表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论胸腺肽α1可改善SE大鼠神经行为学评分及神经系统功能,降低脑组织中TNF-α表达水平,减轻脓毒症脑病对机体的损害。
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[10]. 胸腺肽α1对脓毒症脑病大鼠脑组织TNF-α的影响[J]. 陈军, 刘艳艳, 张明, 温振杰, 刘建凌. 中国现代医药杂志. 2016
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