关键词： 呼吸链复合体；糖尿病；蓝绿温和胶电泳；肝脏线粒体；差异蛋白
Abstract：Decreased activity of the mitochondrial membrane complex may cause respiratory chain defects, which may lead to diabetes. Aming to explore the molecular pathogenesis of diabetes ， We used blue-native polyacrylamide gel electrophoresis to fraction the mitochondrial membrane complexes. In the study，we purified the liver mitochondria of normal and diabetic model mice by non-ionic detergent, fractioned the membrane complexes by non-denaturing gradient gel electrophoresis ，using 2D-PAGE to separate the subunits of these complexes.We used the differential protein spots to perform mass spectrometry analysis, finally，we identified four differential proteins, Cps1、Mdh2、Aldob、Otc，these mitochondrial membrane proteins in the process of diabetes production, suggesting that these mitochondrial proteins can provide a mechanism for diabetes Some references.
Key words：respiratory chain complex；diabetes；BN-PAGE； mitochondrial differential protein
0前言
糖尿病已逐步成为威胁人类健康的一种重大的疾病，目前在我国人口患病率已达3%。根据发病机制不同可以将糖尿病分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型糖尿病是由于胰岛素分泌不足或者不分泌导致的葡萄糖代谢途径受阻；Ⅱ型糖尿病是由于胰岛素抵抗即对胰岛素不敏感造成，95%以上的糖尿病患者都属于此型。近年来有研究表明，糖尿病的产生可能与线粒体功能失调相关[1,2]。线粒体是一种几乎存在于所有真核细胞中的富含膜结构的细胞器，在胞内众多代谢途径都发挥着重要作用，例如调节钙离子平衡，释放凋亡信号促进细胞凋亡等等，但其最主要功能还是为细胞生命活动提供能量[3]。葡萄糖代谢时，电子经由线粒体呼吸链被传递至氧分子，产生一些氧自由基，成为活性氧簇ROS（reactive oxygen species）。正常生理状态下，ROS会被胞内或胞外的抗氧化系统清除，但在高血糖环境下（糖尿病患者），线粒体中过多生成的氧自由基可激活多元醇途径，又能够促进ROS的生成，形成恶性循环[4]。由于线粒体的代谢紊乱导致ROS过量，ROS能与脂质，蛋白或DNA分子结合，引起细胞毒性。除此之外，ROS还能激活体内的一系列应激信号通路，发生氧化应激的组织损伤[5]，其中就包括胰岛细胞的损伤，引发胰岛素抵抗，导致糖尿病产生。许多线粒体病例如糖尿病、衰老、神经退行性疾病等，它们的共同特征都表现为线粒体膜复合体活性下降，从而引发呼吸链缺陷。基于此，可对线粒体膜复合体进行分离研究，从分子水平上探索线粒体病的发病机制。膜蛋白疏水性强，且多以复合体形式存在，分子量较大，对它的分离不能采用传统的SDS-PAGE或2D-PAGE技术，基于此，1991年Schagger等建立了一种蓝绿温和凝胶电泳系统，最初被用来分离牛心线粒体的蛋白质复合物及其亚基[6]。现如今被广泛运用于线粒体膜、类囊体膜以及质膜蛋白复合体的研究。蓝绿温和胶电泳技术是基于分离蛋白复合体并保持复合体在体内的结构以及酶活性的目的发展起来的电泳技术，因此可采用非离子去垢剂来提高样品的溶解性，待样品溶解后，可加入阴离子染料考马斯亮蓝G250，膜蛋白表面由于被大量的G250占据而失去了疏水特性从而转换为可溶性蛋白体，同时G250可使膜蛋白带负电荷，由于蛋白表面的静电斥力增加从而大大降低了蛋白的聚集[7]。BN-PAGE分辨率比普通的SDS-PAGE要高的多，可分离10KDa~10MDa的蛋白[8]。BN-PAGE还可与其他电泳方法结合，进行2D-PAGE电泳以分离这些蛋白复合体的亚基。本研究则利用BN-PAGE辅以SDS-PAGE技术，分离正常小鼠与糖尿病小鼠肝脏线粒体膜蛋白复合体，找出糖尿病发生发展过程中差异蛋白，为糖尿病发生分子机制提供参考依据。
1.材料与方法
试验样本为正常小鼠和糖尿病模型小鼠。正常小鼠为C57BL/6小鼠，购买自中南大学湘雅二医院代谢综合征研究中心；糖尿病模型小鼠为LepR-/- C57BL/6小鼠，购买自南京大学动物研究中心。
1.1 提取完整肝脏组织线粒体
将120~500mg已剪碎洗净的肝脏组织快速置于匀浆器中，加入5ml预冷的Mito-Cyto buffer，研磨后将组织匀浆液转移至离心管中，4℃，1200rpm离心5min，收集上清液后4℃，1200rpm离心5min，再收集上清液，4℃，12000rpm离心10min后弃上清，线粒体沉降管底。加入0.2ml预冷的Mito-Cyto buffer，轻弹重悬沉降管底的线粒体，4℃，12000rpm离心10min后弃上清，线粒体沉降管底。用预冷的Mito-Cyto buffer按30ul/100mg组织的比例重悬线粒体沉淀，-80℃冷冻保存。
1.2 Bradford法测定线粒体蛋白浓度
将冷冻保存的线粒体重悬液解冻，12000rpm离心5min，加入60ul
8MUrea/0.2M Tris-base(pH 8)/4mM CaCl2于沉淀中，吹打混匀，变性溶解线粒体蛋白。稀释后准备三份最终浓度的稀释液平行样进行浓度测定。稀释液体积为200ul。 每份平行样均加入50ul蛋白染料，染色10min。分别用分光光度计测定各个平行样的OD值，在标准曲线上找到对应的浓度值，将平行样取浓度平均值再乘以样品稀释倍数即为线粒体蛋白浓度。
1.3 一向BN-PAGE
本试验采用单板夹芯式垂直电泳进行BN-PAGE。采用Amersham SG30梯度混合器灌制17×17cm，1mm厚度， 5%～15%非变性梯度聚丙酰胺分离胶和4%浓缩胶。分离胶制好后凝固过夜，次日进行浓缩胶覆盖。将提取的线粒体重悬液解冻，4℃，12000rpm离心5min，弃上清后加入35ul样品溶解缓冲液，混匀后加入10ul 10% DM，溶解10min后4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，向上清液中加入5ul甘油和考马斯亮蓝G-250，吹打混匀后上样电泳。电泳结束后去离子水脱色过夜，直至蓝色条带清晰显现为止。
1.4 二向SDS-PAGE
灌制17×17cm，1.5mm厚度15%浓度的SDS-PAGE。在干净切胶台上将一向BN-PAGE目的胶条整齐切下（宽约1cm），于50ml泡胶缓冲液中平衡2h ，将目的胶条缓慢平移进入胶板缝隙，直至胶条与上层浓缩胶贴合。先150V恒压1h，然后220V恒压约9~10h直至溴酚蓝迁移至分离胶底部。考马斯亮蓝染料染色过夜。去离子水进行脱色过夜。
1.5 胶内酶解
切割目的胶带（点），加入200ul 50%ACN/100mM NH4HCO3(pH 8.0)洗涤小胶块，真空冻干。加入100ul 10mM DTT/50mM NH4HCO3(pH 8.0)，56℃反应约1h。冷却至室温后加入100ul 10mM NH4HCO3(pH 8.0)，10min后弃液体，再加入200ul ACN，10min后弃液体，真空冻干。将5ul胰酶充分溶于45ul 10mM NH4HCO3(pH 8.0)中，加入胶块，37℃酶解过夜。次日加入60ul 60% ACN/5% FA于酶解后的胶块中，超声振荡约5in，3000rpm离心5min，收集上清液，真空冻干。
1.6 质谱检测与数据分析
采用串联质谱分析（qTOF），将QSTAR ELITE质谱仪串联在线Tempo nano MDLC液相色谱进行质谱检测。将检测数据进行搜库，采用MASCOT Daemon（version 2.2），搜库后的数据以dat文件格式被导入Scaffold中进行进一步整合、分析，可根据分析需要将相应的分析结果以Microsoft Excel形式输出。
2结果
2.1 一向BN -PAGE分离正常、糖尿病模型小鼠肝脏线粒体蛋白
在同等条件下分别提取正常小鼠和糖尿病小鼠线粒体，通过5%～15%梯度BN-PAGE分离胶分离到了5条主要的蛋白质复合物条带，电泳采用水稻叶绿体膜蛋白复合体作为marker。将正常小鼠标记为Y，糖尿病模型小鼠标记为O，相应上样量标记为Y150、O150。结果见图2.1。
图2.1 正常小鼠与糖尿病模型小鼠肝脏线粒体蛋白的BN-PAGE比较
2.2 二向BN/SDS-PAGE分离线粒体膜蛋白复合物亚基
通过BN-PAGE进行初步分离，呈现五条较深的复合体条带，初步预计为呼吸链复合体。因此，将第一泳道（左起）胶条12等分切割后胶内酶解，而后质谱检测。通过比较Y150和O150分离条带，并未发现显著差异，遂将第三、四条泳道（左起）胶条切割，分别进行2D-BN/SDS-PAGE，进一步分离解析蛋白复合体的亚基成分，图2.2和2.3显示二者的二向分离结果。
图2.2 正常小鼠肝脏线粒体蛋白2D-BN/SDS-PAGE
图2.3 糖尿病模型小鼠肝脏线粒体蛋白2D-BN/SDS-PAGE
从二向图可以看出，一向的线粒体蛋白复合体得到了很好的分离。图中圈出的蛋白点为二者的差异点，图中黑色圈圈出的差异点表示在此次分离比较实验中表现出差异，但在多次方法学重复实验中并不重复出现，而红色圈圈出的差异点则是三次试验重复出现。
2.3 质谱检测数据
将重复出现的两个差异区域切割后进行胶内酶解，而后串联质谱检测鉴定，将这2个2D-BN/SDS-PAGE差异区域涵盖的蛋白鉴定结果经过搜库后导入Scaffold软件中，最终在差异区域Y1中锁定了3个在糖尿病产生过程中肝脏组织可能发生变化的候选蛋白，相应的在Y2中锁定了5个候选蛋白。这些蛋白的具体信息如表2.1、2.2和2.3所示。
表2.1 2D-Y1与2D-Y2的Mascot搜库蛋白数据
Region Y1 Y2
Protein count 3 5
Mitochondrial protein 1 3
表中，在Y1差异区域中重复鉴定出了3个蛋白，其中含有1个线粒体蛋白，在Y2差异区域中共鉴定出5 个蛋白，包括3个线粒体蛋白。
表2.2 经过Scaffold整理后的2D-Y1蛋白数据
Accession Protein description Number of unique peptides
CPSM_RAT Carbamoyl-phosphate synthase 13
TERA_RAT Transitional endoplasmic reticulum ATPase 19
ENPL_RAT Endoplasmin 9
表2.3 经过Scaffold整理后的2D-Y2蛋白数据
Accession Protein description Number of unique peptides
MDHM_RAT Malate dehydrogenase 6
OTC_RAT Ornithine carbamoyltransferase 7
ALDOB_RAT Fructose-bisphosphate aldolase B 6
HAOX2_RAT Hydroxyacid oxidase 2 29
AK1D1_RAT 3-oxo-5-beta-steroid 4-dehydrogenase 5
3讨论与小结
在进行一向BN-PAGE过程中，为了确定最佳线粒体蛋白上样量，将定量后的蛋白按照梯度（150ug、200ug、250ug、300ug）进行上样，发现200ug、250ug、300ug浓度所呈现的分离结果都有不同程度的蛋白聚集情况，150ug浓度进行上样后，条带清晰，分离效果较好，因此后续实验均采用150ug浓度进行上样。
两组试验第一个差异点区域均鉴定出线粒体上的呼吸链复合体Ⅴ（ATPase）的α、β、γ和ε亚基，说明此蛋白点是由1D-BN-PAGE的复合体Ⅴ分离而来；第二个差异点区域包括COX1(Cytochrome c oxidase subunit 1)，它是呼吸链复合体Ⅳ的一个亚基，证明此蛋白点是由1D-BN-PAGE的复合体Ⅳ分离而来。通过分析这些差异点的数据我们可以证实蓝绿温和胶电泳技术能够较好的分离出线粒体呼吸链的呼吸链复合体以及这些复合体的亚基，是一种分离蛋白复合体的可靠方法。
经过Scaffold进一步处理分析后，这些蛋白为多肽覆盖率较高的蛋白，提示这些蛋白在差异点蛋白中含量较高，可进行后续分析。在2D-BN/SDS-PAGE的Y1差异点中，有三个蛋白重复出现。Cps1(Carbamoyl-phosphate synthase)是存在于线粒体中的参与尿素循环代谢的关键酶，结合N-乙酰-谷氨酸酯后被激活，将过量的氨排出胞外，具有细胞解毒作用[9]； Tera（Transitional endoplasmic reticulum ATPase）催化ATP水解，为内质网膜泡出芽提供能量[10]。在2D-BN/SDS-PAGE的Y2差异点中鉴定出12个非冗余蛋白，有5个在三次结果在重复出现。Mdh2（Malate dehydrogenase）是存在于线粒体中参与三羧酸循环的酶类，在辅因子NAD+作用下催化苹果酸氧化成草酰乙酸，在三羧酸循环中发挥着重要作用；Aldob（Fructose-bisphosphate aldolase B）是糖酵解途径的衔接酶，催化1,6-二磷酸果糖裂解为磷酸二羟基丙酮和3-磷酸甘油醛，存在于细胞内的多种细胞器内，参与众多细胞应答；Haox2（Hydroxyacid oxidase 2）是存在于过氧化物酶体中的羟基氧化酶，在核黄素单核苷酸辅助下将羟基乙酸氧化成过氧化氢；Otc（Ornithine carbamoyltransferase）存在于线粒体内膜和基质中，参与调节胞内尿素循环、铵离子平衡、氨基酸合成以及应答于胰岛素信号通路等生物学进程；Akr1d1(3-oxo-5-beta-steroid 4-dehydrogenase)是存在于胞浆中的调节胆酸、脂类和酮类代谢的氧化还原酶类。
这些重复出现的线粒体蛋白多为参加体内大分子代谢通路的酶类，提示线粒体随着糖尿病的发生发展，一些催化糖、脂和蛋白质代谢的酶类活性减弱，无法或很难与其他蛋白酶形成复合体，因而不被同时分离,在正常小鼠与糖尿病模型小鼠肝脏线粒体的2D-BN/SDS-PAGE结果中显现出差异。鉴定的非线粒体蛋白并不能被绝对定义为杂蛋白，因为即使是提取纯度很高的线粒体，不论进行组学研究还是温和胶研究，亦或其他的研究，最终都会或多或少的鉴定出非线粒体蛋白[11]，这些非线粒体蛋白有可能含有杂蛋白，也有可能是与线粒体蛋白相互作用而被共同分离，具体情况有待进一步分析。
参考文献
1.Abdul-Ghani, M. A. and R. A. DeFronzo (2008). "Mitochondrial dysfunction, insulin resistance, and type 2 diabetes mellitus." Curr Diab Rep 8(3): 173-178.
2.Leahy, J. L. (2010). "Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus." Arch Med Res 36(3): 197-209.
3.Reifschneider, N.H., et al., Defining the mitochondrial proteomes from five rat organs in a physiologically significant context using 2D blue-native/SDS-PAGE. J Proteome Res, 2009. 5(5): p. 1117-32.
4.Brownlee, M. (2010). "The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism." Diabetes 54(6): 1615-1625.
5.Droge, W. (2008). "Free radicals in the physiological control of cell function." Physiol Rev 82(1): 47-95.
6.Schagger, H. and G. von Jagow, Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem, 1991. 199(2): p. 223-31.
7.Wittig, I., H.P. Braun, and H. Schagger, Blue native PAGE. Nat Protoc, 2006. 1(1): p. 418-28.
8.Schagger, H., W.A. Cramer, and G. von Jagow, Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem, 1994. 217(2): p. 220-30.
9.Pekkala, S., et al., Structural insight on the control of urea synthesis: identification of the binding site for N-acetyl-L-glutamate, the essential allosteric activator of mitochondrial carbamoyl phosphate synthetase. Biochem J, 2009. 424(2): p. 211-20.
10.Zhang, L., et al., Isolation and characterization of the principal ATPase associated with transitional endoplasmic reticulum of rat liver. J Cell Biol, 2004. 127(6 Pt 2): p. 1871-83.
11.Reifschneider, N.H., et al., Defining the mitochondrial proteomes from five rat organs in a physiologically significant context using 2D blue-native/SDS-PAGE. J Proteome Res, 2009. 5(5): p. 1117-32.
论文作者:汪茗
论文发表刊物:《医师在线》2019年第18期
论文发表时间:2019/12/6
标签：线粒体论文; 蛋白论文; 复合体论文; 小鼠论文; 糖尿病论文; 电泳论文; 差异论文; 《医师在线》2019年第18期论文;