滕建北 梁子宁（通讯作者）
广西中医药大学 广西南宁 530001
随着植物组织培养技术的成熟，其在中药材生产方面的应用日益广泛。利用植物组织培养技术进行药用植物的快速繁殖，有效地解决了部分药用植物、尤其是珍稀药用植物的繁殖难题，为保障药材供应、保护野生药用资源作出了重要贡献。我校的一些专业，如中药资源学、药学、中药学等，开设了“药用植物组织培养”课程，并开出全校性选修课对学生开放。使学生们对药用植物组织培养的原理、技术系统及其应用有了很好的了解和掌握，对这一新技术在药用植物种苗快繁、脱毒、复壮，药用有效成分的生产，药用植物资源保护、人工生产和可持续利用等方面的巨大作用有了深刻的认识。但组培快繁技术在原理上即存在产生遗传变异的可能性，在实际生产过程中也出现了影响中药材品质的现象。对这一点，各个相关院校（也包括我校）在授课过程中未引起足够的重视。因此，本文就组培快繁中遗传变异对中药材品质的影响进行初步探讨，以期为完善授课内容、在实践中进一步重视起到抛砖引玉的作用。
1．药用植物组培快繁应用广泛，已成为成熟的常规技术。
1937年，White认为在特定环境下植物的全能性处于被抑制状态，而这些特定的环境一旦改变，其全能性必将重新表现出来，于是开展了如何激发植物细胞全能性的研究，细胞全能性的发挥、也就是培养材料的再生能力，是组织培养成功与否的关键[1]。植物组织培养以植物细胞的全能性为理论基础，应用无菌培养的方法，在人工调控的条件下培养植物的一个离体部分使其生长或发育。该方法开始于19世纪后半叶，至今已发展成为一项成熟的常规技术。药用植物的快速繁殖即是利用组织培养方法将植物体某一部分组织（或细胞）进行培养，并诱导分化成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。组培快繁是解决很多药用植物自然繁殖能力低、资源匮乏等问题的重要技术，且因其属于无性繁殖，可以避免有性生殖常常引起的后代性状分离的问题。
我国药用植物的组培研究，是从1964年罗士韦教授等对人参组织的培养开始的。目前的一个重要应用方向就是快速繁殖生产大量种苗以满足药用植物人工栽培的需要。组培苗具有繁殖系数高、幼苗规格统一、可脱病毒、生产不受季节限制、可工厂化生产等特点，这使药用植物快速繁殖技术在中药材规模化、规范化种植中可以发挥巨大作用。通过几十年来药用植物的组培快繁研究，现己有铁皮石斛、金线莲、罗汉果、广豆根、番红花、人参、贝母、地黄等几百种植物获得试管苗，并应用于生产[2]，或有统计认为，有上百种药用植物，如石斛、桔梗、丹参、地黄、半夏、杜仲、怀山药、麻黄、银杏、肉苁蓉、黄芪、桔梗、五味子、何首乌等组培快繁获得了成功[3，4]。总的来说，具体数量难以统计，但可以肯定药用植物组培快繁技术已在全国中药材生产中广泛应用，有力地保障了药材供应，在中药资源的可持续利用方面发挥着越来越大的作用。
2．中药的品质受遗传因素主导
中药的品质，广义而言指的是一组中药固有特性（如种质、立地条件、栽培、采收、产地加工、储存、炮制、用法等），这些特性能达到中药临床要求，其主要研究范畴是遗传品质、环境品质、栽培品质、形态品质、加工品质、化学品质、效用品质。其中遗传品质研究是基础和前提，遗传品质指药材的生物遗传的特性和优势，如物种遗传多样性、优质的品种、品种多样性等，这些生物特性是否适宜优质药材的生产，决定了中药的临床价值。遗传因素对生物（药用植物）形态特质、代谢特质的形成起主导作用，被归纳为中药品质的遗传主导论[5]。
3．组培快繁可对遗传因素产生重大影响从而影响中药材的品质
组织培养的理论基础为细胞全能性理论，但已有的研究表明，该理论在某些情况下需要修正。对中国兰花艺向表型与其细胞培养分化状况的研究表明：中国兰花的每一个细胞所具有的信息量不一样，不包含母株全部遗传的密码。因此，全能性在中国兰花里不具有完全有效性[6]。亦有学者提出“植物细胞全能性部分表达”的概念，认为：当胚性细胞分化、发育成为植株时，这种表达是完全的。但在很多的情况下，胚性细胞往往只分化为部分器官，如营养芽、根，或花芽、果实，这些器官只是完整植株中极小的一部分。那么全能性的这种表达就只能说是部分的。全能性的部分表达是植物细胞的一种特性[7]。
研究表明，组培技术所获得的植株在遗传上并非完全与母体一致，存在“体细胞无性系变异”，也即植物细胞经组织培养产生的遗传变异。体细胞无性系变异是植物组培中的普遍现象[8]。Larkin和Scowcroft把无性系变异的可能起源归为7类：染色体组型变异 [9]，染色体重排造成的基因丢失、或使隐性基因产生表现型效应，转座因子的激活，由转座引起突变，体细胞基因重排，基因的扩增和消减，体细胞姊妹染色单体的替换，潜在病毒的淘汰[10]。在分子水平上，体细胞无性系在DNA分子水平上可发生点突变、DNA甲基化变化、DNA总量变异、转座因子的激活、细胞器DNA的修饰，以及RFLP和RAPD多态性变异等现象；转座因子也被证实是许多不稳定遗传现象的起因。
一般而言，在组培过程中叶绿体DNA是稳定的，但有报道，小麦花药培养中出现的白化苗，其叶绿体基因丢失率达到80%；线粒体DNA在组培过程中的变异也有报道[11]。随着分子生物学的快速发展，RFLP、RAPD等DNA分子标记技术被用来检测组培过程中某个基因是否发生了突变。但实际上，植物的性状多是由多个基因调控的，而目前关于组培中多基因突变的分子生物学检测报道甚少[12]。
近年来关于药用植物组培快繁过程中产生变异已有报道，如：以霍山石斛不同外植体进行继代培养，利用RAPD、ISSR以及DALP 3种分子标记方法对不同继代次数的霍山石斛试管苗进行分析，结果表明：以成熟种子或茎段为材料的继代培养，未检测到试管苗后代发生变异，具有较高的遗传稳定性。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆以愈伤组织为材料的继代培养则从第4代开始可检测到变异。但在4代以内仍可稳定遗传[13]。对铁皮石斛的种苗进行RAPD检测发现，代数相差越大其遗传距离就越大，从第4代始，有部分引物RAPD带型发生变化[14]。用真叶和未成熟子叶分别做外植体，诱导出的甜瓜（瓜蒂入药）再生植株的根尖细胞染色体数目均存在明显变异[15]。相关研究也认为，离体培养过程中植株生长条件的改变、尤其是一些生长调节物质的加入，可加大组培材料发生变异的几率[16]。在含有不同附加成分的MS培养基上诱导的掌叶半夏愈伤组织及再生植株都有染色体变异；2，4-D、AgNO3、蔗糖等对染色体的结构变异有一定影响；不同代数间的愈伤组织分化出的再生植株染色差异明显[17]。对黄花棘豆、甘肃棘豆和宽苞棘豆（可药用）的体外植株再生实验表明：3种植物的体外植株再生显示了遗传差异。通过分析3种植物在脱分化和再分化过程中，L一苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶的活性、同工酶酶谱的变化、质体的超微结构的变化，表明同属的不同植物种间体外植株再生的遗传差异与相关的核基因表达及质体基因的表达特性相关[18]。利用电泳和分光光度法对添加不同激素组织培养的绞股蓝愈伤组织的过氧化物酶（POD）同工酶及总皂苷含量进行了测定。结果表明：添加NAA培养的愈伤组织的POD同工酶在阴极区酶带活性强，添加BA培养的愈伤组织的POD同工酶在阳极区产生了新的酶带，同时添加NAA、BA、2 4- D三种激素培养的愈伤组织的绞股蓝总皂苷含量最高[19]。
上述研究报告表明药用植物的组培快繁过程中产生了遗传变异，并初步揭示了组培过程对药材质量的影响。
4．建议：药用植物组培课程应注重“组培过程中的遗传变异” 以及“遗传变异与中药材品质关系”的讲授
如上所述，组培快繁生产中药材可能产生遗传上的变异，其变异程度如何？是否已影响到中药材品种的一致性？所获得的中药材与与野生或传统繁殖（生殖）生产的中药材质量上成分上是否有差别、进而影响中药材的安全性有效性和稳定性？这些问题要讲得比较明确，特别是上述引起组培过程中的遗传变异的原因要讲得清晰、明白，使学生对其引起足够的重视，在理念上树立“植物组织培养过程中遗传变异的存在是广泛的”、“遗传变异的积累可能引起中药材品质的变化”的认识，并了解和掌握以下几方面的对策：
4.1 进行组培快繁幼苗的品种研究
从分子生物学（含基因组学[20]）、植物生理学等角度，通过对遗传多态性、生理指标（含代谢基因组学[20]）的对比，明确不同培养条件下，组培快繁幼苗与野生或传统繁殖（生殖）幼苗的异同以及变异程度。
4.2 进行栽培过程的对比研究
综合运用植物生理学、发育学、生态学、生物化学等方法，对组培快繁幼苗与野生或传统繁殖（生殖）幼苗进行生长发育、形态建成、生理特性、物质代谢（含次生物质代谢）的对比研究。
4.3 进行中药材质量及药效的对比研究
运用性状评价、显微特征、色谱、光谱特别是中药材特征图谱的方法，进行组培快繁与野生或传统繁殖（生殖）生产中药材的质量评价和对比；参照传统中药理论为指导，制定适宜的药效检测指标，进行安全性、有效性的对比研究。需要着重指出的是，由于中药材的特殊性，进行化学成分对比评价研究时，应以与野生或传统繁殖（生殖）生产中药材的近似度为优劣指标，而不应以某种活性成分含量高低为指标。按照中医药理论配伍人药的药材，重在稳定质量，不宜提倡高活性成分含量[21]。
根据上述系列对比研究的结果，以组培快繁幼苗与野生或传统繁殖（生殖）生产中药材的一致性为原则，制定最优的组培快繁方案。广泛深入开展相关研究，将为保证中药材的品质、保证中药的安全性和有效性提供技术支持，促进组培快繁技术在中药材生产中的应用，保障中药资源的可持续利用。
总之，在药用植物组织培养应用日益广泛的背景下，加强“组培过程的遗传变异及其与中药材品质关系”内容的讲授，有利于学生建立对植物组培技术的全面认识，增强其相关工作分析问题、解决问题的能力，具有较大的学术价值和实用价值。
参考文献：
[1]Sathyanarayana B N，Varghese D B.Plant Tissue Culture：Practices and New Experimental Protocols，New Delhi，India：I.K. International Publishing Housse Pvt.Ltd.2007.pp1~8
[2]蒙爱东.生物技术在药用植物中的应用[J].广西医学，2006，6：798~790
[3]谭勇，梁宗锁，王渭玲.生物技术在中国药用植物研究中的应用[J].中国农学通报2005，21（10）：41~46
[4]华智锐，李小玲，张伟.生物技术在药用植物中的应用及研究进展[J].湖北农业科学2010，49（4）：978~981
[5]万德光.中药品质研究——理论、方法与实践[M]. 上海，上海科技出版社. 2008.第一版：4~7，18~19
[6]刘仲健. 关于植物细胞全能性理论的修正[J]. 生态经济，1998，14（4）：47~48
[7]陆文樑，梁斌.离体条件下诱导番茄果实状结构的再生[J].植物学报.1994，36（6）：405~410
[8]朱至清，陈英.植物体细胞无性系变异与育种[M].南京，江苏科学技术出版社. 1991. 1~10
[9]孙清荣，孙洪雁，辛力，等.梨多倍体对离体叶片不定梢再生能力的影响[J].植物遗传资源学报，2012，13（1）：134~137
[10]Larkin P J，Scowcroft W R，1981.Theor，Appl Genet，60：197~214
[11]刁现民，孙敬三. 植物体细胞无性系变异的细胞学和分子生物学研究进展[J].植物学通报1999. 16（4）：372~ 377
[12]刘福平.植物体细胞无性系变异的遗传基础及主要影响因素[J].基因组学与应用生物学，2010，29（6）：1142~1151
[13]邱婧，樊洪泓，秦自清，等.利用分子标记检测霍山石斛不同继代次数试管苗的遗传稳定性[J].分子植物育种，2008，6（3）：532~536
14[14]刘石泉，李小军，周根余.铁皮石斛不同繁殖代数遗传稳定性RAPD的研究[J].江南大学学报（自然科学版），2005，4（5）：518~521
[15]丰先红，李健，罗孝贵.植物组织培养中体细胞无性系变异研究[J].中国农学通报，2010，26（14）：70~73
[16]张俊，蒋桂华，敬小莉，等.我国药用植物种质资源离体保存研究进展[J].世界科学技术--中医药现代化，2011，13（3）：556~560
[17]李亮亮，朱宝成，成亚利，等.掌叶半夏组织培养过程中的染色体变异[J]. 农业生物技术学报，1998，6（1）：23~27
[18]刘明志.3种棘豆体外植株再生的遗传差异与相关酶和质体的关系[J].西北植物学报，1997，17（4）：426~432
[19]项艳，章力干，李纯，等. 激素对组织培养绞股蓝生长及酶活性的影响[J].安徽农学通报，1999，5（3）：22~24
[20]李发美，熊志立，鹿秀梅，等.中药质量控制和评价模式的发展及系统生物学对其的作用[J]. 世界科学技术--中医药现代化，2009，11（1）：120~126
[21]张永清.生物技术在现代中药材生产领域的应用及应注意的问题[J].世界科学技术--中医药现代化，2004，6（1）：53~58
作者简介：滕建北，（1973.6-），男（汉族），广西玉林人，副教授，博士学位，主要从事中药品种，品质及资源开发研究工作。
论文作者:滕建北,梁子宁（通讯作者）
论文发表刊物:《健康世界》2015年第14期供稿
论文发表时间:2015/11/20
标签：组培论文; 中药材论文; 植物论文; 药用植物论文; 组织论文; 全能性论文; 品质论文; 《健康世界》2015年第14期供稿论文;