山东省寿光市人民医院 262700
摘要：目的：探讨端粒酶活性检测对慢性粒细胞白血病（CML）的临床意义。方法：选取20例慢性期和10例急性转化期（加速期或急变期）的CML病例，以良性血液病病人和正常人作对照，采用改良TRAP-银染法及亚利恩凝胶成像系统分析检测其骨髓标本内的端粒酶活性水平并随访。结果：良性血液病端粒酶阴性或低水平表达；CML慢性期端粒酶活性中等增高（F=36.38，q=5.84，P <0.01），阳性率达35%（7/20）；急性转化期时端粒酶活性较慢性期显著升高（q=12.06，P <0.01），阳性率达80%（8/10）。端粒酶活性水平与CML预后相关，活性高者往往预后较差。结论：端粒酶活性与CML的发生发展密切相关。端粒酶活性检测可以作为CML诊断、病程监测及预后判断的一个有用的生物学指标。
关键词：白血病；髓样；慢性；端粒酶；诊断；预后
1 资料与方法
1.1 对象及分组 30例CML病人中，初诊的慢性期病人20例，男10例，女10例，年龄23～64岁，平均（43.6± 12.1）岁；急性转化期（加速期或急变期）病人10例，男7例，女3例，年龄15～63岁，平均（35.2±16.2）岁。所有CML病人均经染色体分析证实为Ph阳 性CML。另取25例良性血液病病人及15例正常人为对照。良性血液病包括缺铁性贫血（IDA）14例，巨幼细胞贫血（MA）6例，特发性血小板减少性紫癜（ITP）5例。对照组年龄为18～60岁，平均（30.2± 13.1）岁。所有病人诊断均符合文献［1］标准，正常对照均经骨髓细胞形态学检查排除血液病。
1.2 材料
1.2.1引物 端粒酶底物引物（TS）：5′-AATC-CGTCGAGCAGAGTT-3′；下游CX引物：5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′（上海生物工程公司合成）。
1.2.2主要试剂 Taq聚合酶和牛血清清蛋白购自Promega公司。HEPES、CHAPS、DTT、EGTA、AEBSF购自Sangon公司。
1.2.3主要仪器 2400型PCR扩增仪系美国PE公司产品；凝胶成像分析仪购自YALIEN公司。
1.3 实验方法
1.3.1分离计数MNC 取骨髓液标本常规分离MNC。
1.3.2端粒酶提取 参考文献［2］的方法，取细胞悬液加适量裂解缓冲液［含有10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L MgCl 2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L PMSF，5 mmol/L β-巯基乙醇、体积分数0.005的CHAPS及体积分数0.10的甘油］调整细胞数为107 /L，置-20 ℃保存。
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1.3.3TRAP反应 参考文献［2］方法略加改进，50 μL反应体系［20 mmol/L tris-HCl（pH 8.3），1.0 mmol/L MgCl 2，63 mmol/L KCl，0.05 g/L Tween 20，1 mmol/L EGTA，50 μmol/L dNTPs，0.1 μg TS引物，0.1 g/L牛血清清蛋白，2 μL端粒酶提取液，0.1 μg CX引物，2U Taq DNA聚合酶］30 ℃孵育30 min后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃保温3 min。
1.3.4电泳及银染 PCR扩增产物经120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶置固定液（体积分数0.10的无水乙醇、体积分数0.005的乙酸新鲜配制）中固定，经AgNO3 染色10 min，置显色液（30 g/ L的NaOH、4 g/L的甲醛新鲜配制）中显色保存。
1.3.5端粒酶活性测定 端粒酶阳性结果在凝胶上可见每隔6个核苷酸的梯形条带。用凝胶成像分析软件处理，得出各标本的相对吸光度（A）值代表端粒酶活性。并根据 A 值大小将端粒酶活性分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性4个等级。同时据 A 值大小将慢性期CML分为高活性组（≥2.0）和低活性组（<2.0）。
2 结果
2.1 正常对照组端粒酶活性 经凝胶成像分析系统分析，15例正常对照者骨髓端粒酶活性为0.74±0.57，无1例阳性或强阳性，均呈阴性或较低水平表达。
2.2 良性血液病对照组端粒酶活性 良性血液病组骨髓细胞良性增殖，端粒酶活性为0.73±0.42，无端粒酶阳性或强阳性者。良性血液病组端粒酶活性与正常对照组比较不增高（F=36.38，q=0.18～0.36，P >0.05）。MA、ITP、IDA端粒酶活性分别为0.85±0.54、0.81±0.61、0.64± 0.53，良性血液病之间端粒酶活性差异无显著性（q=0.09～0.44，P >0.05）。
3 讨论
人类大部分的体细胞缺乏端粒酶活性，而大多数的原发性肿瘤和肿瘤细胞株及永生细胞系表达端粒酶活性，因此，端粒酶活性可能反映了一个高度增生的状态［1］，是一种新的肿瘤标记物，与肿瘤发生密切相关。本文结果显示，CML慢性期和转化期端粒酶活性水平均升高，而IDA、MA、ITP等良性血液病及正常人端粒酶均阴性或低水平表达。这表明端粒酶活性与恶性克隆增殖关系密切，有助于良恶性血液病的鉴别诊断。而良性血液病之间端粒酶活性无显著差异，说明端粒酶活性检测不能用于良性血液病之间的鉴别。CML是临床上一种发展较为缓慢的骨髓增生性疾病。目前临床上尚无能预测CML病程进展的实验室指标。DRUMMOND等［2］研究显示，CML端粒酶基因的表达和端粒长度的稳定可影响病程进 3期郭小芳，乔宏，卢伟.慢性粒细胞白血病端粒酶活性检测的临床意义199展。本研究的实验结果证实，在CML转化期端粒酶阳性率高（80%），而在疾病的慢性阶段端粒酶阳性率低（35%），约2/3的病人端粒酶活性阴性或低水平表达，转化期端粒酶活性显著高于慢性期，进一步说明了端粒酶活性升高可能是肿瘤发生过程中极为重要的一个环节，同时说明端粒酶活性与CML临床分期、疾病进展有着密切关系，可能是CML进展过程中白血病细胞增殖的一个分子标志，因此端粒酶活性可以作为一个有用的标志物来评价CML病程的进展。
参考文献：
［1］ 张 之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.第2版.北京：北京科学出版社，1998：258-267.
［2］ 于 建宪，王军华.甲状腺乳头状病变中端粒酶活性的检测［J］.青岛大学医学院学报，2002，38（4）：300-303.
论文作者:王卫东
论文发表刊物:《健康世界》2015年29期供稿
论文发表时间:2016/4/12
标签：活性论文; 端粒论文; 血液病论文; 阳性论文; 凝胶论文; 引物论文; 骨髓论文; 《健康世界》2015年29期供稿论文;