王杨 段孟岐 符月春通讯作者
（中山大学附属第三医院检验科）510630
摘 要 目的: 通过比较紫外速率法和改良比值法测定G6PD缺陷症女性杂合子酶活性的准确率，选择出诊断效率更高的方法，为临床疾病诊断提供有效依据。方法: 分别收集60份用基因检测确诊为G6PD 缺乏的女性杂合子的肝素抗凝血（病例组）和60份用基因确诊为G6PD正常的女性肝素抗凝血（对照组），每份标本同时用改良比值法和紫外速率定量法进行G6PD酶活性测定；统计分析两种方法的特异度和灵敏度及准确度。结果: 紫外速率定量法检测灵敏度：65%，特异度：96.7%；改良G6PD比值法灵敏度：38.3%，特异度：91.7%。结论: 紫外速率定量法测定G6PD缺乏女性杂合子的诊断效率大于改良G6PD比值法，是筛查女性杂合子G6PD酶活性的更好方法。
关键词 紫外速率法；改良比值法；女性杂合子；G6PD缺乏
目前G6PD酶活性检测有多种方法，主要有高铁血红蛋白还原试验、硝基四唑氮蓝( NBT )纸片法、荧光斑点法、全自动生化分析仪紫外速率定量法和改良G6PD比值法等。在临床应用的过程中发现这几种方法对G6PD缺乏症都有一定的漏检率，特别是女性杂合子。
本研究通过比较和探讨目前临床上普遍使用的两种G6PD酶活性的筛查方法：紫外速率定量法和改良G6PD比值法，从而选择出对G6PD缺乏的女性杂合子检出率较高的方法，为临床的诊断和疾病筛查及预防提供有效依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1标本来源：病例组：2011 年3月至2011年9月在我院或外院通过突变特异性扩增系统(ARMS) 法已经确诊为G6PD缺乏女性杂合子，选取其中年龄在20-50岁间的60例，抽取其静脉血（肝素抗凝）。对照组：2011年3月至2011年9月在我院通过突变特异性扩增系统(ARMS) 法已经确诊为G6PD正常，无溶血性贫血，近期感染、大手术、输血史的20~50岁女性60例，抽取其静脉血（肝素抗凝）。同一天内用改良比值法和紫外速率定量法对静脉血标本进行G6PD酶活性测定。
1.1.2 仪器与试剂 紫外速率定量法所用仪器为AU640，试剂由利德曼生化公司提供，配套校准品、质控品；改良G6PD比值法所用仪器为上海精密科学仪器有限公司产721分光光度计，水浴箱，试剂由米基公司提供。
1.2方法
分别用紫外速率定量法和改良G6PD比值法对60份女性杂合子和60份正常标本进行酶活性检测。
1.2.1紫外速率定量法
取肝素抗凝全血，在3000rpm/min条件下，离心5分钟，去掉上清，吸取下层压积红细胞20 u l加入1ml去离子水中，充分混匀待红细胞完全溶解后（15-30分钟）测定。
结果参考值范围：采用肝素抗凝血，大于1100U/L。含量在500-1100U/L的样本。
1.2.2 改良G6PD比值法
操作步骤：① 抗凝全血15ul，加入双蒸水200ul溶血，制成溶血液。每份样本分1、2号管，分别取溶血液50u l加入试管中；
②取G6P反应试剂各50u l，分别加入1、2号试管中，混匀，立即置37℃水浴箱准确保温20min；
③取出试管，立即加入终止液2 ml，以蒸馏水作空白对照，于650 nm波长读取1、2管的光密度值(s1和s2 )；
④比值计算：G6PD／6PGD=s1/s2 ；
结果参考值范围:成人正常值：1.0-2.3（个别比值高于2.3时，可视为正常值），脐血正常值：1.1-2.5（个别比值高于2.5时，可视为正常值）。女性杂合子G6PD多呈轻度降低，比值为0.95-1.05。
1.3统计学分析
结果低于参考值为阳性，分别计算两种方法的特异度和灵敏度，灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)；并采用SPSS10.0 软件处理，做出两种方法的ROC曲线。病例组数据用卡方检验分析。
2. 结 果
2.1分别用两种方法检测60例病例组和60例对照组的标本，紫外速率法实验结果（见表1）分析显示其灵敏度为65%，特异度为96.7%；而改良G6PD比值法（见表2）的灵敏度为38.3%， 特异度为91.7%。紫外速率定量法和改良G6PD比值法检测病例组阳性配对结果（见表3）显示两种方法检测女性杂合子G6PD活性的阳性率存在差异，且差异具有统计学意义（χ2=10.714，p<0.005）。
2.2采用ROC分析评价紫外速率定量法和改良G6PD比值法测定G6PD缺乏女性杂合子的准确率，可见紫外速率法ROC曲线下的面积0.938（如图1），显著大于改良G6PD比值法ROC曲线下面积0.462（如图2），说明紫外速率定量法测定G6PD缺乏女性杂合子的诊断效率优于改良G6PD比值法。
3.讨 论
本研究结果显示，针对女性G6PD杂合子标本，紫外速率定量法的阳性检出率为65%，而改良G6PD比值法仅为38.3%，符合赵艾菊[1]的研究：G6PD比值法杂合子实际检出率在4.90％~77.22％，常见为20％~45％。其中有16例紫外速率定量法检测出G6PD活性减低而改良比值法检测活性正常。经过统计学分析，两种方法的阳性检出率有显著差异。采用ROC分析评价，得出紫外速率法ROC曲线下的面积0.938，大于改良比值法ROC曲线下面积0.462，表示紫外速率定量法测定G6PD缺乏女性杂合子的准确度大于改良G6PD比值法。而且紫外速率定量法灵敏度高，特异度好，并在实际操作过程中发现其操作步骤简便、检测时间短、更适合大批量标本的检测，是筛检G6PD缺乏症较理想的方法。
根据LYON假说，女性G6PD缺乏杂合子，其G6PD酶的活性并不是在红细胞（RBC）内平均的分配，而是一群RBC拥有正常G6PD活性，另一群RBC则表现为G6PD缺乏。理论上这两组RBC的数量比应该是1∶1，使得RBC的总体酶水平为正常人的1/2，即酶中度缺乏[2]。但实际上每个个体这两组细胞的比例不同，可使G6PD缺乏杂合子的酶活性表现正常，中等度缺乏或显著缺乏等形式。正是由于这种表型与基因型之间的明显不一致，使得一部分女性杂合子G6PD缺乏症用筛查方法无法检出[3]。但是由于女性杂合子酶活性差异很大，造成女性杂合子的G6PD活性有广泛的表现度，从而出现重度缺乏，中间缺乏值和正常酶活性的可能。其中酶活性正常的女性杂合子难以用G6PD活性筛检方法检出，而改良G6PD比值法只对G6PD缺乏患者男性标本较理想[4]。
所以，本文选择已经过金标准基因检测确诊为G6PD 基因突变的女性杂合子为研究对象，发现60例女性杂合子对象中，有18例女性杂合子两种检测方法的结果都显示G6PD酶活性正常，紫外速率定量法有21个检测结果正常，改良比值法有37个检测结果正常。说明两个方法对女性杂合子都有不可避免的漏检率。尽管紫外速率定量法的检出率不低，但实际结果仍低于G6PD缺乏症的自然发病率[5]。现有的新生儿筛查不能有效的检测出所有的杂合子。因此，对于家族中出现一级亲属中有G6PD缺乏者的高度危险女性，尽管已经采用紫外速率定量法检测结果正常者也不能掉以轻心，有条件者可利用更为准确可靠的G6PD基因诊断加以确诊。
但在没有开展红细胞G6PD基因检测的条件下，紫外速率定量法操作简便，检测时间短，更适合大批量标本的检测。而且测定G6PD缺乏女性杂合子的诊断效率大于改良G6PD比值法，是基层医院筛查G6PD缺陷症的理想的方法。
4.参考文献
[1] 赵艾菊. G6PDI／6PGD比值法对G6PD杂合子诊断价值的探讨[J].广西医学，2008，30（6）：807-809.
[2] Lyon MF. Gene action in the X-chromosome of the mouse (MusmusculusL.) [J]. Nature, 1961，190(4773): 372-373.
[3] 杜传书. 漫谈“蚕豆病”和“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症”[J]. 新医学，2001，32(11)：96-97.
[4] 吴小梅.对改良G6PD定量比值法与高铁血红蛋白还原试验检测G6PD的比较分析[J].实用医学杂志，2007，23（13）：2091-2093.
[5] 姚英姿，方小武，杨孜，等. 应用荧光斑点法和G6PD/6PGD比值法检测新生儿G6PD[J]．中国优生与遗传杂志，2010，18（8）：78-79.
第一作者：王杨 ， 男， 本科，技师，中山大学附属第三医院检验科（510630）
38051513@qq.com
通讯作者：符月春， 女， 本科 ，技师，中山大学附属第三医院检验科（510630）
13711442292@163.com
论文作者:王杨,,段孟岐, 符月春
论文发表刊物:《医师在线》2015年10月第20期供稿
论文发表时间:2016/1/11
标签：合子论文; 比值论文; 速率论文; 定量论文; 女性论文; 活性论文; 方法论文; 《医师在线》2015年10月第20期供稿论文;