刘亚光[1]2002年在《大豆灰斑病菌毒素组分、致病性及其诱导抗性的研究》文中认为本论文在研究大豆灰斑病菌产毒条件的基础上，分离出大豆灰斑病菌的粗毒素，用生物测定的方法明确了所提取的粗毒素的致病作用，并用粗毒素进行了抗性鉴定。然后又进一步对10个生理小种粗毒素组分进行了鉴定，分析了10个生理小种粗毒素的蛋白组分与其生理小种田间致病力之间的关系，为进一步明确灰斑病菌的毒素是致病因子提供了更确凿的依据。在以上的研究基础上，又进一步地研究了大豆灰斑病菌及其粗毒素以及化学因子等对大豆叶片内与抗病性密切相关的生化物质的诱导作用，旨在探索大豆灰斑病菌及其毒素的生化致病机制与诱导抗性机制。本研究的主要结论如下： 1 大豆灰斑病菌粗毒素的提取及致病活性的测定 大豆灰斑病菌的最佳产毒条件是利用Czapek培养基，以蔗糖作为碳源，糖含量为3％，将培养基的pH调到6.0，接种新鲜菌丝叁块，在25～28℃黑暗条件下静止培养25～27天。用甲醇、乙醇、丙醇和硫酸铵等两种沉淀大分子物质的方法，均提取到使大豆叶片产生典型病斑和致萎毒性的化合物，且该粗提物确实能引起大豆感病品种产生典型的病斑症状，由此可以肯定从培养滤液中提取的粗提物符合毒素的概念，可将其称为大豆灰斑病菌所产生的粗毒素。同时灰斑病菌的粗毒素使感病品种叶片产生典型的灰斑病病斑，而抗病品种则表现出对粗毒素的明显抗性，从而可进一步说明灰斑病菌的次生代谢产物——粗毒素是大豆灰斑病的致病因子之一。其中以二倍体积的甲醇来沉淀大豆灰斑病菌毒素最为简单、快速且彻底。 其中离体叶片萎蔫法可以作为测定灰斑病菌粗毒素含量和致病活性的定量生测方法。另外叶片针刺法和幼苗法均体现出所提取粗毒素的致病性及其对抗感品种的毒性作用与田间接种结果的一致性。通过叶片萎蔫法验证了1～10号生理小种粗毒素的致病性与田间接种鉴定抗感品种的结果符合率高达91％。本研究还利用叶片针刺法，观察了大豆灰斑病菌粗毒素对不同作物产生的致病活性，初步的结果表明大豆灰斑病菌粗毒素属于非寄主选择性毒素。 2 大豆灰斑病菌粗毒素组分及特性的研究 灰斑病菌不同生理小种粗毒素中的蛋白质含量和多糖含量的差别，反应了各生理小种所产生毒素是不同的。粗毒素中蛋白质组分及其含量高低在灰斑病菌毒素的致病作用中起主要作用，多糖组分在灰斑病菌毒素的致病作用中也起到一定的致毒作用。粗毒素对热有一定的敏感性，不同生理小种的粗毒素经6NHCl处理后，因蛋白质组分变性失活和多糖组分的彻底水解而丧失全部的生物活性。SDS—PAGE的电泳图谱说明大豆灰斑病菌粗毒素蛋白质大多数都是糖蛋白。此外，10个生理小种田间致病力聚类结果与10个生理小种(除3、8号小种)中的8个生理小种的粗毒素的蛋白质聚类结果相符合，说明粗毒素确是引起大豆发生灰斑病的重要致病因子之一。 3 大豆灰斑病菌及其粗毒素对大豆叶片内几种生化物质的诱导作用 灰斑病菌粗毒素浓度较低时发挥激发子的作用，而浓度达到一定高度时则发挥毒性作用。不同的生理小种的粗毒素的诱导作用存在差异。东北农业大学博士学位论文 摘要 同一生理小种的粗毒素与灰斑病菌对大豆叶片内PAL活性、总多酚类含量、总黄酮含量以及几丁质酶活性等几种生化指标均表现出相似的诱导作用，由此可推断粗毒素是诱导大豆叶片内的PAL活性、总多酚含量、总黄酮含量以及几丁质酶活性产生变化的主要生物因子，只是二者在对抗性不同的大豆品种的诱导速度及强度上存在一定的差异。其一：粗毒素对抗病品种的PAL活性和总黄酮含量的诱导速度比灰斑病菌快，而粗毒素对感病品种的PAL活性、总多酚含量、总黄酮含量和几丁质酶活性的抑制作用则比灰斑病菌出现的早，由此可推断粗毒素是大豆感病品种发病的重要致病因子；其二：粗毒素对抗病品种叶片内PAL活性、总黄酮含量和几丁质酶活性的诱导作用比灰斑病菌强。其叁：灰斑病菌及其粗毒素对抗病品种的PAL活性和几丁质酶活性的诱导作用强于对感病品种的诱导作用，可推断灰斑病菌及其粗毒素是使大豆品种产生抗性反应的生物激发子，或者说灰斑病菌及其粗毒素对抗病品种主要起激发子的作用而对感病品种则主要起抑制子的作用。4大豆产生抗住伤质的诱导因于 乙烯利、草酸和水杨酸这叁种化学因子同灰斑病菌粗毒素一样，分别在各自适合的浓度下均对大豆叶片内的总多酚含量、总黄酮含量、PAL活性和几丁质酶活性等生化指标具有诱导作用。其中水杨酸作为外源化学因子在相同浓度诱导下与粗毒素对抗感品种的诱导作用是一致的。可见，无论是生物因子还是化学因子均能诱导大豆体内抗性物质的变化，而且具有相似的生化诱导抗性机制。
原丽[2]2014年在《禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）毒素对野生大豆幼苗根茎的影响》文中研究说明镰刀菌是一种分布广泛的土壤习居菌，可侵染多种植物，使植株萎蔫干枯，给农业生产带来损失，其中Fusarium graminearum Schw.(禾谷镰刀菌)不仅可以侵染多种农作物的不同部位引起苗腐、根腐、穗腐等多种病害，造成产量损失，还能在侵染过程中产生真菌毒素，给人和动物的健康带来威胁。随着耕作制度的改革和全球气候的变暖，禾谷镰刀菌侵染范围逐步扩大，对农作物的危害越来越大。有研究报道禾谷镰刀菌是引起大豆根腐病的病原菌之一，其分泌的毒素对大豆的生长发育有一定的抑制作用，而野生大豆又是栽培大豆的野生近缘种，具有良好的抗逆性和抗病性。因此本文以禾谷镰刀菌为材料，比较了不同提取方法提取的禾谷镰刀菌毒素的活性，筛选出提取毒素效果较好的活性炭吸附提取法；研究了禾谷镰刀菌毒素对野生大豆(X11)幼苗的毒害作用；毒素胁迫下野生大豆(X11)幼苗代谢活性变化以及对野生大豆(X11)根尖细胞凋亡的诱导作用，并利用已克隆植物NBS类抗病基因的保守序列设计引物，进行野生大豆抗病基因同源序列的分析检测。主要研究结果如下：F. graminearum在PD和PSC两种培养条件下，其培养滤液、菌丝提取液对大豆品种的胚根生长均有一定的抑制作用，PD培养液对禾谷镰刀菌菌丝的生长和产毒比PSC培养液更有利。F. graminearum PD培养滤液对不同大豆品种胚根生长的抑制率有明显差异，毒素滤液有可能用于大豆品种对根腐病的抗性鉴定。通过对6种不同方法所提取的F. graminearum毒素生物活性比较，表明活性炭吸附法所提取毒素对大豆胚根生长的抑制率较高，可采用活性炭吸附法进行其毒素的提取。毒素具有很强的热稳定性。F. graminearum毒素对野生大豆幼根有很强的毒害作用，处理后对野生大豆胚根生长及恢复生长的能力有明显的抑制作用，可使根部产生类似病菌侵染引起的症状。毒素处理后可降低大豆根系活力，影响根系的正常吸收代谢。F. graminearum毒素处理后，前期24h内野生大豆幼苗根茎经25%和50%毒素处理后蛋白质含量下降，叶片中的蛋白质含量前期变化较平稳，24h后蛋白质含量上升幅度较大，毒素滤液处理的根茎叶都呈现出先升高后下降的现象。毒素处理后幼苗体内MDA含量基本上呈上升-下降趋势。PPO和PAL活性在毒素处理后的野生大豆根茎叶中都有所增加，并且呈双峰型变化趋势，POD活性呈先升高后下降，呈曲折的上升趋势。毒素处理后野生大豆根尖细胞死亡率随着毒素浓度的增加而增加，说明禾谷镰刀菌毒素有诱导野生大豆根冠细胞凋亡的作用。适当浓度的禾谷镰刀菌毒素胁迫可诱导大豆根尖细胞发生程序性细胞死亡，经禾谷镰刀菌毒素处理12h后，DNA出现降解， DNAladder条带的亮度和宽度也随着处理强度的增加逐渐减弱，最终降解为小片段。25%浓度的毒素处理12h是禾谷镰刀菌毒素胁迫诱导野生大豆根尖产生凋亡细胞的最佳时期。通过毒素诱导后，从野生大豆DNA和RNA中均能扩增出NBS抗病基因条带，说明野生大豆中含有潜在的抗病基因。
张淑珍[3]2002年在《大豆疫霉根腐病菌毒素及其诱导抗性机制的研究》文中进行了进一步梳理本文对大豆疫霉根腐病菌毒素的产毒条件、提取、毒性鉴定、组分分析及其对大豆根部和叶片超微结构的破坏和抗感不同品种用毒素处理后抗性酶及植保素生化指标的动态变化进行了较系统的分析和研究，并对大豆抗毒素的生理生比机制进行了探讨。结果如下： (1)筛选出适合培养大豆疫霉根腐病菌1号生理小种的液体培养基为Fries培养基，产毒的最适pH值为6～7之间，最适培养条件为25～30℃、静止、明暗交替下培养10天。 (2)大豆疫霉根腐病菌毒素的提取采取弱极性的有机溶剂萃取的方法比较理想，尤其是用乙醚萃取。粗提物经不断的萃取，可以得到淡黄色的粗结晶。 粗提的该毒素用切根苗和离体叶片法进行生物活性测试，前者产生了与用病原菌下胚轴接种法类似的症状，离体叶片法在叶片上出现了小斑。 抗感不同的大豆品种用稀释不同浓度的毒素进行最佳浓度筛选，发现稀释100倍浓度(糖含量为21.518μg／ml，蛋白质含量为24.079μgml)的毒素可以产生与病原菌下胚轴接种法相同的症状，同时也说明该毒素是—种非寄主专化性毒素。 初步证明该毒素的主要成分是一种糖蛋白，并用蒽酮比色法和牛血清白蛋白法测定了稀释不同浓度的毒素中蛋白和糖的含量。 该毒素用蛋白水解酶和多糖水解酶水解后发现，蛋白的毒性活性要大于糖。 该毒素用硅胶板薄层层析法可以分离出5种组分，其Rf值分别为0.23，0.56，0.59，0.67，0.78，并依次编号为1、2、3、4、5号组分，各组分的致病力不同。致病力最强的是5号组分，其大部分叶片都呈现了病斑，并且整个叶片出现了水浸状，部分已失绿；其次是4号，虽然病斑数较少，但整个叶片也出现了水浸状，部分也已失绿；2号与3号相近，叶片上也有少许病斑，但整个叶片还较完好；致病力最弱的是1号组分，几乎无病斑。可见，在疫霉根腐病菌毒素用薄层层析分离的5种组分中，Rf值相对较大，即分子量相对较小的组分致病力是最强的。随着分子量的相对增加，毒素的致病力也依次减弱。 (3)在适宜浓度毒素(稀释100倍)处理时，72小时后：抗感品种根部结构的差异也较明显，主要表现在线粒体的结构上。感病品种合丰25根部线粒体绝大多数都出现了空泡化，而抗病品种绥农10虽然细胞结构上有质壁分离现象发生，但细胞内部的细胞器还都较完整。抗感品种在同等浓度毒素处理72小时后叶片内部结构有较大的不同。抗病品种绥农10叶片内部结构基本上比较完整，而感病品种合丰25叶片内部结构已经发生了较大的变化，叶绿体嵴变形，基粒片层已经基本消失，叶绿体膜已经解体，线粒体空泡化更为严重。 (4)在适宜浓度毒素(稀释100倍)处理时，抗病品种根中PAL活性在整个病程中几乎都是高于对照，茎中次之，叶中最不敏感，而感病品种在整个病程PAL活性虽然在某些阶段有一定的升高，但幅度不大，在病程其它阶段PAL下降幅度远大于升高幅度。博士学位论文 大豆疫霉根腐病菌毒素及其诱导抗性机制的研究 东北农业大学抗病品种总多酚含量在病程的大部分阶段都高于对照，根、茎中比叶中敏感，叶中黄酮类物质的增加幅度要大于根和茎。 抗病品种根中PPO和茎中R3D对毒素的反应最敏感，在整个病程中抗病品种根中PPO活性和茎中PODthe都有较大的升高，而感病品种相反。由此可见，酚氧化酶在大豆抗疫霉根腐病毒素中的作用主要是通过酶活性的提高来加强酚类物质的氧化，从而起到抗毒素作用。 在本实验中所用的是大豆疫霉根腐病菌毒素处理抗感不同品种，但在结果中我什1可以看到，抗病品种的几丁质酶活性较对照要高，感病品种在病程的个别阶段也出现了几丁质酶被檄活的现象。这说明，大豆疫霉根腐病菌毒素在诱导植株体内的几丁质酶活性上具有与病原菌相似的功效，同时也可以推断，几丁质酶活性的增高，其作用并不一定是单纯破坏病原菌细胞壁的结构，而有可能是起到了诱发其它防御酶启动的一个信号传递。
黄小兰[4]2017年在《柑橘胶孢炭疽菌毒素的粗提取及致病性研究》文中指出炭疽病是严重影响柑橘采后贮藏的重要病害,半知菌亚门炭疽菌属的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为柑橘炭疽病的主要致病菌,有较强的致病能力,能引起贮藏期间的柑橘产生病斑甚至腐烂,造成严重的经济损失。目前国内对柑橘炭疽病的研究主要集中于病原菌的生长特性及其拮抗菌筛选等方面,对于胶孢炭疽菌毒素致病性的报道较少。国外有关胶孢炭疽菌毒力大小的研究指出环境p H、病原菌的分泌蛋白和编码与致病力有关的基因是病原菌的毒力因子,改变p H等条件会影响病原菌的致病力。然而,这些报道主要集中在毒素的产生条件、结构分析和是否具有寄主专化性等。本试验研究了胶孢炭疽菌的最佳产毒培养基以探究最适产毒因子;毒素的粗提取以及粗毒素对柑橘显微结构以及生理代谢的影响以探究毒素的致病性;对羟基苯甲酸对采后柑橘的抗性诱导以探究柑橘贮藏的新方式等。主要研究结果如下:1、体外培养胶孢炭疽菌,通过改变培养基的类型和成分来研究最佳产毒培养基。研究表明:不同类型的培养基中察氏培养基产生的毒素能在柑橘上形成较大病斑;改变察氏培养基中碳源、氮源和无机盐的种类可以影响毒素的生成,最佳的碳源为果糖,氮源为硝酸钠,无机盐为磷酸氢二钾;通过四因素四水平正交实验研究产毒的最适培养条件,分别为温度30℃,时间19天,转速100 r/min,p H为8。在此条件下产生的病斑直径为5.39±0.22 mm。2、在最适产毒培养基的基础上,通过比较硫酸铵分级沉淀法和不同极性有机溶剂浸提法来研究胶孢炭疽菌毒素的粗提取,得出甲醇浸提后得到的上清液能产生最大的病斑。经基本化学本质分析得出粗毒素含有的主要成分为酮糖、蛋白或氨基酸等极性物质。高温和改变p H值均会影响粗毒素的活性。3、将得到的粗毒素配制成不同的浓度以研究粗毒素对柑橘果皮显微结构的影响,得出随着粗毒素浓度的增加以及培养时间的延长,粗毒素对柑橘果实细胞造成的伤害也越大,果皮细胞呈现出皱缩和破裂的形态。其原因可能是粗毒素中含有能够水解细胞壁的相关酶类以及某些致病成分。4、研究粗毒素对柑橘生理代谢的影响可知:胶孢炭疽菌粗毒素能使柑橘果实产生典型的病斑症状,且使丙二醛含量显着增高,细胞壁成分含量降低。当毒素浓度较低时,果实病斑直径与多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、类黄酮以及木质素含量呈正相关;与纤维素、半纤维素和果胶含量呈负相关。毒素浓度增高时,果实机体及防御酶系统遭到破坏,酶活急剧下降。胶孢炭疽菌粗毒素能影响柑橘果实生理代谢,引起果实发病,最终导致病斑的形成。由此证明毒素在胶孢炭疽菌对柑橘的致病过程中起到重要作用。5、对羟基苯甲酸能够诱导采后柑橘果实的抗性,延长柑橘保质期。试验中可知对羟基苯甲酸对采后柑橘炭疽病病原菌有较强的抑菌活性,浓度越高,对病原菌的抑制作用越强。经对羟基苯甲酸处理的柑橘果实中,抗性相关酶活性升高,丙二醛含量下降。并且对羟基苯甲酸诱导的抗性相关酶在整个试验过程中维持较高的活性。对羟基苯甲酸处理对采后柑橘炭疽病病原菌有较强的抗菌作用,能提高柑橘果实相关抗性酶活性以及抑制膜脂过氧化反应,诱导其果实抗性。对柑橘采后贮藏保鲜具有重要意义。
董友磊[5]2009年在《番茄灰霉病菌的分离与毒素的提取、纯化及生物测定》文中研究指明由灰葡萄孢菌侵染引起的番茄灰霉病是当前番茄生产上重要的世界性病害,尤以设施栽培条件下发生较重。番茄灰霉菌的寄主很广,已报道的寄主至少有235种,它能危害多种粮食作物、经济作物、蔬菜和观赏植物。从番茄、草莓、莴苣上采集了30个灰霉菌菌株,对其进行了形态鉴定、ITS序列比对及系统发育树的构建。结果表明,ITS区长度基本一致,约为500bp。通过序列比对,所获得的菌株序列与基因序列库中已知灰霉菌序列高度同源。我们对采集的30个灰霉菌菌株进行了灰霉菌株致病力的测定。结果表明,成株期病情指数从12.9到89.6,苗期从4.4到80.6,各菌株在致病力上存在显着差异。BC-5、BC-9、BC-16和BC-21四个菌株表现出较高的病情指数,分别为69.8,52.4,50.0和63.1。毒素是植物病原物的次生代谢产物,在病原物致病过程中有重要作用。研究毒素能够进一步明确病原物致病因子,为解析病原物的致病机理提供依据。灰葡萄孢(Botrytis cinerea)在液体培养时可以产生毒素。病菌培养滤液经乙酸乙酯萃取后旋转蒸发,可得到毒素粗提液。本研究选用4个致病力较强的灰霉菌株BC-5、BC-9、BC-16和BC-21,对其毒素粗提液进行提取和生物测定结果表明,毒素能使番茄幼苗产生萎蔫症状,随着毒素浓度的增大和处理时间的增长,番茄幼苗萎蔫越明显;菌株培养时间越长产生的毒素活性越强。因此灰葡萄孢毒素对番茄植株具有明显的毒害作用。本试验从培养液种类、培养时间等角度研究了影响病菌产生粗毒素的因子。明确了病菌较好产粗毒素的培养条件是:培养液为查彼培养液,培养温度为25℃,培养时间为14～21d,培养过程中不需要光照,需要振荡。毒素粗提液经薄层层析分离,发现毒素能产生2-6条层析带,Rf值从0.149到0.663。4个菌株中分别有一条Rf值相近的条带,表明可能是毒素的有效成分。本研究利用分子标记SSR对除BC-25以外的29个灰霉菌株进行了遗传多样性分析。7个SSR引物得到29条带,多态性条带比率为82.76%,通过UPGMA聚类分析,SSR标记将29个菌株分为3类。应用13个灰霉菌株对灰葡萄孢分生孢子的产生条件进行了研究。结果表明,随着ABA浓度的增大,菌核产生量越大。ABA对菌丝的生长速率影响不大。孢子形成培养基更有利于孢子的形成;不同培养基对菌核的产生影响不大。
胡颖慧[6]2012年在《唐菖蒲根腐菌粗毒素的致毒作用及抗病无性系筛选》文中认为唐菖蒲根腐病,又称枯萎病、干腐病。是由尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型(Fusarium oxysporum f. sp. gladioli)引起的维管束病害,主要危害唐菖蒲的球茎及根部,引起植株枯萎,已成为唐菖蒲栽培过程中发生的主要病害之一。目前控制该病害发生的主要措施是化学药剂防治及轮作换茬等方法,不但防治成本高、防治效果差且易导致病菌的抗药性,造成环境污染,因此培育抗病品种是经济有效的防治措施。然而唐菖蒲切花生产主要是以子球茎进行无性繁殖,品种退化严重,又缺乏有效的育种途径,因此通过离体培养筛选唐菖蒲抗根腐病无性系是新的快捷而有效的育种途径。本研究以唐菖蒲主栽品种货车(Gladiolus'Wagon')和超级玫瑰(Gladiolus'Rose Supreme')为试材,在分离、纯化及培养唐菖蒲根腐病菌的基础上,优化病菌产毒培养条件,分析唐菖蒲根腐病菌粗毒素对对其致毒作用,并以粗毒素为筛选压力,以唐菖蒲子球诱导的愈伤组织及经EMS诱变后的无性系作为筛选材料,对唐菖蒲抗根腐病变异无性系进行筛选和初步鉴定,并对获得的再生植株体内防御酶活性变化进行分析,以期建立唐菖蒲抗根腐病体细胞无性系的变异体系,探索唐菖蒲抗病育种的新途径。本研究主要结果如下：1.从田间发病的典型病株分离纯化唐菖蒲根腐病菌,经初步鉴定为尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型((Fusarium oxysporum f. sp. gladioli),适宜唐菖蒲根腐病菌生长的培养液为PD培养基,病菌产毒量最适培养液为Czapek培养基,适宜该菌生长的条件是24～30℃、pH6.0-7.0、黑暗培养,振荡培养方式对菌丝生长影响较不大；在温度27℃、pH7.0、黑暗、震荡培养有利于病菌产毒。粗毒素具有很强的热稳定性,且对唐菖蒲幼苗具有强烈毒性,能够导致幼苗萎蔫；2个唐菖蒲品种的根系细胞膜透性、根系活力和丙二醛含量的变化能反映粗毒素对唐菖蒲的致毒作用；低浓度粗毒素胁迫下货车品种对病菌粗毒素的忍耐力强于超级玫瑰品种。2.通过一步筛选法和多步筛选法筛选唐菖蒲抗根腐病无性系,结果表明多步筛选法可以提高愈伤组织对粗毒素的抗性,当粗毒素浓度达到50%时,2个品种愈伤组织的存活率与对照相比分别提高了28.33%、27.00%,与一步筛选法相比愈伤组织存活率分别提高了19.00%、18.66%,因此多步筛选法是进行唐菖蒲抗根腐病无性系筛选的适宜方法。3.对经EMS诱变后的不定芽进行抗唐菖蒲根腐病无性系筛选的结果表明,当粗毒素浓度为50%时,EMS诱变芽获得21个抗性芽,是未经EMS诱变处理的不定芽数量的3倍；经抗性鉴定结果表明,经过EMS诱变的超级玫瑰不定芽经连续加压筛选后,与未经EMS诱变处理相比不定芽存活率提高了13.17%,不定芽增殖率提高了24.16%。说明进行抗病无性系筛选之前用EMS诱变剂进行诱变处理,能够扩大其变异频率。4.对抗根腐病无性系再生植株进行抗性鉴定,抗性再生植株对病菌粗毒素及病菌孢子悬浮液的抗性水平均比对照有显着的提高,且对病菌粗毒素的抗性高于对病菌的抗性。共获得货车抗根腐病再生植株3株、超级玫瑰抗根腐病再生植株9株,其中经EMS诱变后筛选获得的抗性再生植株8株。5.抗性再生苗在受病菌粗毒素胁迫的48h内,苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(PDD)活性变化趋势为先升高后降低。经筛选后的抗性再生苗叁种酶的活性均显着高于对照苗,其中2个品种筛选苗的PAL活性峰值分别是对照苗峰值的1.43倍和1.50倍,PPO活性峰值分别为对照苗峰值的1.47倍和1.99倍,POD活性峰值分别为对照苗峰值的1.53倍和1.70倍,表明唐菖蒲对根腐病菌粗毒素的抗性与这叁种酶活性呈正相关。
伏颖[7]2011年在《烟草靶斑病菌遗传分化、侵染特性及致病机理研究》文中进行了进一步梳理烟草靶斑病(tobacco target spot)是近年来我国新报道的一种烟草叶部病害,危害严重,该病害对烟草的产量和品质有显着的影响,但是国内缺乏文献记载。鉴于此,本文针对烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)的遗传分化、侵染特性和致病机理进行了系统研究,研究结果如下：1.首次明确了我国烟草靶斑病菌的菌丝融合群为AG-3,以及病菌的致病类型,即强致病类型、中等致病类型和弱致病类型。对采自辽宁各地区的58个烟草靶斑病菌菌株进行了融合群测定,确定在我国引起烟草靶斑病的立枯丝核菌属于AG-3融合群；并对病菌的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列进行了分析,通过GenBank进行序列同源性比对,结果表明,病菌的rDNA ITS序列长度为653bp,其与引起番茄叶部病害的立枯丝核菌(AG-3融合群)的ITS序列的同源性高达100%,从分子水平上也证明了烟草靶斑病菌属于AG-3融合群,从形态学和分子水平上对烟草靶斑病菌进行了准确的分类鉴定；并从中选出16个有代表性的烟草靶斑病菌菌株进行了致病力测定,根据供试菌株在烟草品种NC89、K326、云烟85和G80的抗感反应,可将这16个菌株划分为3个致病类型,即强致病类型、中等致病类型和弱致病类型,表明我国烟草靶斑病菌的致病力存在明显分化,但致病类型的分布与菌株的地理来源无明显的相关性。2.应用RAPD和ISSR两种分子标记方法对我国烟草靶斑病菌进行遗传多样性分析,从分子水平探索烟草靶斑病菌的遗传演变和进化,并系统分析了RAPD和ISSR分组与菌株的地理来源和致病性的相互关系。利用优化的反应体系,筛选出9条RAPD引物和7条ISSR引物分别对供试的16个烟草靶斑病菌菌株进行扩增,分别扩增出111和83条带,多态条带比率分别为64.86%和68.67%；RAPD标记的菌株间的相似系数范围分别为0.63-0.93,在相似系数0.74处被划分成3个类群,ISSR标记的菌株间的相似系数范围分别为0.61-0.94,在相似系数0.75处被划分为3个类群。RAPD和ISSR分析结果均表明,我国烟草靶斑病菌群体具有丰富的遗传多样性和明显的遗传分化现象,遗传聚类组群与烟草靶斑病菌菌株的地理来源具有一定的相关性,而与菌株的致病性无明显的相关性。并利用RAPD和ISSR方法对烟草靶斑病菌菌株和引起其它病害的立枯丝核菌菌株进行了遗传多样性分析,结果表明,烟草靶斑病菌菌株间的亲缘关系最近,而与引起其它病害的立枯丝核菌菌株的亲缘关系较远,它们之间存在较大的遗传差异。3.研究了烟草靶斑病菌的侵染特性,并首次明确了烟草靶斑病菌与重要病菌如水稻纹枯病菌和玉米纹枯病菌的交互致病性。研究结果表明,烟草靶斑病菌以菌丝体或菌丝体随病残体在土壤中越冬,或菌丝体在病残体中越冬；病菌可通过烟草叶片气孔和伤口侵入,伤口更有利于病菌侵入；病菌可侵染烟草苗期和成株期的茎部,引起烟草立枯病和茎基腐病,病菌也可以侵染烟草叶片的主脉和侧脉。对病菌的侵染过程进行观察,发现病菌在接种24h时开始侵入烟草叶片组织,接种24～48h内菌丝迅速在细胞间和细胞内扩展,受侵细胞被破坏,最终死亡。确定了病菌适宜的侵染条件,最适温度为25～30℃；保湿和接种时间越长越有利于发病；12h光照12h黑暗和连续黑暗的条件对病菌的侵染有利,而连续光照对其有明显的抑制作用。对20个烟草品种的抗性研究发现,VRG2最为抗病,发病率为25%。寄主范围测定结果表明,烟草靶斑病菌可侵染烟草、番茄、茄子、辣椒、黄瓜、冬瓜和苋色藜,其中茄子的发病率最高为97.5%。交互致病性测定结果表明,烟草靶斑病菌不能侵染水稻、玉米和白菜,但水稻纹枯病菌、玉米纹枯病菌、白菜丝核菌叶腐病菌、烟草立枯病菌和烟草茎基腐病菌均能侵染烟草叶片。通过田间试验,对该病害进行损失估计,统计结果表明产量损失率和产值损失率与病级均呈显着的正相关,病级越高,产量和产值损失越大,并建立了关系模型。选用10种药剂对烟草靶斑病菌进行室内抑菌试验,建立了各药剂的毒力回归方程并计算出EC50,结果表明,烯唑醇、菌核净、嘧肽菌净、退菌特和代森锰锌对该病菌具有较强的抑制作用,可作为防治该病害的首选药剂。4.明确了烟草靶斑病菌产生的毒素的基本性质及其致病机理。试验通过活性炭吸附、甲醇洗脱、旋转蒸发浓缩的方法,从烟草靶斑病菌的Richard培养滤液中获得了黄褐色粗毒素,该毒素能够使烟草叶片产生与靶斑病类似的病斑,而且还能抑制种子萌发和胚根生长,导致幼苗萎蔫。明确了病菌产毒的最佳培养条件,即pH值6～7的Richard培养液,温度25℃,黑暗每12h振荡1次条件下培养15～20d。对毒素的基本性质进行研究,结果表明该毒素具有热稳定性、光稳定性和耐储藏性,它是一类易溶于水的非蛋白类的极性物质。研究探讨了毒素对烟苗叶片组织中的抗性相关生理生化指标的影响,结果表明,毒素可激活烟草叶片中POD、PPO、CAT和PAL活性,而抑制SOD活性,受害叶片的叶绿素和可溶性糖含量显着下降,而可溶性蛋白、丙二醛和游离脯氨酸含量明显升高,组织浸出液的相对电导率也显着升高,这些指标的变化表明了毒素对烟草有明显的毒害作用,同时也表明了毒素可引起烟草体内的防御反应,以抵抗毒素造成的伤害。不同致病力烟草靶斑病菌菌株的产毒素能力也不同,强致病力菌株YC-9的产毒能力比弱致病力菌株LF-1强。5.明确了烟草靶斑病菌产生的细胞壁降解酶的致病机理,强致病力菌株的产酶能力显着高于弱致病力菌株。烟草靶斑病菌在人工Marcus培养液中能产生果胶酶(PG、PMG、PGTE、PMTE)和纤维素酶(Cx、β-葡萄糖苷酶),其中PG活性最高。明确了最佳产酶条件,Cx和β-葡萄糖苷酶的最适培养时间为10d,而PG、PMG、PGTE和PMTE为12d；培养最适温度为25℃；Cx、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG的最适pH值为5,而PGTE和PMTE的最适pH值为6；静置培养和连续黑暗条件利于酶的产生。烟草叶片不同病斑部位酶活性不同,其中病健交界处细胞壁降解酶活性最高。烟草靶斑病菌与烟草互作过程中细胞壁降解酶活性测定结果表明,病菌侵染叶片后,PG、PMG. PMTE、PGTE、Cx、β-葡萄糖苷酶活性均显着升高,其中Cx和β-葡萄糖苷酶活性最高,其次为PG和PMG,而PMTE和PGTE活性很低。病菌产生的细胞壁降解酶液能够使烟草叶片产生病斑,混合酶对叶片的损伤作用明显高于单一酶,果胶酶的损伤作用高于纤维素酶。对不同致病力烟草靶斑病菌菌株的产酶能力进行比较,结果表明强致病力菌株YC-9的产酶能力显着高于弱致病力菌株LF-1。6.通过同源获取基因中间片段和RACE方法克隆得到一个与烟草靶斑病菌致病性相关的基因,即病菌的内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)基因。病菌endo-PG基因的cDNA全长序列为1399 bp, CDS区长1086 bp,编码361个氨基酸。
徐艳[8]2006年在《水稻纹枯病菌毒素的致病机理及对寄主防御酶活性的影响》文中认为本实验用改良的Richard培养液培养水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani),滤液经活性炭吸附、甲醇洗脱、旋转蒸发后获得粗毒素。以粗毒素处理水稻种子,毒素可显着抑制胚根生长,且浓度越高,毒性越强。水稻纹枯病菌粗毒素对水稻叶鞘和叶片细胞膜有明显的损伤作用。毒素处理后,细胞膜透性改变,细胞内物质外漏。当毒素稀释5-10倍时,细胞膜损伤率达80%以上,且处理时间越长,细胞膜损伤越重。另外,毒素处理对水稻植株中叶绿素含量有较大抑制作用。当毒素稀释10倍时,叶绿素含量比对照减少85%以上。并且,毒素浓度越高,处理时间越长,水稻叶绿素含量越低。电镜观察结果表明,水稻纹枯病菌粗毒素对水稻叶鞘细胞及其超微结构具有显着的破坏作用。毒素处理12h后,叶绿体膜破损,基粒片层松散、肿胀,出现空腔;处理36h后,叶绿体基本解体,线粒体等其它细胞器也消解,细胞壁部分变薄、疏松。水稻纹枯病菌粗毒素对水稻叶鞘和叶片体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化歧化酶(SOD)等防御酶活性都有一定的促进作用。当毒素稀释20-100倍时,POD、PPO、PAL、SOD活性均明显高于对照;当稀释1000倍时,这些酶的活性则变化很小。防御酶活性与毒素处理时间密切相关。通常,随着毒素处理时间的延长,酶活不断增加;毒素处理后48-60h,酶活达最高值;随后,酶活有所下降。
袁希雷[9]2008年在《酢浆草假尾孢菌致病毒素的研究》文中研究说明目前对红花酢浆草的防治主要依靠化学方法,化学除草剂尽管在解决全球的粮食危机中发挥了巨大的作用,但已对生态环境造成了严重的残毒污染,使得环境质量恶化,并威胁到人类自身的健康;另一方面,耐药性杂草种群上升和抗化学除草剂杂草的出现,已成为不可忽视的问题。利用生防菌控制红花酢浆草的研究尚刚刚起步,但由于生物防治具有安全性高、持效期长、投入少等优点,因此该领域是极具潜力的研究热点之一。通过调查发现,重庆市各地区红花酢浆草均有不同程度的叶斑病发生,部分地区极为严重,可造成红花酢浆草大面积枯死。研究表明造成红花酢浆草叶斑病病原菌为假尾孢属真菌——酢浆草假尾孢(Pseudocercospora oxalidis Goh＆Hsieh),系半知菌亚门假尾孢属,关于此属真菌目前的文献资料介绍较少。本文从以下五个部分对酢浆草假尾孢菌及该菌致病因子进行研究:一、筛选重庆地区的酢浆草假尾孢菌强致病力菌株;二、诱导筛选到的酢浆草假尾孢菌强致病菌株产生毒素,并进行毒素的生物活性测定以确定毒素的毒性;叁、探求提取酢浆草假尾孢菌产生毒素的条件及方法;四、对酢浆草假尾孢菌毒素的化学本质进行初步分析;五、研究酢浆草假尾孢菌毒素的稳定性及对主要作物的生物安全性测定。在红花酢浆草叶斑病发生期,分别到重庆叶斑病发生区采样,本试验总共分离到81个菌株。根据病情严重度分级标准和致病力强弱分化标准测定90个菌株(其中包括植物生态病理研究所提供9个菌株)致病力。结果表明:供试的90个菌株的致病力存在明显的差异。差异性表现在两个方面:一方面不同地区的菌株的致病力存在差异,采自北碚、沙坪坝、合川和万州等地区的菌株大部分具有较强的致病力,而采自九龙坡及荣昌的菌株大多数致病力弱;另一方面是同一地区不同菌株的致病力也存在一定差异性,在沙坪坝区采集到23个菌株中较强及强致病力菌株有12株,占一半以上,弱致病力菌株只有2株(YH-008-02,YH-028-01)。研究表明酢浆草假尾孢菌经体外培养可产生致病毒素。本试验使用的生物材料为红花酢浆草的离体叶片,采用了离体叶片针刺法和叶圆片浸渍法进行毒素生物活性测定。实验证明:酢浆草假尾孢菌毒素能使红花酢浆草叶片产生褪绿斑,说明该毒素对叶片具有致病作用,且毒素对叶片致病作用的强弱与毒素的浓度有显着相关性。两种生测方法相比较,针刺法不仅反应速度快、用量少,而且实验效果明显。本文研究了产毒时间、温度、通气量、光照、pH值、培养基等培养条件对酢浆草假尾孢菌产生毒素的影响。结果表明酢浆草假尾孢菌毒素的最佳产毒条件为:产毒时间达到15d后产毒量基本稳定,在20～25℃的温度范围内产毒能力最强,pH为6的偏酸条件与光照较少的条件有利于酢浆草假尾孢菌产生毒素,充分的营养物质和振荡条件也是菌丝生长和产生毒素的关键。本试验利用活性碳法、有机溶剂萃取法、硫酸铵分级沉淀法等叁种方法来提取酢浆草假尾孢菌毒素。实验表明:活性碳法提取到一定量毒素,但是结果不算很理想;有机溶剂萃确ü讨?极性较弱的有机溶剂萃取毒素的效果最差,有致病作用的毒素组分大部分都在水相中,说明该毒素化合物具有较高极性,而且是大分子化合物;硫酸铵分级沉淀法适合分离该菌的毒素,硫酸铵的饱和度为90%时提取效果最好。对酢浆草假尾孢菌毒素的缓冲液透析结果表明,该毒素为大分子化合物,结果与有机溶剂萃取结果一致。病菌毒素中蛋白和可溶性糖含量的测定结果表明,蛋白含量为137.2μg/mL,可溶性糖含量为20.52μg/mL。据此初步认为酢浆草假尾孢菌毒素为糖蛋白,主要成分为蛋白质。试验证明:酢浆草假尾孢菌毒素对于除大豆和番茄外各测试作物具有安全性;酢浆草假尾孢菌毒素具有良好的热稳定性,可以存放于室温或者冷藏;且该毒素在pn值为4.0～11.0的酸碱度范围内的致病活性差异性不显着,从而排除了含毒滤液毒性是由溶液的酸度所致的可能性。
朱天辉[10]2003年在《枯斑拟盘多毛孢菌毒素的研究》文中研究指明由枯斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis funera Desm.)引起的松赤枯病是松树幼龄林上常见的病害，分布广、危害严重。该病在四川自1974年开始发生危害，到1980流行以来，已成为主要针叶林木病害，居林木病害首位。本文首次对枯斑拟盘多毛孢菌致病毒素的离体产生条件、毒素基本特性、专化性特点、毒素对寄主细胞质膜的伤害机制和对不同抗性松属植物细胞超微结构的影响及毒素活性成份分离纯化技术及化学结构进行了较系统的研究，以期了解枯斑拟盘多毛孢菌毒素的致病机理、不同松属植物的抗性反应及毒素活性物质的化学成份，从而为松属植物抗赤枯病育种和科学利用抗赤枯病树种提供可靠的理论基础。 本研究从四川松属植物分布区8个松属树种上采集松赤枯病样本，经单孢分离获得21个枯斑拟盘多毛孢菌菌株，所产毒素的致病性具明显的多样性。用马尾松、华山松、油松、云南松、湿地松、火炬松、辐射松、黑松一月龄左右的切根苗作生测材料，筛选出较强毒力的松赤枯病菌菌株(PF-1)作毒素产毒条件的研究，结果表明：枯斑拟盘多毛孢菌在七种参试培养基中，以PD培养基产毒最好，在培养基中加入敏感寄主马尾松松针浸出汁不能对毒素的产生和活性起促进作用。枯斑拟盘多毛孢菌在18-22℃、pH6.5-7.0、黑暗、静止状态下产毒最佳(15-27d)，这些条件与其菌丝生长、产孢有一定差异，表明枯斑拟盘多毛孢菌的生长与产毒条件不完全一致。 枯斑拟盘多毛孢菌毒素粗提液的基本特性研究显示：(1)毒素粗提液在80℃以下的温度有较高的稳定性，在高温(90-100℃)条件下，有失活现象发生；酸碱度(pH4-9)对其致病活性没有较为明显的影响。(2)该毒素不溶于乙酸乙酯等非极性溶剂，易溶于乙醇、甲醇等极性较大的溶剂。在氯仿与甲醇按不同比例提取时，随着甲醇比例的提高，提取液的致病活性也不断增强，据此可以推测枯斑盘多毛孢菌毒素可能为一类极性较大的物质(非蛋白类)，活性碳能对其吸附，并能用甲醇将其从培养液中较好地提取出来，这些特性的揭示为深入研究毒素提供了可靠的生化依据。 选用12种不同科属木本植物和15种不同科属杂草对毒素专化性研究表明，松属植物中，马尾松、油松、云南松对毒素最敏感、湿地松、火炬松次之，华山松、辐射松、黑松有较强的抗毒素能力，而不同科属的木本植物柳杉、杉木、南洋杉、兰桉对毒素也有不同程度的反应，说明该毒素为非专化性毒素。同时，不同生测材料试验证实松幼嫩的针叶对毒素的反应快而敏感，且能产生典型症状，是一种理想的生测材料。生测方法研究显示，与浸渍法、涂抹法相比，针刺法不仅反应快，而且用量少，用针刺法处理待测针叶，由于粗提液易为植物材料所吸收，在生测过程中不易长出霉菌，使生测结果更为直观和准确。本研究还表明枯斑盘多毛抱菌毒素能使十五种杂草中的九种产生不同程度的伤害，一方面反应出这种非寄主专化性毒素在除草上有一定选择性，另一方面，也表现出广谱的除草能力，这对于开发新型生物除草剂有一定的参考价值。 毒素对不同松属植物细胞膜的伤害通过离子渗漏(电导率换算成膜伤害指数)和丙二醛(州DA)含量变化评估:(l)马尾松(29.5/24h)、油松(28.5/2 4h)、云南松(25.7/24h)细胞膜伤害指数最大，湿地松(9 .0/2 4h)、火炬松(8 .0/24h)次之，华山松(3.9/2 4h)、辐射松(4.6/2 4h)、黑松(4.3/2 4h)最小，这种差异在一定程度上反映了不同松属植物在抗病性上的差异，同时研究还发现，随着毒素浓度的降低，寄主膜伤害指数(电导率)显着下降，感病树种(马尾松、油松、云南松)在24h时膜伤害指数达最大值，而抗病树种(华山松、辐射松、黑松)的膜伤害指数达最大值的时间有所推迟(48h)。 (2)不同松属植物在毒素处理后，针叶中的MDA含量变化趋势有显着差异，抗病树种针叶中MDA含量变化情况不如感病树种(马尾松、油松、云南松)明显，从而说明抗病树种(华山松、黑松、辐射松、湿地松、火炬松)细胞膜脂过氧化较低，对毒素的忍耐力较强，这实际上是一种抗病性在细胞膜的反应。 毒素对不同抗病性松属植物愈伤组织破坏的扫描电镜试验表明，正常愈伤组织表面结构丰满、圆滑，而毒素可造成松属植物愈伤组织表面结构的破坏，细胞皱缩、空瘪，这种破坏作用，随处理时间的延长而增大;并且，马尾松对毒素较华山松更为敏感，马尾松愈伤组织表面的毁坏程度比华山松大得多。另一方面，透射电镜显示，感病树种马尾松针叶经毒素处理后，细胞壁肿胀，细胞壁多处部分消解，细胞质膜断裂，散落在细胞中，细胞发生严重的质壁分离，叶绿体膜破坏、片层无序化，或片层模糊，线粒体脊模糊、无序化，脊消解;但抗病树种华山松针叶细胞结构破坏相对较小，常在同一视野中有的细胞受害而有的细胞基本正常，说明华山松对枯斑拟盘多毛菌毒素有一定的抗性。 毒素分离纯化及化学结构研究表明:(l)通过对薄层层析展开剂及柱层析填料的筛选，得出正丁醇:甲醇:水(60:巧:30)为最佳展开剂，硅胶H60型为最佳填料。(2)以生测为评判指标，用硅胶H60型柱反复柱层析，用正丁醇:甲醇:水(60:15:30)和不
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