（2.西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）
【基金项目】凉山州科技局应用技术研究与开发项目（ZEYY201472-1）
【摘要】目的：观察劳伤药乙醇浸膏对佐剂性关节炎（AA）大鼠滑膜病变及滑膜细胞基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响，探讨其治疗RA可能的作用机制。方法：60只SD大鼠随机分成6组：空白组，模型组，尼美舒利组，劳伤药高、中、低剂量组（分别用劳伤药A、B、C组表示。下同），建立AA大鼠模型，给药28天后处死大鼠，HE 染色观察踝关节滑膜组织形态学变化，酶联免疫吸附法测定大鼠血清炎性因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、NO、PGE2）含量，免疫组化法检测滑膜组织中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。结果：与模型组比较，劳伤药组(5g/kg) 明显减轻滑膜细胞的增生，减少滑膜层和滑膜下层淋巴细胞浸润，明显降低AA大鼠血清中IL-1β、IL-6 、TNF-α、NO、PGE2的含量和升高IL-10的含量，降低关节滑膜组织MMP-2、MMP-9的蛋白含量。结论：劳伤药可显著改善AA大鼠的滑膜病变，通过下调滑膜组织MMP-2、MMP-9的蛋白表达。
【关键词】劳伤药；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9
劳伤药，即彝药汝无糯鸡，《彝药志》：“性平，味苦微麻。清热解毒，活血祛瘀，舒筋止痛，通利关节，治疗……风湿性关节炎、劳伤腰痛。”凉山民间彝医常以之单用，或配伍治疗类风湿性关节炎（RA）。关节软骨退变是RA患者的特征，多数研究认为，软骨细胞赖以生存的细胞外基质 (Extracellular matrix, ECM) 过度降解与关节软骨的退行性改变密切相关，基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase MMPs)对ECM的降解是RA 患者关节破坏的必要环节[1, 2]，其中，MMP-2、MMP-9是水解ECM导致关节破坏的关键酶。本实验拟通过研究劳伤药对AA大鼠MMP-2与MMP-9的影响，初步探讨其治疗RA的作用机理。
1 材料与方法
1.1试验药物 劳伤药，经鉴定为金粟兰科植物海南草珊瑚Sarcandra hainanensis (Pei)Swamy et Bailey的全草。取药材粗末3kg，95%乙醇常温渗滤，减压浓缩并回收乙醇得总浸膏124g。尼美舒利胶囊，远大医药有限公司，H20010751，规格：100mg/粒。
1.2 动物 雄性SD大鼠，体重180g-220g，购于简阳达硕动物科技有限公司，合格证号：SCXK(川) 2014-189。
1.3试剂 试剂盒包括IL-1β：XL- Er0187；IL-6：XL-Er0196；IL-10：XL-Er0201；NO：XL-Er1184； PGE2：XL-Er0308；TNF-α：XL-Er0359；Abcam公司生产，北京永辉生物科技有限公司进口分装。MMP-2，兔多克隆抗体，批号：bs-0412R；MMP-9抗体，兔多克隆抗体，批号：bs-4593R，北京博奥森生物技术有限公司；弗氏完全佐剂，美国Sigma公司生产，批号：Lot SLBM2183V。
1.4仪器 酶标仪，Multlskan Mk3，赛默飞世尔仪器有限公司生产；转轮式切片机（徕卡-2016，德国）；TSJ-Ⅱ型组织脱水机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋机（常州郊区中威电子仪器厂）；数码摄像显微镜（BA400Digital麦克奥迪实业集团有限公司）等；图像分析软件Motic Images Advanced。
1.5 方法 将60只SD大鼠随机分成6组（同上），每组10只，于每只大鼠右后足趾皮内注射0.lml弗氏完全佐剂，建立AA大鼠模型。致炎后，各组大鼠按照设定剂量连续给药28天，空白组，模型组大鼠给予等体积蒸馏水。
1.5.1大鼠血清炎性因子含量测定 致炎后28 d，各组大鼠股动脉取血，3000r/min离心，取血清，采用Elisa法，严格按照相应试剂盒中说明书测定大鼠血清中炎性因子的含量。
1.5.2大鼠踝关节病理形态学的观察 致炎后28 d，大鼠股动脉取血脱臼处死，HE 染色、常规光镜下观察各组踝关节滑膜组织有无炎性细胞浸润、关节滑膜组织增生、关节腔隙变窄、软骨及骨组织侵蚀等现象。
1.5.3采用免疫组化染色SP法、平均光密度测定大鼠滑膜组织MMP-2、MMP-9蛋白基因表达。
1.5.4统计学方法 实验结果均以 ±S表示，采用SPSS13.0统计软件进行处理，用One-Way ANOVA进行分析。P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1劳伤药对AA大鼠血清IL-1β 、IL-6、 IL-10、TNF-α、N、PGE含量的影响
表1 劳伤药对大鼠血清炎性因子含量的影响（ ±S）
注：与空白组比较：** P<0.01，* P<0.05；与模型组比较：△△P<0.01，△P<0.05。（下同）
与空白组比，模型组明显升高AA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、PGE2的含量和降低IL-10的含量（P<0.01），与模型组比，劳伤药A、B组明显降低AA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、PGE2的含量和升高IL-10的含量（P<0.05）。
2.3劳伤药对AA大鼠踝关节病理形态学的影响
图1 关节滑膜组织病理改变(HE×100)
与模型组比较，劳伤药组大鼠组织部分切片滑膜细胞轻度增厚、纤维组织轻度增生、炎细胞不同程度浸润、巨噬细胞有轻度增生。
2.4劳伤药对AA大鼠关节滑膜组织MMP-2表达的影响
表3 劳伤药对大鼠滑膜组织MMP-2、MMP-9平均光密度的影响（ ±S）
与空白组比，模型组大鼠滑膜组织MMP-2及MMP-9蛋白含量明显升高（P<0.01），与模型组比，劳伤药A组大鼠滑膜组织MMP-2及MMP-9蛋白含量明显降低（P<0.01）。
3 讨论
RA关节的损伤主要来源于增生的血管翳对于关节软骨的侵袭，造成累及周身关节的增生性和侵蚀性滑膜炎。MMPs在RA关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用，RA患者滑液及滑膜细胞均有MMPs的高表达。MMP-2、MMP-9同属于MMPs家族的明胶酶类。MMPs在体内主要降解ECM，ECM失调可引起病理损伤而致关节炎。MMPs可降解RA的关节软骨与骨中的胶原，蛋白多糖及其他的ECM大分子，改善血管翳对软骨的侵袭 [3]。近年有学者发现RA患者的滑液及外周血中MMP-2、MMP-9水平均增高[4, 5]，Itoh等[6]对关节炎模型小鼠研究也证明MMP-2、MMP-9在关节炎的发病中起一定作用，吴振彪等观察到RA患者血清中MMP-2、MMP-9水平显著高于健康对照[7]。由于滑膜中 MMP-2、MMP-9是导致关节病理损伤的重要因素之一，因此，抑制 MMP-2、MMP-9的产生可作为治疗 RA的靶点。
本实验观察了劳伤药对AA大鼠滑膜组织MMP-2、MMP-9表达的影响。实验结果表明： AA大鼠滑膜细胞MMP-2、MMP-9表达明显增加，血清TNF-α、IL-1β、PGE2、NO水平明显升高，提示AA大鼠局部和全身出现较为严重的炎症反应。劳伤药组AA大鼠滑膜组织MMP-2、MMP-9的表达明显降低，血清中TNF-α、IL-1β、PGE2、NO含量均有不同程度降低。提示劳伤药能够下调滑膜细胞MMP-2、MMP-9的表达，从而阻止关节软骨基质的降解和破坏，抑制滑膜炎症的发生。这可能是劳伤药保护关节组织，治疗RA的作用途径之一，其详细机制有待深入研究。
参考文献：
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[7]吴振彪, 卢 宁.王彦宏,等．基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9与类风湿性关节炎关节破坏的关系. 中国免疫学杂志,2006,22(3):260-262.
论文作者:罗伦才1,童妍2,季小平1,李列平1,王利平1
论文发表刊物:《中医杂志》2016年12月
论文发表时间:2017/6/1
标签：劳伤论文; 大鼠论文; 关节论文; 组织论文; 血清论文; 含量论文; 软骨论文; 《中医杂志》2016年12月论文;