（1山西中医药大学中医临床学院 山西太原 030619）
（2山西医科大学第一临床医学院 山西太原 030001）
【摘要】目的：研究太原地区大气细颗粒物PM2.5的细胞毒性并探讨羟基红花黄色素-A的干预效果。方法：采用滤膜法采集太原地区大气细颗粒物PM2.5以人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）为靶细胞,研究PM2.5水溶成分及HSYA作用后细胞活力及氧化损伤，采用MTT法测定细胞的存活率，荧光显微镜检测细胞内活性氧(ROS)水平的变化。结果：随着染毒剂量的增加细胞存活率呈下降趋势,ROS则呈现增高趋势，染毒浓度为100、200、400、800、1600、3200μg/mL，细胞存活率分别为99.00±0.80、98.00±1.20、96.42±1.52，93.61±1.80（P<0.05）、86.79±1.03、56.01±2.00（P<0.01）。ROS荧光灰度值分别为158±48、160±56，178±42（P<0.05），198±45、229±38、252±40（P<0.01）。羟基红花黄色素-A干预后与1600μg/mLPM2.5组相比，细胞存活率94.86±0.50（P<0.01），ROS荧光灰度值160±38（P<0.01）。结论：太原地区大气细颗粒物PM2.5水溶成分具有一定的细胞毒性,羟基红花黄色素-A能抑制PM2.5损伤内皮细胞，抗氧化应激可能是其机制之一。
【关键词】PM2.5；人脐静脉血管内皮细胞；羟基红花黄色素-A；ROS
【中图分类号】R543 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）17-0150-03
PM2.5也称细颗粒物质，是大气中空气动力学直径≤2.5μm的所有粒子的总称。急慢性暴露于大气PM2.5与心血管病发病率、死亡率密切相关[1]，我国冠心病流行表现出北方高于南方、城市高于农村的特点[2]，山西省冠心病发病率在全国也居于较前水平，太原地区污染较明显，本文采用体外试验方法，初步研究太原地区大气PM2.5对血管内皮的氧化损伤情况及中草药红花提取物羟基红花黄色素-A的干预效果。
1.材料和方法
1.1 主要试剂
高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA购于Gibco公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。活性氧检测试剂盒C1300购自普利莱基因技术有限公司，HSYA (98%纯度）购自上海锐谷生物科技有限公司。
1.2 样品的采集和制备
1.2.1采样点的选择 选择太原市地区有代表性的地段作为采样点，春季3月采集1个月，连续采集采样高度:距地面10米；持续采样24小时/日；每日固定时间更换采样膜；采样空气流量：1.05m3/min。
1.2.2 PM2.5水溶成分提取方法 将采样膜称重并计算出滤膜上的PM2.5重量，采集面朝上平铺于大烧杯底部，加入去离子水200ml，将烧杯置入超声振荡的水浴箱内，低温振荡60min，将混悬液用三层医用纱布过滤，除去混悬液中的纸浆成分，分装到已干燥称重的50ml离心管内，10000rmp低温离心3min，离心后取上清液，即为PM2.5的水溶成分。真空冷冻干燥（-60℃）48小时，完成后收集烧杯中的淡黄色粉末，得到固态PM2.5水溶成分，4℃保存。
1.3 细胞培养和分组
冻存内皮细胞复苏后，用含l0%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液接种于细胞培养瓶，于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。细胞生长形成单层时，吸去培养液，PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA混合消化液消化，按1:2的比例传代。首先设对照组（只加无血清培养基）和PM2.5染毒组（终浓度为100，200，400，800，1600，3200μg/mL），染毒24h。观察PM2.5对细胞生长的影响并检测ROS。另外，再设对照组、PM2.5组（1600μg/mL）、PM2.5+HSYA组（简称PH组）（加1600μg/mLPM2.5和最适浓度HSYA）和HSYA组（最适浓度），作用24h后再观察上述指标。
1.4 观察指标方法
1.4.1 MTT法测血管内皮细胞存活率 接种4×104个/ml细胞于96孔平底培养板上，37℃、5%CO2培养24小时。加入颗粒物水溶成分，每组设6个平行孔，并设3个对照孔，即只加同浓度的颗粒物水溶成分，培养72小时。每孔加入MTT溶液20μl/l，继续培养4小时。去培养液，加200μlDMSO溶液。振荡l0分钟后，在酶联免疫检测仪上测定吸光度值(A值)，测定波长490nm。细胞存活率=（实验组A值/对照组A值)×100%。
1.4.2 细胞内ROS水平的检测 接种4.0×105个/ml细胞于6孔平底培养板上，37℃、5%CO2培养24小时。加入颗粒物成分，并设空白对照孔，培养6小时。每孔加入10uM的DCFH-DA溶液100μl，继续培养2小时。PBS洗涤细胞3次用荧光显微镜照相，最大激发波长488nm，最大发射波长525nm。
1.5 统计学分析
各组所得计量数据采用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS18.0软件处理数据并进行单因素方差分析、P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 HSYA最适浓度筛选见表1
表4结果显示，随着染毒浓度的增加，细胞ROS水平呈上升趋势，与对照组相比，ROS 升高具有统计学显著性（P＜0.01）。经单因素方差分析，PH组比PM2.5组ROS水平低且差别有统计学意义（P＜0.05），说明HSYA干预后，可以减少PM2.5作用后的ROS产生。
3.讨论
本文研究发现太原地区大气细颗粒物PM2.5水溶成分有一定的细胞毒性，作用于人脐静脉内皮细胞可以引起细胞内ROS增高。加红花黄色素-A干预后细胞存活率增高，细胞内ROS降低，初步显示了PM2.5水溶成分能引起细胞氧化应激损伤，红花黄色素-A可能通过抗氧化应激而起到保护作用。
活性氧(ROS)是氧在机体内还原过程中产生的中间产物及其终产物的统称，与呼吸、循环系统损伤密切相关[3]。太原市属煤炭重工业城市，燃煤污染是PM2.5的重要污染来源，其成分主要为有机物、硫酸盐、硝酸盐以及地壳类元素。
红花作为药用最早见于东汉张仲景《金匾要略》，具有活血祛瘀功效，王英洁、袁鹏等临床研究发现其对心绞痛、脑梗死等心脑血管疾病具有一定疗效[8、9]，红花黄色素-A是其主要成分。本研究结果表明：HSYA能抑制PM2.5损害内皮细胞，PM2.5刺激内皮细胞升高的ROS水平得以下降，因此推测HSYA能抑制PM2.5诱导的氧化应激，降低PM2.5对细胞内抗氧化防御系统的激活程度。
国外探讨PM2.5对内皮细胞的损害机制是目前研究的热点。氧化应激与动脉粥样硬化形成密切相关，由于血管内皮在维持血管生理功能中具有重要作用，因此抑制血管内皮细胞氧化损伤对动脉粥样硬化和冠心病等疾病的防治具有重要意义。本实验结果可为后续研究提供参考。
【参考文献】
[1] Reichardt T.Call to boost research on particulates.Nature，1998，392 (6677).
[2]吴锡桂.我国人群冠心病流行现况与趋势，中国慢性病预防与控制，2003，11.
[3] Halonen JI，Pekkanen J Particulate air pollution and acute cardiorespiratory hospital admissions and mortality among the elderly.Epidemiology.2009，20.
[6]张文丽，大气细颗粒物污染监测及其遗传毒性研究 [J].环境与健康杂志，2003，20.
[7] Meng Ziqiang，Oxidative damage of sulfur dioxide inhalation on lungs and hearts of mice [J].Environmental Research， 2003，93.
[8]王英洁.不稳定性心绞痛应用红花黄色素治疗的临床疗效研究［J］.中国现代药物应用，2013，7.
[9]袁鹏，红花黄色素治疗不稳定型心绞的临床观察［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2013，11.
基金项目：山西省卫计委基金资助项目(201601116)
论文作者:李彩萍1,张勇2
论文发表刊物:《心理医生》2018年17期
论文发表时间:2018/7/17
标签：细胞论文; 内皮论文; 黄色素论文; 红花论文; 成分论文; 存活率论文; 太原论文; 《心理医生》2018年17期论文;