张书环[1]2007年在《牛结核病胶体金免疫层析方法的建立与初步运用》文中研究表明牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织(Office International DesEpizooties OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现，牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出：除非消灭牛结核，否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，一些国家普遍采用的是“检疫-捕杀”政策，即检疫出的阳性牛一律捕杀来实现控制牛结核病。因此，准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)，结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此，研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法，是控制牛结核病当务之急。牛分枝杆菌是细胞内寄生菌，MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6是M．bovis感染机体后分泌的主要抗原，诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时，灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强，而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力，使用时配比不均，难于进行标准化生产等问题也已凸显出来，鉴于以上原因，本研究之一是对四种牛分枝杆菌抗原蛋白(MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6)进行了融合表达，旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。胶体金免疫层析技术(Gold-Immunochromatographic Assay GICA)是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高，而且不需昂贵仪器设备，操作简单快速。MPB83和MPB70已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原。MPB70和MPB83蛋白的氨基酸序列具有63％的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同抗原决定簇。本研究利用牛分枝杆菌的两个同源蛋白质MPB70和MPB83，建立了一种双抗原夹心胶体金免疫层析法。旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法。主要研究内容包括：1．牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析克隆了牛分枝杆菌特异性抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的编码基因，构建原核表达载体，诱导表达蛋白，提纯融合蛋白质，并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应，说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示：该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示，融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理，用原核诱导表达的牛分枝杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原，制备牛结核抗体检测试纸条。结果粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高；胶体金最佳标记pH值为6.0；MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg；MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg／mL；抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg／mL；交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应，具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显着高于进口试纸条。3．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病抗体胶体金快速检测方法制备的胶体金试纸条进行临床样品检测，并与牛结核分枝杆菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆菌分离培养的符合率为85％，与TST的符合率为79.73％，与韩国试纸条的符合率为98.75％。快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点，适用于对牛结核病进行普查和检疫，也可作为TST的辅助诊断方法，在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景。
周丽蓉[2]2004年在《结核分枝杆菌特异性抗原的制备及其抗原性的初步研究》文中认为结核杆菌是结核病的病原菌。结核杆菌侵入机体进行繁殖，释放大量抗原尤其是蛋白抗原，选择性刺激B细胞丛产生大量免疫球蛋白，急性早期阶段以IgA、 IgM升高为主，此后IgG水平逐渐升高，升高的程度与病情轻重相关[1]。因此，检测体液中的抗结核抗体对结核病的诊断有重要的辅助作用。引起免疫反应的结核抗原多而复杂，为了寻找敏感性高特异性强的结核抗原，本实验利用基因工程技术重组结核分枝杆菌蛋白抗原，从结核分枝杆菌中提取菌体蛋白和脂多糖抗原，并对这些抗原进行抗原性分析。首先，从结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取DNA作为模板，根据GenBank提供的蛋白基因序列设计引物，通过PCR法克隆38KDa和14KDa蛋白基因，利用表达载体PET-30a（＋）和PET-22b（＋）分别以包涵体和可溶性蛋白的形式表达该蛋白，再利用离子亲和层析方法对蛋白进行纯化，获得高纯度的目的蛋白，经Western Blot检测表明两种重组蛋白都具有良好的抗原性。其次，为了获得结核杆菌菌体蛋白和脂多糖抗原，利用改良的液体苏通培养基培养大量的结核分枝杆菌，收集菌体，冰浴超声破
李红霞[3]2007年在《结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究》文中提出结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，据世界卫生组织(WHO)统计，当前全球约有1／3的人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。我国结核杆菌感染率为44.5％，活动性肺结核患者451万，每年死亡人数达13万。结核病成了危害人类健康的重要传染病之一。对结核分枝杆菌的研究再度成为了全球研究的热点。要控制结核病的流行与蔓延的关键在于找到简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法。1998年结核分枝杆菌基因组破译成功，运用基因组杂交技术对结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)的基因组序列进行比较，发现卡介苗(BCG)相比于结核分枝杆菌，有16个基因差异的区域(Region of Difference，RD)，包括RD1-16，其中的RD1区是仅存在于致病性分枝杆菌包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝杆菌中。RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。CFP10、ESAT6和PPE68的编码基因均存在于RD1区，且具有强烈的免疫原性，因此可将ESAT6、CFP10和PPE68作为诊断结核杆菌感染的特异性试剂。由于单一蛋白在诊断上灵敏度不理想，目前有很多学者认为两个或多个特异性蛋白的联合，有利于提高检测的灵敏度。本研究构建了原核重组质粒pGcfp10、pGesat6、pGcfp10-esat6以及pGesat6-ppe68，经IPTG诱导后在大肠杆菌中高效表达，通过纯化试剂盒获得纯化的重组蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68，将叁种纯化蛋白免疫动物，获得了高效价的多克隆抗体血清。以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为参考，在建立PPD-ELISA的基础上，建立了以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法，旨在为临床结核病的诊断提供敏感性、特异性和实用性都比较理想的诊断试剂，为我国结核病的防治提供技术支持。为了能进一步诊断病人是否为现症感染，本实验建立了以多克隆抗体作为包被抗体检测结核病人血清中特异性抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，为结核病的早确诊、早治疗提供了一种新的技术思路。本研究共分五部分进行：第一部分，以结核分枝杆菌H37Rv国际标准株基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增出303 bp的cfp10基因和288 bp的esat6基因，随后将其分别定向连接入原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10和pGesat6，经IPTG诱导，约36kDa的GST-CFP10和约32kDa的GST-ESAT6融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，并将GST-ESAT6融合蛋白通过谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。第二部分，用重迭区扩增基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因，并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6，IPTG诱导表达约42 kDa带GST标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第叁部分，采用重迭区扩增基因拼接(GeneSOEing)法实现了结核分枝杆菌esat6及ppe68基因融合，融合基因esat6-ppe68被克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中，构建了原核表达重组质粒pGesat6-ppe68，并使约69 kDa的GST-ESAT6-PPE68融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第四部分，将构建的原核表达重组质粒pGesat6、pGcfp10-esat6、pGesat6-ppe68分别在大肠杆菌中经IPTG诱导后大量表达带GST标签的融合蛋白，采用谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒获得大量高度纯化的融合蛋白，并将部分纯化蛋白免疫动物，制备高效价的多克隆抗体血清。第五部分，以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的PPD-ELISA程序，参考此方法，分别建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。通过与PPD-ELISA进行比较，认为叁种特异性抗体ELISA检测方法在对结核病的诊断上显示了更高的特异性，将特异性抗体ELISA检测方法用于复检PPD-ELISA阳性的病人，将有利于提高结核病诊断的准确性。通过比较叁种特异性抗体ELISA检测方法的特异性与灵敏度，认为两融合蛋白-ELISA的敏感性高于单一蛋白ESAT6-ELISA，两融合蛋白-ELISAZ间的敏感性无差异，但CFP10-ESAT-ELISA的特异性高于ESAT6-PPE68-ELISA，叁种特异性抗体ELISA检测方法以CFP10-ESAT6-ELISA效果最好，PPE68也是很有研究价值的结核特异性诊断抗原。本部分研究还建立了以包被多克隆抗体检测结核特异性抗原的双抗体夹心ELISA方法，经检测发现，叁种方法的灵敏度均较低，分别为12％、18％、19％，但特异性很高，接近100％，认为以结核特异性抗体来检测病人血清中的结核特异性抗原的ELISA检测方法是一种诊断病人是否为结核现症感染的可行的新技术方法。综上所述，检测结核特异性抗体的ELISA方法用于结核病的检测具有敏感性较高，特异性强等优点，可望开发成诊断试剂盒，满足目前临床上结核病诊断的需要，为我国结核病的防治提供技术支持；检测结核特异性抗原的ELISA方法能区别现症感染与既往感染，也能用于结核病治疗的疗效考核，具有很高的研发价值。
戴振华[4]2014年在《结核分枝杆菌抗原定量检测技术的建立及其初步评价》文中认为结核病(TB)仍然是威胁全球人类健康一个重大的挑战。在2012年估计有新增结核病例860万,死于结核病有130万人,其中有30万人为HIV阳性。据估计,全球范围内的结核病发病率和与人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染的病例数在未来数十年内将大幅增加。在世界低收入国家的负担较重,特别是在东南亚和撒哈拉以南的非洲。在这些高负担的地区,结核病诊断的基石仍然是痰涂片镜检。在HIV阴性的患者中,常规临床检测敏感性的变化在35%和80%之间,但在艾滋病毒感染的患者中,敏感性低至20%。此外,在后一组中,痰稀缺性是常见的,这就需要增加操作过程,如诱导痰或支气管镜进行样品采集。传统的痰涂片检查在儿童和肺外结核的患者中的用处也有限。分枝杆菌培养需要几个星期才能提供结果,价格昂贵且需要专门的实验室设施,在大多数高负担地区仍无法使用。当前,较新的T细胞定量检测[γ-干扰素的释放试验(IGRAs)]在高负担的地区没有实用性,同时不能区分潜伏的活动性结核病。核酸扩增试验(NAATs)有限的特异性,使之在结核高负担地区无法广泛使用。结核病诊断仍然需要价格低廉,快速,易于推广的检测技术和产品。迄今为止,大多数已开发的方法是基于特定循环抗体的检测。在很长一段时间内,肺结核的血清学诊断一直处于研究阶段,但现在仍然没有一个具有广泛临床应用价值的检测方法。抗原检测几乎可以肯定证实活动性结核的存在。相比之下,抗体检测并不能确定活动性结核,甚至在清除感染半年后也能检测到抗体反应。我们应该集中更多的力量在直接检测体液中抗原的基础上来开发检测方法。这样的检测方法对患者的诊断及治疗过程中的随访可能是有用的。因为在疾病活跃的阶段,结核病具有高度的传染性,对这种疾病快速,特异的检测,不仅可以遏制结核病的蔓延,同时将帮助医生开展恰当、及时的治疗,又可以减少多重耐药(MDR)以及普遍耐药(XDR)结核分枝杆菌菌株进化的机会。1983年,在脑脊液中第一次检测到结核抗原,自此以后陆续有学者在痰液和脑脊液中通过ELISA、乳胶凝集法检测到结核分枝杆菌抗原。近期文献报导则以ELISA和胶体金等检测血清、CSF和尿中的PPD衍生物及其特定的菌体成份,如38kD抗原LAM等,其敏感性和特异性分别在20%-94.0%和78.6%-100%。但这些抗原都比较单一,而且大多数商业抗原检测试剂盒不能满足临床的需要,因此这些结核分枝杆菌抗原的检测方法未能广泛应用于诊断活动性结核病。本研究构建了原核重组质粒pBVIL1-38KD、pBVIL1-ESAT6、 pBVIL1-CFP10,经温度诱导在大肠杆菌中高效表达,用离子交换层析方法纯化蛋白；融合蛋白IL1-38KD+ESAT6+CFP10、GST-38KD+ESAT6+CFP10经温度、IPTG诱导表达后,用离子交换层析、亲和层析方法纯化蛋白。将纯化得到的蛋白免疫动物,获得了高效价的单克隆及多克隆抗体。选用Protein G亲和层析法纯化抗体,同时以纯化得到的抗体分别作为包被抗体和检测抗体建立双抗体夹心检测抗原ELISA法,在此基础上建立了化学发光检测结核分枝杆菌抗原的定量检测技术,并进行初步临床评价。本研究共分五部分进行：1、以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经过PCR扩增出结核分枝杆菌38KD, ESAT6, CFP10基因。通过分子克隆方法,成功构建结核分枝杆菌38KD、ESAT6、CFP10基因的原核表达质粒pBVIL1-38KD, pBVIL1-ESAT6, pBVIL1-CFP10。通过42℃水浴诱导质粒pBVIL1-38KD, pBVIL1-ESAT6, pBVIL.1-CFP10在原核表达系统中有效表达出约53kDa的IL1-38KD、21.3kDa的IL1-ESAT6、21.1kDa的IL1-CFP10重组蛋白。通过离子交换层析法对IL1-38KD, IL1-ESAT6, IL1-CFP10重组蛋白进行纯化,经间接EILSA法对纯化的蛋白进行了活性的初步鉴定,结果显示克隆表达的蛋白具有很好的灵敏度和特异性。2、本研究是基于实验室成功地构建了pBVIL1-38KD+ESAT6+CFP10、 PGEX-38KD+ESAT6+CFP10质粒的基础上。诱导表达后采用离子交换层析及亲和层析对融合蛋白进行纯化,获得了高浓度、高纯度的融合蛋白。对蛋白的活性进行了鉴定,与各分片段蛋白相比,提高了检测敏感性,并具有很好的特异性。3、将纯化的蛋白免疫大耳白兔,得到了兔抗结核分枝杆菌特异性抗原(38KD、 ESAT6、CFP10和融合抗原38KD+ESAT6+CFP10)的多克隆抗体,效价分别为1：32000,1：16000,1：32000,1：128000。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,得到了鼠抗结核分枝杆菌特异性抗原的单克隆抗体,抗38kD的阳性克隆共4株：BBA171、BFE624、BBG411、BEA831,抗体滴度效价分别为1：256000、1：128000、1：256000、1：128000；抗ESAT6的阳性克隆1株：BFF1024,抗体滴度效价为1：512000；抗CFP10的阳性克隆1株：BBG1028,抗体滴度效价为1：256000。4、以单克隆、多克隆抗体为包被和标记抗体,创建双抗体夹心结核分枝杆菌抗原ELISA检测法。对试剂各反应条件进行了优化,得到了结核分枝杆菌抗原检测方法的最佳反应条件：包被抗体与酶标抗体分别为兔抗38KD+ESAT6+CFP10多抗与HRP-兔抗38KD+ESAT6+CFP10多抗；包被抗体浓度为0.25ug/ml;样品与稀释液按50ul+50ul稀释；酶标抗体浓度为1：600。同时建立了抗原ELISA法的标准曲线(y=0.0218x+0.1387,R2=0.9933),确定了最低检测限(1.11ng/ml)。在结核分枝杆菌抗原ELISA方法的基础上,建立了结核分枝杆菌抗原化学发光定量的检测方法,标准曲线(y=15583x+89992,R2=0.9962),确定了最低检测限(0.46ng/ml)。5、对建立的结核抗原化学发光定量检测技术进行初步临床评价,对接受抗结核治疗的患者在不同时间段血清中抗原浓度的检测,结果显示患者血清中的结核分枝杆菌特异性抗原会随着治疗时间而逐渐降低。经过对结核患者痰结核分枝杆菌培养上清中结核特异性抗原的检测结果,抗原化学发光技术与结核分枝杆菌培养阳性的符合率较高为92%,同时在结核分枝杆菌培养阴性的上清中,抗原的检出率能达到27.11%。定量分析后结果显示,在培养的这段时间内结核分枝杆菌特异性抗原38KD、ESAT6、CFP10的分泌量主要集中在0.75ng/ml～40ng/ml之间。结核分枝杆菌特异性抗原化学发光检测技术与商业化抗体检测试剂盒共同检测应用,抗原与抗体检测有一定的互补性。综上所述,本研究建立的结核分枝杆菌抗原化学发光定量检测方法,可用于结核病的早期辅助诊断。抗原检测能区分结核患者的既往感染与感染,同时可用于结核病患者治疗的疗效评价,具有一定的临床应用价值。
匡有吉[5]2008年在《梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用》文中研究指明牛结核病(Bovine Tuberculosis,bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织(Office International DesEpizooties,OIE)定为B类动物传染病,我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现,牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出:除非消灭牛结核,否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治,目前普遍采用的是“检疫-捕杀”政策,即检疫出的阳性牛一律捕杀来控制牛结核病。因此,准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test,TST),结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives,PPD),是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质,含有多种抗原成分,用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份,检测时容易出现假阳性;结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此,研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法,是控制牛结核病当务之急。梅花鹿是特种经济动物,在人工饲养条件下可以生产繁殖,其主要产品鹿茸,被称为“东北叁宝”之一,具有很高的经济价值。一些学者中认为鹿是牛结核的次要宿主,近年来对鹿的牛结核流行病学调查表明,在人工饲养的鹿场中牛结核种内感染的危险系数增加。感染了牛结核的梅花鹿产茸量下降,身体消瘦,对经济和公共卫生产生不利影响。对于野生动物,使用皮内结核菌素检测结核病时受到许多的限制,野生动物难以捕捉,每一物种的使用剂量及阳性判定没有统一标准,同时,TST本身也存在很大的缺陷。因此,研究敏感特异的梅花鹿结核新型诊断抗原和诊断方法,是控制梅花鹿结核病的当务之急。牛分枝杆菌(M.bovis)是细胞内寄生菌,RV3872、CFP-10和ESAT-6是M.bovis感染机体后分泌的主要抗原,诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时,灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强,而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题也已凸显出来,鉴于以上原因,本研究之一是对叁种牛分枝杆菌抗原蛋白(RV3872、CFP-10和ESAT-6)进行了融合表达,旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。CFP-10和ESAT-6已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原,仅存在于致病性结核杆菌中,而在BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。而且在结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌中同源性达到100%,许多研究已经证实是非常有前景的鉴别诊断抗原,可以区分结核分枝杆菌(Mycobacterial tuberculosis,MTB)自然感染还是接种了卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)。其融合蛋白CE(cfp10-esat6)具有单个抗原的免疫学活性。胶体金免疫层析技术(Gold-Immunochromatographic Assay GICA)是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高,而且不需昂贵仪器设备,操作简单快速。本论文利用融合蛋白CE(cfp10-esat6)建立了一种胶体金免疫层析法,旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法;同时克隆了RV3872基因,表达了RV3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白。主要研究内容归纳如下:1.表达和纯化CFP-10-ESAT-6融合蛋白并对其相关特性进行分析诱导表达融合蛋白CE(cfp10-esat6),提纯蛋白质,并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白CE(cfp10-esat6)的多抗反应,说明该融合蛋白具有两个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示,融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性,作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2.牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理,用融合蛋白CE(cfp10-esat6)作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果波长为524nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为7.5;抗原最适标记量为每毫升胶体金0.96μg;抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗CE(cfp10-esat6)蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL,抗体效价为1:2~(10);交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。3.梅花鹿结核特异性抗体间接ELISA检测方法的建立建立了MPB83-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA和MPB70-83-CE-ELISA,抗原包被浓度分别为100ng/mL,500ng/mL,500ng/mL和血清稀释度分别为1:800,1:200,1:200。OD_(630)临界值分别为0.4,0.5,0.5。重复试验表明建立的梅花鹿结核特异抗体ELISA检测具有良好的可重复性。4.牛分枝杆菌特异性抗体间接ELISA方法和胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病胶体金抗体检测试纸条检测637份梅花鹿血清,同时用间接ELISA方法检测相同样品。结果表明它们之间有很高的符合率,为92.15%,快速检测牛分枝杆菌抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,在牛分枝杆菌的检测方面,具有良好的应用前景。5.RV3872、CFP-10和ESAT-6的融合表达酶切回收pET28a-cfp-10-esat6和pMD19-RV3872 T载体目的片段,然后将回收的pET28aCFP-10-ESAT-6线性片段、RV3872基因片段和退火的双链adapter进行连接反应,连接产物转化DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET28aRV3872-CFP-10-ESAT-6,质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞后,经IPTG诱导获得以可溶形式表达的融合蛋白。
许礼义[6]2010年在《牛分枝杆菌ESAT-6和MPT83蛋白的表达、纯化及其在ELISA方法中初步应用的研究》文中研究说明牛结核病主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种牛的慢性消耗性传染病。牛结核病的传播流行不仅会严重影响到畜牧业的健康持续发展,而且还严重威胁着人的健康。鉴于以上问题,牛结核病的新型疫苗及特异、快速诊断试剂的研究具有重要意义。分泌蛋白是目前研究较多的结核杆菌特异性抗原,ESAT-6和MPT83蛋白是牛分枝杆菌分泌的早期滤液蛋白,在牛结核病血清学诊断和预防疫苗的应用中都有重要作用。根据GenBank提供的ESAT-6和MPT83的基因序列自行设计引物,以牛分枝杆菌标准菌株的DNA基因组为模板,通过PCR方法扩增目的基因。将ESAT-6基因片段克隆于原核表达载体pET22b、MPT83基因片段克隆于原核表达载体pET28a,构建重质粒pET22b-ESAT-6和pET28a-MPT83。将两者分别转化至感受态细胞DH5a(DE3)中,经酶切和PCR鉴定和测序筛选阳性克隆。然后再将两者分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经酶切、PCR和测序后,挑选单个含重组质粒的工程菌阳性克隆进行IPTG诱导表达。利用Western-Blot对表达产物进行免疫原性分析。结果表明本实验原核表达的目的蛋白具有较强的免疫原性,从而为牛结核病间接ELISA检测方法的建立及其亚单位疫苗提供了候选蛋白。将得到的两个具有较强免疫原性的ESAT-6和MPT83蛋白分子经His-Bind亲和层析柱纯化,并经半透膜透析复性,并用其分别作为抗原,建立牛分枝杆菌特异性抗体间接ELISA实验方法。本研究在前人研究的基础上,对建立的ELISA方法的抗原包被浓度和血清稀释度、酶标二抗浓度、阴阳性判定及底物反应时间等方面进行了探索和改进。并用已建立的两种间接ELISA方法分别对285份PPD阳性牛血清、74份PPD阴性牛血清、79份牛γ-干扰素(IFN-γ)检测阳性血清进行检测。其ESAT-6-ELISA检测法的符合率为62.1%、98.64%、83.54%；其MPT83-ELISA检测法的符合率为57.19%、100%、78.48%。表明本研究所建立的ELISA方法可用于牛结核病的普查及适时监测。本研究成功克隆、表达和纯化了ESAT-6和MPT83重组蛋白,并用其建立了牛分枝杆菌ELISA抗体检测方法,渴望开发成诊断试剂盒,为我国牛结核病的防控提供技术支持。
刘芳[7]2009年在《牛分枝杆菌Mb1761c和Mb2277基因表达产物免疫原性及其在ELISA方法中的初步应用的研究》文中研究指明牛结核病主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MTB)引起的一种人兽共患传染病,它严重危害人的健康和畜牧业的发展,且导致巨大的经济损失。因此,对牛结核病的防控显得格外的重要。然而,缺乏可用于检测结核杆菌的特应性靶标分子及用于研制有效疫苗的候选分子是结核病防治面临的棘手问题,因此,发掘这些重要分子就成了结核病防治研究的热点。分泌蛋白是目前研究较多的结核杆菌特异性抗原,本实验筛选出Mb1761c和Mb2277两个分泌蛋白,在利用生物信息学方法对其信号肽和疏水跨膜区进行分析的基础上,通过实验生物学方法,对其表达免疫原性进行了验证。本研究主要分为以下两个方面的内容:(1)牛分枝杆菌Mb1761c和Mb2277蛋白的免疫原性的初步研究。根据GenBank提供的Mb1761c和Mb2277的基因序列设计引物,通过PCR方法扩增出目的基因,构建重组表达质粒,原核诱导表达后,利用Western-Blot对表达产物的免疫原性进行验证。结果表明目的蛋白具有较强的免疫原性,从而为进一步研究其亚单位疫苗及ELISA检测方法提供了候选蛋白。(2)重组蛋白在ELISA检测方法中的初步应用研究。将筛选得到的两个具有较强免疫原性的蛋白分子Mb1761c和Mb2277作为抗原,分别进行ELISA实验。结果表明Mb2277的灵敏性较强。将两个蛋白按照不同比例混合作为包被抗原,结果显示将两种重组蛋白按1:1混合包被,ELISA的灵敏度高于单个抗原包被的。本研究筛选鉴定了分枝杆菌两个具有免疫原性的蛋白分子,为进一步建立结核杆菌的ELISA检测方法和研制新型疫苗奠定了基础。
牛红霞[8]2015年在《结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的研究和抗持留菌药物的筛选》文中进行了进一步梳理研究背景结核病(tuberculosis)是一种严重危害全球的重大传染性疾病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)感染引起。结核病的病死率在传染性疾病中居于第二位,仅次于人免疫缺陷病毒感染(human immunodeficiency virus,HIV)的致死率。我国是结核病高发国家之一,其发病率和死亡率长期据我国甲、乙类传染病前列,占全球总结核病病例数的11%。结核病难于控制的主要原因是缺乏有效的结核病疫苗。另外,结核分枝杆菌可以在人体巨噬细胞内以潜伏状态存在,借此逃避机体免疫系统和药物对其的杀伤作用。卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)是目前临床应用广泛的预防结核病的疫苗,但是接种BCG预防结核病的保护效应不确定。BCG接种可以预防儿童患严重的粟粒性结核及脑膜炎结核,但是BCG的保护性免疫反应随着年龄的增加逐渐减弱,对成人肺结核缺乏有效的免疫保护。目前,处于研究阶段的新型结核分枝杆菌疫苗包括活菌疫苗和亚单位疫苗。人们普遍的观点认为,亚单位疫苗可以用于加强BCG免疫所引起的免疫应答,进而延长并维持BCG的保护效果。我们前期共构建并评价了 6个融合蛋白亚单位疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4(EAMM),Mtb10.4-HspX(MH),ESAT6-Mtb8.4,Mtb10.4-Ag85B,ESAT6-Ag85B和ESAT6-RpfE,发现EAMM保护效果最好。此外,EAMM(仅由结核分枝杆菌复制期抗原组成)和MH(由结核分枝杆菌复制期和潜伏期抗原组成)联合应用时,其保护效果比单独应用时更好。研究目的为了建立对不同生长状态结核分枝杆菌的免疫力,本研究选择具有免疫优势的结核分枝杆菌复制期抗原和休眠期抗原,构建融合了结核分枝杆菌多阶段抗原的亚单位疫苗。此外,探索抗原剂量和免疫调节剂雷帕霉素对亚单位疫苗所诱导的免疫记忆的作用,以研究影响亚单位疫苗长期保护效率的因素。研究方法在本研究中,我们结合结核分枝杆菌复制期抗原ESAT6,Ag85B,MPT64,Mtb8.4 和潜伏期抗原 HspX,构建融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64(190-198)-Mtb8.4-HspX(EAMMH),因分子量为69kD,简称为LT69。融合蛋白构建成功之后,我们用大肠埃希菌BL21对其进行表达,并利用盐析和层析技术相结合的方法将其分离纯化。融合蛋白LT69和佐剂阳离子脂质体二甲基叁十六烷基钱(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidyli cacid,PolyI:C)混合,构建结核亚单位疫苗。然后,我们将LT69疫苗免疫小鼠,检测该疫苗在小鼠体内诱导的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答;疫苗末次免疫30周后,将疫苗免疫的小鼠用结核分枝杆菌H37Rv株经呼吸道感染,评价该疫苗在小鼠体内抗结核的保护效果。此外,将不同剂量(50μg、10 μg和2μg)的LT69疫苗免疫小鼠,检测不同剂量的疫苗所诱导的免疫记忆的差异,并评价不同剂量疫苗免疫所产生的长期保护效果。同时,我们将LT69疫苗和雷帕霉素联合免疫小鼠,评价雷帕霉素对LT69疫苗所诱导的记忆性T细胞的影响,及其对疫苗长期保护效果的影响。研究结果成功构建了融合蛋白LT69。LT69在大肠埃希菌BL21中高效表达,应用硫酸铵盐析和层析相结合的方法成功将其分离纯化。LT69疫苗在小鼠体内诱导产生高水平的抗原特异性IFN-,γ、IL-2和抗体IgG1、IgG2c。结核分枝杆菌H37Rv(50-100 CFU)经呼吸道气雾攻击小鼠后,LT69疫苗(10μg)免疫组小鼠肺脏的结核菌载量(5.85±0.39 Log10 CFU)和BCG免疫组(6.01 ±0.33 Log10 CFU)相当,低剂量LT69免疫组小鼠肺脏的结核菌载量(5.38±0.35 Log10 CFU)低于BCG组。抗原剂量研究表明,低剂量LT69(2μg)疫苗接种小鼠产生的IFN-y的分泌水平在疫苗末次免疫6周和高剂量组没有明显差异,但在疫苗末次免疫24周要明显高于高剂量(10μg和50μg)组,说明低剂量疫苗诱导了较长期的细胞免疫记忆。在疫苗末次免疫30周后进行的攻毒试验表明,低剂量LT69免疫组小鼠肺脏的结核菌载量低于高剂量组和BCG组,和免疫检测结果一致。雷帕霉素和疫苗LT69联合免疫,24周后进行体外脾脏淋巴细胞功能检测。特异性抗原刺激后,雷帕霉素联合免疫小鼠脾细胞所产生的IFN-γ分泌水平明显高于疫苗单独免疫组。经尾静脉用5 106CFU的BCG攻击小鼠,雷帕霉素联合免疫小鼠体内的细菌载量低于疫苗单独免疫组0.8-log10 CFU。结论结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69同时融合了结核分枝杆菌复制期抗原和休眠期抗原,免疫机体后可以清除不同代谢状态的结核分枝杆菌。LT69在小鼠体内具有较强的免疫原性,其保护效果达到和BCG相当的水平。低剂量的疫苗比高剂量的疫苗诱导产生更长久的免疫记忆,长期保护效果也更强。雷帕霉素处理可以促进LT69疫苗诱导产生更多长期记忆性T细胞,从而提高疫苗的长期保护效果。研究背景持留菌(persister)是在效果非常强的抗生素(lethal antibiotics)或者压力(stresses)的作用下能够继续存活的一小群静止期的细菌,这群细菌在适当的条件下可以继续增殖。持留菌的存在造成感染患者体内细菌的潜伏和治疗后的反复发作,使细菌感染性疾病的治愈面临挑战。目前所使用的抗生素中,除了治疗结核病的药物吡嗪酰胺(PZA)具有一定的抗持留菌的作用外,其他大部分的药物只针对复制期代谢比较活跃的细菌起作用。探索针对持留菌有效的药物,是治疗细菌感染性疾病的有效措施和手段。目前所使用的抗生素对持留菌没有治疗效果的主要原因是,在筛选抗菌的药物时人们通常使用的是代谢活跃的复制期的细菌,而没有考虑用持留菌模型进行药物筛选。研究目的本研究试图建立包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusawrews,S.awreius)、大肠埃希菌(Escherichia co/i,E.coli)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M/wberculosis)在内的持留菌体外模型,从一些临床应用的化合物中筛选抗细菌持留菌的有效药物,为临床细菌持续感染性疾病的治疗提供一些新的指导。研究方法在持留菌的研究领域,人们常用抗生素处理稳定期细菌6-8小时来建立持留菌模型。在本研究中,我们用抗生素ofloxacin或者酸性和饥饿的压力条件处理细菌,在抗生素或者压力条件下生存下来的细菌即为持留菌。我们建立了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌持留菌模型,然后从FDA批准的化合物库中筛选针对这些持留菌的药物。最后,将筛选出来的有一定效果的药物在体外进行效果验证,并进一步在动物体内进行药物效果的评价。研究结果我们发现tosufloxacin对金黄色葡萄球菌持留菌具有很好的杀菌作用;tosufloxacin和colistin对大肠埃希菌持留菌具有很好的作用效果;蓖麻油酸钾(potassium ricinoleate)、喹哪啶(quinaldine)、四环素(tetracycline)、硝苯地平(nifedipin)、苏合香脂(storax)和阿西美辛(acemetacin)在和PZA联合应用时,可以明显提高PZA对结核分枝杆菌持留菌的杀菌作用。结论在本研究中我们成功建立了持留菌体外模型,并初步筛选到一些用于治疗持留菌的药物。所筛选的药物有望用于临床细菌感染性疾病的治疗,从而提高该类疾病的治疗效果、缩短治疗疗程和避免疾病的复发。
冯向辉[9]2010年在《牛结核胶体金免疫层析诊断方法的建立和初步应用》文中认为牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M. bovis)引起的一种人畜共患传染病。该病的流行与传播不仅阻碍着畜牧业的可持续发展,而且严重的威胁到食品和公共卫生安全。目前,控制牛结核的唯一方法是通过“检疫—扑杀”措施淘汰阳性牛,因此,准确而及时的诊断方法对该病的控制极为重要,牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test TST )是国际卫生组织唯一推荐的检测方法,但该方法存在非特异性反应和因细胞免疫水平下降引起的假阴性反应等不足,使得结核菌素皮内变态反应的准确性受到质疑。因此,研制简便、快速、敏感性高、特异性强的牛结核病的诊断方法对牛结核病的控制有着重要意义。利用DNAstar对牛结核分支杆菌的叁个主要抗原mpb70、mpb83、esat-6的基因序列进行预测分析,将预测的抗原指数高的抗原表位基因序列经全基因合成后,将其连接到表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET28a-mpb-70-83-esat-6,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果检测到蛋白分子量约为21ku的重组蛋白。经NI-NTA纯化重组蛋白后经Western blot鉴定,结果显示该重组蛋白可被牛结核分支杆菌的多克隆抗体识别,表明其具有很好的反应原性。根据胶体金免疫层析技术原理,用健康牛血清IgG和大肠杆菌表达的牛结核分枝杆菌MPB70-83-ESAT-6蛋白分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获杭原,制备牛结核抗体检测试纸条,并对其最佳工作条件进行确定。结果:样品垫和金标垫的最佳处理液分别为PH8.0的含3%BSA、0.1%Tween-20的Tris缓冲液和PH8.0的含3%BSA、6%蔗糖、0.1%Tween-20的Tris处理液;MPB70-83-ESAT-6抗原的最适包被浓度为2.5mg/mL;研制的试纸条不与牛副结核病、牛巴贝斯病、口蹄疫和牛传染性鼻气管炎病阳性血清反应,具有较高的特异性;该试纸条的最低检出稀释度为1:640;用制备的试纸条检测临床样本血清并与TST进行比较,试纸条与TST的符合率为80%。将制备的试纸条置室温密封保存,分别在保存1、3、5个月后用试纸条检测牛结核阳性血清和阴性血清,试纸条在室温保存1、3、5个月后其对阴阳性血清的检测结果与保存前均相同。该试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为牛型结核菌素皮内变态反应(TST)的辅助诊断方法,具有良好的应用前景。
姜秀云[10]2005年在《牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆、表达及免疫研究》文中研究表明牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病,该病的流行与传播不仅严重地影响着畜牧业的持续发展,而且也严重地威胁和危害着人类的生命与健康,被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病。人结核病的10%以上是由牛分枝杆菌引起的。近年来,人结核病在世界范围内大幅回升,每年死亡人数高达300万,是其它传染病死亡人数之和,当属传染病之魁首。由于牛结核病的存在,致使人结核病最终无法根除。近年来,牛结核病在全球范围内也呈上升趋势,尤其是在广大的发展中国家流行严重,我国牛结核的阳性检出率为10%左右。在牛结核病的预防上,目前唯一可用的疫苗就是卡介苗(BCG),但是接种BCG后免疫效果不确定,同时还干扰牛PPD的变态反应检测,无法区别是自然感染还是人工免疫,给日常检疫工作带来了相当的困难。因此研发牛结核病的新型诊断和预防制剂已成为控制牛结核病的研究热点。 结核分枝杆菌是细胞内寄生菌,机体抵抗结核分枝杆菌的感染主要依靠细胞免疫。研究发现,结核分枝杆菌培养滤液中存在的大量分泌蛋白能有效地诱发对结核分枝杆菌的抵抗性,产生免疫保护作用,因此分泌蛋白是保护性抗原。DNA疫苗能有效地刺激机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,而且DNA疫苗在细胞内表达的蛋白抗原通过MHC I类分子呈递抗原,激活CTL及杀灭靶细胞是DNA疫苗发挥保护作用的最主要机制之一,这正是抗结核感染所必需的。另有研究指出,DNA疫苗免疫后,不干扰结核病的变态反应检测。为了研制牛结核病敏感、特异的诊断试剂和新型、高效的预防制剂,尤其是DNA疫苗,本研究进行了以下几方面的工作: 1、牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆筛选了M. bovis Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七种分泌蛋白的保护性抗原基因。以M. bovis Vallee111染色体DNA为模板,以Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,分别扩增出888bp、858bp、801bp、390bp、492bp、603bp和288bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,以α-互补法、质粒大小鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析鉴定重组克隆,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6。序列测定及同源性分析表明,所获得的M. boris Vallee111成熟蛋白基因与M. bovis中其它菌株相应基因具有高度的同源性。 2、主要保护性抗原基因的原核表达 为了获得M. bovis七个保护性抗原基因的表达产
参考文献：
[1]. 牛结核病胶体金免疫层析方法的建立与初步运用[D]. 张书环. 华中农业大学. 2007
[2]. 结核分枝杆菌特异性抗原的制备及其抗原性的初步研究[D]. 周丽蓉. 重庆医科大学. 2004
[3]. 结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究[D]. 李红霞. 四川大学. 2007
[4]. 结核分枝杆菌抗原定量检测技术的建立及其初步评价[D]. 戴振华. 中国人民解放军军事医学科学院. 2014
[5]. 梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用[D]. 匡有吉. 华中农业大学. 2008
[6]. 牛分枝杆菌ESAT-6和MPT83蛋白的表达、纯化及其在ELISA方法中初步应用的研究[D]. 许礼义. 新疆农业大学. 2010
[7]. 牛分枝杆菌Mb1761c和Mb2277基因表达产物免疫原性及其在ELISA方法中的初步应用的研究[D]. 刘芳. 上海交通大学. 2009
[8]. 结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的研究和抗持留菌药物的筛选[D]. 牛红霞. 兰州大学. 2015
[9]. 牛结核胶体金免疫层析诊断方法的建立和初步应用[D]. 冯向辉. 河北农业大学. 2010
[10]. 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆、表达及免疫研究[D]. 姜秀云. 吉林农业大学. 2005
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