车素侠 周素莲
河北省香河县人民医院检验科 河北廊坊 065400
【摘 要】目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）血清学检测出现的组合模式与HBV-DNA定量之间的关系，为临床诊断和治疗提供有价值的判断标准。方法：157例血清标本采用ELLSA方法对其免疫学标志物进行检测，并用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术检测血清HBV-DNA。结果：经PCR检测，47 例HBsAg（+），HBeAg（+），HBcAb（+）的标本，其HBV-DNA检出率100.00％，平均HBV-DNA检测值为0.98E+07IU/ml；65例HBsAg（+），HBeAb（+），HBcAb（+）的标本，其HBV-DNA检出率49.23％（32例），平均HBV-DNA检测值为1.31E+06IU/ml；34例HBsAg（+），HBcAb（+）的标本其HBV-DNA检出率48.57％（16例），平均HBV-DNA检测值为0.63E +05IU/ml。结论：荧光定量PCR检测血清HBV-DNA准确灵敏，可以检测HBV的真实感染和复制状态，结合乙肝病毒的血清标志物检测，对于乙肝临床诊断治疗方案的选择，疗效观察及预后判断有极其重要的作用。
【关键词】乙型肝炎病毒；乙肝标志物；ELISA；荧光定量PCR
【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-05-020-02
【Abstract】 Objective To probe into the relationship of the combination pattern of HBV in the serology detection and HBV-DNA quantitation in order to offer valuable judgment standard for clinical diagnosis and cure.Methods 157 samples of serum specimen test the immunology marker by using ELLSA and serum HBV-DNA by using PCR.Results After the test PCR，in the 47 samples of HBsAg（+），HBeAg（+），HBcAb（+），the positive rate of HBV—DNA is 100.00% and the average test of HBV—DNA is 0.98E+07 IU/ml.In the 65 samples of HBsAg（+），HBeAb（+），HBcAb（+），the positive rate of HBV—DNA is 49.23%（32 samples）and the average test of HBV—DNA is 1.31E+06 IU/ml.In the 34 samples of HBsAg（+），HBcAb（+），the positive rate of HBV—DNA is 48.57%（16 samples）and the average test of HBV—DNA is 0.63E+05 IU/ml.Conclusion Fluorescent quantitation PCR is accurate and sensitive in testing the serum HBV—DNA.It can test the real infection and copying state of HBV.Serum marker test combining with HBV—DNA has extremely important effect on Hepatitis B clinical test，selection of therapeutic schedule，observation of curative effect and prognosis.
【Key words】 HBV—DNA；HBV marker；ELISA；Fluorescent quantitation PCR
乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染病，世界各国均有发生，据估计全世界HBsAg携带者为3.5亿.我国为乙肝高发区，约有1.2亿人为乙肝病毒携带者。乙肝病毒血清标志物即两对半的检测是常用方法之一，其方便快捷，成本较低，但ELLSA方法只能提供阴阳性的判断，不能提供乙肝病毒的具体含量。随着分子生物学的发展，荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术广泛用于临床的诊断和治疗，它是直接检测血清中的乙肝病毒DNA，HBV-DNA是反映人体内乙肝病毒复制的直接指标，也是最特异，最灵敏的指标，不同的病毒载量反映了乙肝病毒在患者肝脏中的复制情况。我们通过检测乙肝患者血清病毒标志物和其中病毒的含量，将二者结果进行总结分析，了解他们之间的关系，并找出一定规律，以研究该方法的实用性及临床应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
乙肝患者血清标本来源于我院2011年1月至2011年6月的门诊和住院病人，已知乙肝五项模式的共计157份，男92人，女65人，平均年龄41岁，临床诊断均符合全国传染病诊断标准[3]。
1.2 仪器与试剂
血清标志物仪器为XD-711酶标分析仪测定，试剂由英科新创（厦门）科技股份有限公司提供；HBV-DNA检测仪器为中山大学达安基因股份有限公司提供的DA7600荧光定量扩增仪，试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供。
1.3 方法
乙肝血清标志物采用ELLSA方法，严格按操作说明检测，结果由XD-711 酶标仪测定，每一批标本均设阴阳性和临界对照。荧光定量PCR测定HBV-DNA严格按试剂盒说明书和仪器厂家提供的方法进行。每次试验设立4个HBV-DNA标准品系列浓度，分别为1×104；1×105；1×106；1×107；其检测灵敏度为1×102 IU/ml，严格按照检验操作规程[4]提出的防污染措施进行实验操作。
1.4 统计学处理
定量结果采用求算术平均值的方法计算HBV-DNA平均拷贝数；组间样本率比较采用u检验，计数资料采用t检验，最后用SPSS13.0软件统计处理。
2 结果
血清标志物经ELISA检测可分为以下几种组合模式：
表 血清标志物模式及各组PCR-DNA定量结果
HBsAg，HBeAb，HBcAb（俗称小三阳）的65例标本中PCR检测HBV-DNA有32例为阳性（阳性率为49.23％）。标志长期HBV携带者的血清HBsAg，HBcAb（俗称 1.5阳性）的34标本其HBV-DNA检出率48.57％（16例）。标志长期HBV携带者的血清HBsAg（+），HBeAg（+）（俗称1.3阳性）的5例标本全部检出高病毒载量的DNA，标志恢复期的HBsAb，HBeAb 和HBcAb均阳性以及HBeAb、HBcAb阳性，和单纯HBcAb阳性的6例标本中，1例阳性，且病毒载量较低。在出现HBeAb 和HBcAb转换的慢性乙肝血清中，有13.1％的病例HBV-DNA阳性，说明这些抗体出现并不能标志HBV复制的停止；这些都说明依据ELLSA法检测乙肝病毒的感染及治疗情况并不完全可靠，通过列表进行对比，我们可以找出乙肝病毒血清标志物和HBV-DNA数量之间的相关性。
3 讨论
乙肝血清标志物是HBV感染的实验室传统的检测手段，它检测的是抗原、抗体，是反映人体是否有乙肝病毒携带及对HBV的免疫应答状态，由于HBV的表达和机体免疫反应的强弱受多种因素影响，因此，反映患者体内病毒复制时有一定局限性。而PCR技术可检测病毒的DNA，即HBV的IU/ml数，能准确地反映病程变化和治疗恢复情况。从本组实验研究表明：乙型肝炎患者血清HBV标志物不同，其HBV-DNA阳性率各异。在大三阳，即HBsAg，HBeAg HBcAb均阳性，HBsAg，HBeAg阳性中，HBV-DNA阳性率最高，为100.00％；在小三阳即HBsAg，HBeAb，HBcAb均阳性的患者中HBV-DNA阳性率为49.23％，在HBsAg，HBcAb阳性的患者阳性率为48.57%。说明HBeAg阳性是病毒复制活跃的标志，结果显示HBeAg阳性者HBV-DNA含量明显高于阴性者，而HBeAg阴性者中仍有HBV-DNA阳性，说明即使HBeAg阴转HBV-DNA复制并不一定停止，提示HBV-DNA复制处于较低水平或可能已和宿主DNA整合并潜伏下来，部分患者仍有传染性。因此，我们不能简单地认为，HBeAg阴转是HBV复制减弱或病情好转的信号，特别是HBeAb阳性或者HBsAg，HBcAb阳性转氨酶异常的患者应及时进行HBV-DNA定量检测，我们还发现在HBsAg，HBeAg，HBcAb均阳性的患者中也有较低载量的病毒复制的情况，后来经过与患者沟通得知这些患者正在积极的治疗中，这些患者也应该适时进行HBV-DNA定量检测，以便于病情的判断及治疗方案的选择。
表中后面的几组数据显示，即使在血清标志物中HBsAg为阴性的情况下也不能完全排除乙型肝炎病毒的感染，主要原因是患者处于感染初期或低水平的HBV感染，导致血清标志物消失或浓度偏低，也可能是由于编码HBsAg的HBV S区基因发生点突变所致，使得ELLSA方法不能测出乙肝病毒标志物，但聚合酶链反应灵敏度高，可检测出低浓度的HBV-DNA。所以凡是乙肝病毒携带者及其家人、和与其接触过的人都建议做乙肝病毒标志物和HBV-DNA的检测，这样既能发现HBV感染者的窗口期，又能避免某些HBV低水平复制的漏检，以便最大限度地减少乙肝病毒的传播。HBsAg虽然是HBV感染的特异性指标，但并不是血液HBV携带者具有传染性的直接指标。像上表中所列的小三阳、1，5阳性HBV-DNA的阳性率分别为49.23％、48.57%，血清中HBV阳性的病例其传染性大小与HBV-DNA滴度有关。对上述病例进行随访可知这些患者都在进行抗病毒药物治疗，药物干扰了病毒的复制，患者对药物的作用比较敏感，因此，HBV-DNA在治疗后明显下降或至无法测出；而有的患者对药物的作用不敏感，有时HBV-DNA水平明显升高，反映病情加重的各种酶的指标也都增高，提示病毒仍在复制。所以HBV-DNA检测在评价和监测抗病毒药物疗效等方面具有十分重要的临床价值。HBV-DNA定量检测能正确反映病毒复制情况，是乙肝病毒治疗唯一有效的直接疗效指标。
以上分析表明：单纯依靠乙肝血清标志物的检测结果来进行诊断及判断病情是不够的，它只能较好地反映机体对乙肝病毒感染的免疫应答状况，而荧光定量PCR可以定量检测HBV-DNA的浓度，且灵敏度高，特异性强，更能清楚地反映乙肝患者的病毒活动程度，真实地反映HBV的感染和复制情况，二者需要辩证地看待，各有优点，又有着必然的联系，只有将两种方法有机地结合起来，对乙肝标志物进行综合分析，才能对临床诊断治疗方案设计，药物疗效观察提供可靠的依据。
参考文献：
[1]张红，杨海珍等.慢性乙型肝炎患者不同病毒载量与乙肝三系统及前S1抗原相关性研究，2010.31（3）：P 233-234
[2]朱忠勇等实用医学检验。人民军医出版社，P 1034-1035
论文作者:车素侠,周素莲
论文发表刊物:《世界复合医学》2015年第5期供稿
论文发表时间:2015-6-25
标签：阳性论文; 血清论文; 定量论文; 病毒论文; 标志物论文; 患者论文; 乙肝论文; 《世界复合医学》2015年第5期供稿论文;