1延边大学附属医院检验科 吉林延吉 133000；2北华大学附属医院检验科 吉林吉林 132000
摘要：目的 建立SysmexXN-1000血液分析仪荧光法计数血小板的复检规则，详细分析规则建立的必要环节，以期对建立合理的复检规则提供依据。方法 应用SysmexXN-1000血液分析仪检测1250例标本，同时进行血涂片显微镜检查，对检测结果进行统计分析。参考国际血液学复检专家组推荐“41条”规则中血小板复检规则，通过调整规则降低复检率，控制漏诊率，制定出适合荧光法计数血小板复检规则。选取240例有阳性或假阳性倾向的标本验证规则的有效性。结果 依据“41条”中血小板复检规则，电阻抗法（PLT-I）复检率为53.5％（669/l250），假阳性率为33.2％（415/1250），漏诊率为8.5％（106/1250）；荧光法（PLT-F）复检率为50.3％（629/l250），假阳性率为28.2％（353/1250），漏诊率为5.7％（71/1250）。采用调整后的复检规则对标本重新统计分析，PLT-F复检率为33.9％（424/1250），假阳性率为13.4％（168/1250），漏诊率为4.0％（50/1250）。与原规则相比，调整后复检规则可使大血小板引起假性减低的检出率由59.6%（77/129）提高至89.1%（115/129）；血小板聚集引起假性减低的检出率由84.1%（37/44）提高至100%（44/44）。验证试验结果显示，血小板聚集阳性标本无漏检情况。结论 血小板电阻抗法复检规则适用于SysmexXN-1000荧光法计数血小板，但复检率过高未体现出方法学优势，优化后，规则的复检率和漏诊率均降低，具有临床可操作性和有效性。
关键词：血小板计数；荧光法；复检规则；评价研究
Establishment of review criteria for Sysmex XN-1000 platelet analyzer by Fluorescence and its application
HAN Caijun 1，ZHAO Wantao 2，JI Biye 1，ZHOU Fuxian 1，YOU Xi 1
（1 Department of Clinical Laboratory，the Affiliated hospital of Yanbian University，Jilin Yanji，133000；
2 Department of Clinical Laboratory，the Affiliated hospital of Beihua University，Jilin Jilin，132000）
Abstract：Objective To establish the blood smear review criteria for Sysmex XN-1000 PLT-F，and the detailed description of all the implement procedures could be helpful for establishing a reasonable review rules. Methods The total 1250 blood samples were detected with XN-1000 hematology analyzer. In the meantime，blood smears were reviewed，and the results were analyzed statistically. The new review criteria were established by consulting and modifying the one as recommended by an international consensus group. After establishment of the review criteria，another 240 samples were tested for validation. Results Using the original rules，the study got a high review rate of 50.3%（629/1250），false positive rate of 28.2%（355/1250）and false negative rate of 4.7%（59/1250）. Using the adjusted rules，the review rate，false positive rate and false negative rate were all reduced to 33.9%，13.4%and 4.0%. The detection rate of large platelets and platelet aggregation cause the pseudothrombocytopenia increased 89.1%（115/129）and 100%（44/44），no PLT Clumps missing was observed. Conclusions When applied to SysmexXN-1000 analyzer，“41 rules” based on the impedance shows a high review rate which does not reflect the advantage of the fluorescent. The optimized review criteria are suitable and practical for the routine work and call meet the need of clinical in both review rate and false negative rate.
Key words：Platelet count；Fluorescent；Review criteria；Evaluation studies
2005年国际血液学复检专家组制定并推荐41条血细胞分析和分类复检规则[1-2]，得到中国临床检验血液学专家的高度响应[3-5]，其中又对血小板复检提出了若干要求。但是随着血小板分析新技术荧光染色法（PLT-F）的广泛应用，若直接沿用其中的部分规则，可能会增加复检工作量或者发生漏诊，而已发表的文献没有阐明因方法学改变的血小板规则修订。因此如何保证血小板检测结果质量，又提高工作效率，制定合理适用的血小板复检规则非常重要。为此，本研究通过与电阻抗法（PLT-I）比较，验证并改进血小板复检方案，建立适合SysmexXN-1000血液分析仪PLT-F的复检规则。
材料与方法
一、研究对象
1.标本来源：1250例血标本（PLT-F<125×109/L或>1000×109/L）[6]来自2016年5月至2016年10月我院门诊和住院患者（男613例，女637例），用于建立PLT复检规则；240份标本为定向抽取的潜在阳性或假阳性标本涉及血液、肿瘤、消化、放化疗、儿科（包括新生儿）等科室，用于验证所建立规则的临床有效性。
2.仪器与试剂：SysmexXN-1000血液分析仪以及配套试剂。Olympus CX-21双目显微镜。BD公司静脉用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）真空抗凝管。瑞氏-姬姆萨（Wright-Giemsa）染色液（珠海贝索生物技术有限公司）。
二、方法
1.样本采集与检测：坐位采集静脉血，收集在EDTA-K2的真空采血管内，室温保存。所有标本均采用自动进样模式在SysmexXN-1000血液分析仪检测并记录报警信息，要求采集6h内检测结束。每份标本，同时制备2张血涂片，写好编号；用瑞氏-姬姆萨染色液进行染色，然后由有工作经验的检验人员按照标准操作程序（血涂片检测SOP文件）进行镜检。
2.涂片镜检阳性判断标准：正常情况下，血片厚薄适中区域（每个红细胞彼此相互接触但不重叠），每个油镜视野约有血小板8～15个；少于8个/油镜视野可初步认为血小板减少，大于30个/油镜视野则可初步认为血小板增加。油镜下的细胞形态异常判断标准：①小红细胞：直径小于6μm②细胞碎片：各种不完整形状的细胞碎片③血小板凝集：血小板5个以上成堆④巨大血小板：直径6μm以上[7-8]。
三、统计学分析：采用SPSS13.0统计软件对XN-1000血液分析仪检测的实验数据进行统计分析，根据设定的复检方案，评估仪器检测结果的真阳性、假阳性、真阴性、假阴性及与涂片镜检结果的符合性。真阳性为触发了任意复检规则，同时涂片镜检结果阳性；假阳性为触发了任意复检规则，但涂片镜检结果为阴性；真阴性为未触发复检规则，同时涂片镜检结果为阴性；假阴性为未触发复检规则，但涂片镜检结果为阳性。仪器检测结果的评价以真阳性率、假阳性率、真阴性率、假阴性率、符合率、复检率及漏诊率来表示，复检率=真阳性率+假阳性率，漏诊率=假阴性率。
结果
一、PLT-I复检规则修改前、后对PLT-F诊断效率的比较：根据国际血液学复检专家组推荐的血小板复检规则和我国血液学复检专家小组制定的涂片镜检血小板阳性判断标准，对1250例标本数据进行统计分析，用PLT-I法检测复检率为53.5％（669/l250）；假阳性率为33.2％（415/1250）；漏诊率为8.5％（106/1250）。用PLT-F法复检率为50.3％（629/l250）；假阳性率为28.2％（353/1250）；漏诊率为5.7％（71/1250），可见，电阻抗法复检规则适用于荧光法计数血小板，但复检率过高未体现出方法优势。结合仪器的性能特点及方法学的差异对国际复检规则进行优化，最终建立适应于SysmexXN-1000血液分析仪荧光法的血小板复检规则（表2）。结果显示，复检率为33.9％（424/1250）；假阳性率为13.4％（168/1250）；漏诊率为4.0％（50/1250）。通过规则调整，PLT-F的复检率下降16.4%（见表1）。
二、新规则在血小板假性减低中的应用：与原规则相比，调整后复检规则可使大血小板引起假性减低的检出率由59.6%（77/129）提高至89.1%（115/129）；血小板聚集引起假性减低的检出率由84.1%（37/44）提高至100%（44/44）。
三、验证试验结果分析：为验证所建立的SysmexXN-1000血液分析仪荧光法复检规则有效性，定向选取来自于血液病、肿瘤放化疗及感染等有阳性或假阳性倾向的病例共240例。结果显示调整后复检规则标本真阳性率为22.5％（54/240），假阳性率为21.3％（51/240），假阴性率为5.0％（12/240），真阴性率为51.2％（123/240），无血小板聚集阳性标本漏检。
讨 论
血液分析仪检测原理和报警信息不同，致使不同仪器及方法间对细胞形态的识别能力存在差异。PLT-I采用电阻抗原理，根据血小板颗粒在通过计数小孔时引起电阻变化，以此为基础将2fL至30fL范围内的颗粒定义为血小板，因此电阻抗法不能很好的识别大血小板、血小板聚集等引起的假性减少以及细胞碎片和小红细胞等引起的假性偏高；而PLT-F通过使用血小板特异性的恶嗪染料对细胞内的核酸染色，采用流式细胞术检测并绘制散点图进行计数，明确区分血小板以及其他细胞，这符合文献中荧光染色法性能优于电阻抗法的方法评价[9]。
本研究所在医院平均日血常规标本量600余份，虽然电阻抗原理的复检规则适用于荧光法，但复检率较高，未能体现出荧光法的优异性。因此，需要重新优化复检规则，而优化规则要遵循3个原则[5，10]：（1）降低复检率：需要从降低假阳性率人手，分析在复检规则中出现假阳性病例较多的规则是什么，然后有针对性地删除或改变这些规则。（2）“假阴性”是制定复检规则的关键参数，具有诊断意义的重要参数不能出现假阴性，否则会给临床的诊疗带来风险。因此，当降低复检率达到实验室可操作水平时，尽可能地控制漏诊率为最低水平；（3）确保血小板聚集阳性标本无漏诊：造成血小板减少的因素较多，包括真血小板减少（由各种临床疾病所引起）和假性血小板减少（如抽血不当、血小板聚集、巨大血小板等），其中EDTA依赖性血小板减少症（EDTA-PTCP）发生率极低，临床报道发生率大约为0.07%～0.20%，一旦发生极易造成误诊、误治，因此及时发现并处理血小板聚集，为临床提供准确的检测结果非常重要[6，11]。
通过对国际血小板复检规则中假阳性和假阴性标本的分析发现，假阳性标本中以红细胞形态异常或者碎片比例最高、血小板数量异常和巨大血小板比例较高；假阴性标本主要由巨大血小板、血小板聚集、红细胞形态异常所致。许多标本除了有血小板数量规则的报警外，还有仪器上其他多种阳性规则报警，且相应的涂片复检率也高达50%。新规则考虑荧光法可有效避免红细胞碎片和有核红细胞干扰的性能特点，故删除原规则RBC碎片怀疑性报警，提高小红细胞及红细胞体积分布宽度报警阈值；结合中国人及本地区PLT参考范围[5]，即男性为（85～303）×109/L，女性（100～320）×109/L，将PLT减低的参考下限由“<100×109/L”改为“<85×109/L”，从而降低复检率。以往多用MPV来反映外周血中血小板的更新状态，但血小板体积受内外环境条件影响较大，而IPF被认为是一种新生的血小板，胞质中含有RNA成分，能较敏感地反映巨核细胞的血小板生成能力，结合文献中参考范围[12]，即男性为（0.3～2.9）%，女性（0.3～2.7）%，以及大血小板和血小板聚集时IPF%的变化，将IPF加入到复检规则中，取代MPV报警，从而提高大血小板、血小板聚集所引起假性减低的检出率以及小红细胞的影响。国内外文献表明检测未成熟血小板价值大，可应用于血小板减少、血小板增多症的鉴别诊断和骨髓造血功能恢复的预测[12-14]。荧光法无法准确区分少量血小板聚集与巨大血小板，在降低血小板聚集阳性漏诊率时，巨大血小板导致的假阳性率有所提高，因此在保证低假阴性率前提下，引入IPF%>6%，从而降低假阳性率。临床验证试验说明本实验确定的复检规则具有临床有效性，由于临床验证选择的标本主要验证对异常结果的检测能力，所以其假阳性率和复检率明显高于建立规则时的假阳性率和复检率，但无血小板聚集阳性漏检。规则调整后，血小板复检率降低明显，假阳性率和假阴性率均下降，且没有血小板聚集漏检。由此可见，所建立的新规则可以明显提高工作效率，减少不必要的劳动，确保了血小板分析的准确性和复检规则的实用性和可信性。
综上，随着血细胞分析检测技术与方法的不断进步，最初所建立的复检规则需要在日常工作中不断的改进和完善。现阶段血细胞分析仪采用荧光色素染色法检测血小板，极大地弥补了电阻抗法检测血小板的不足，提高了血小板检测的准确性，通过制定相应的血小板复检规则，使得血小板分析质量和技术水平不断提高，避免了大量样本的镜检复查。
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作者简介：韩才均，男，1984年12月出生，检验师，医学硕士，主要从事临床血液学检验
通讯作者：尤昕，主任技师，医学博士，硕士生导师.
论文作者:韩才均,赵万韬,贾碧野,周福贤,尤昕
论文发表刊物:《健康世界》2017年第4期
论文发表时间:2017/4/18
标签：血小板论文; 规则论文; 阳性论文; 率为论文; 阴性论文; 标本论文; 涂片论文; 《健康世界》2017年第4期论文;