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摘要：本文采用高效液相色谱法测定酱油中防腐剂苯甲酸的含量。根据苯甲酸的性质选择分离分离色谱柱为 C18(4.6mm×250mm,粒径5μm)柱，流动相为乙酸铵-甲醇（91：9），流速1mL/min，柱温30℃。当波长为230 nm时测得苯甲酸标准溶液的浓度与峰面积的线性关系良好，线性回归方程为y=3063.46746x＋0.4971，r2 = 0.9998。一般实验要求加标回收率为90％-110％，苯甲酸检出限量为1g/kg。实验测得加标回收率为96％-98％，三个样品的苯甲酸含量分别为0.39g/kg、0.50g/kg、0.81g/kg，均符合食品安全国家标准。本实验方法简单快捷，准确度，灵敏度也均达到国家相关分析要求，适用于测定酱油中苯甲酸的测定。
关键词：高效液相色谱；酱油；防腐剂；苯甲酸
为了减少防腐剂对人类带来的负面影响，对防腐剂进行一定的分析研究是很有必要的。针对同一防腐剂的检测，不同的检测技术其特异性和快速性等也各有不同。国家食品检测标准GB/T5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》介绍了三种检测苯甲酸的方法，分别是气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。此外据网上报道，可用于检测酱油中苯甲酸含量的方法还有紫外分光光度法、毛细管电泳法等。因高效液相色谱法精确度高、简单、快速，是现阶段测定苯甲酸含量的首选。现重点介绍高效液相色谱法测定酱油中的苯甲酸。
实验主要试剂及设备：
甲醇（GR）；乙酸铵（GR）；苯甲酸钠标准品（GR）；乙酸锌（AR）；亚铁氰化钾（AR）；氨水（≥99.0％）。
高效液相色谱仪（LC-20ADRF）；电子分析天平（BSM--120.4）；超声波清洗仪（SG5200HDT）；高速离心机（TGL-16G-A）。
色谱条件：
以C18柱（4.6mm×250mm,粒径5μm）为色谱柱；以A相1.54mg/mL乙酸铵溶液+B相甲醇溶液（91:9）为流动相；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0 mL/min；检测波长为230nm；检测器为紫外吸收检测器。
一、样品分析
1.样品中苯甲酸含量的测定
精确称取酱油2.0g，置于具塞塑料离心管中，样品称取质量为2.0135g。样品称量后，加水至30mL，再加1mL亚铁氰化钾溶液（10.6％）和1mL乙酸锌溶液（21.9％），混匀。用（1+1）氨水调pH至中性，再用超纯水定容至40mL。盖好管塞，在高速离心机中离心至沉淀完全，清液经微孔滤膜（4.5um）过滤，滤液在超声波清洗仪超声后注入色谱进样瓶中，按色谱条件中所述上机检测、分析。
酱油样品中苯甲酸含量的计算公式：
式中：
y--酱油样品中苯甲酸组分含量，单位为克每千克(g/kg)；
c--由苯甲酸溶液标准曲线得出的样液中苯甲酸的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
v--样品定容体积，单位为毫升（mL）；
m--样品质量，单位为克（g）。
按照相关实验要求，同一实验室内两次独立测定结果的绝对差值应不超过算术平均值的10%，计算结果保留两位有效数字。
2.重复性实验
准确称取酱油样品5份于5支具塞塑料离心管中，样品称取质量分别是2.0129g、2.0036g、2.0437g、2.0152g、2.0082g。按上处前处理方法处理制得样品进样溶液，将制得样液注入色谱进样瓶中，将样品放入液相色谱仪依次进样测定，检测实验的重复性。
3.加标回收实验
准确称取4份酱油样品于4支具塞塑料离心管中，样品称取质量分别为2.0736g、2.0018g、2.0132g、2.0537g。称取样品后向4支离心管中分别加入1mg/mL的苯甲酸标准溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL，充分混合后，按照样品前处理方法处理，将样品放入液相色谱仪检测加标样品的苯甲酸含量，并计算其加标回收率。
二、结果与讨论
样品苯甲酸含量
将样品处理液和0.1mg/mL的苯甲酸标准溶液分别注入色谱进样瓶中，再依次送入仪器，通过高效液相色谱仪进行分离检测。并以苯甲酸标准溶液的峰的保留时间为依据定性，以其峰面积为依据定量，求出样液中苯甲酸含量，供计算。
1.苯甲酸标准溶液色谱特征
图 酱油样液色谱图
通过上图可知，酱油样液在保留时间为10.433min处有峰出现，峰面积为126.9773，该峰是苯甲酸峰，酱油中的苯甲酸浓度为0.041mg/mL。
根据我国国家卫生部发布的相关规定，酱油中苯甲酸含量不得高于1g/kg。通过以上实验数据，计算酱油样品的苯甲酸含量，其苯甲酸含量为0.81g/kg。故酱油的苯甲酸含量符合食品安全国家标准。
3.重复性实验结果
酱油的峰面积分别为126.8773、122.0851、127.1335、128.3456、126.3277，酱油中的苯甲酸浓度分别为0.041、0.040、0.042、0.041、0.041mg/mL。计算结果显示，酱油样品中防腐剂苯甲酸的平均含量为0.812g/kg，重复实验两两之间的绝对差值均低于算术平均值的10％，RSD=1.030％，低于2.0％。实验证明，使用本方法测定酱油中苯甲酸含量重复性良好，结果准确可信。
4.加标回收实验结果
酱油加标0.0125mg/mL
酱油高浓度加标色谱图
通过上图可知，酱油高浓度加标样液在保留时间为10.411min处有峰出现，峰面积为197.4737，该峰是苯甲酸峰，该样液的苯甲酸浓度为0.065mg/mL。
根据实验所得数据，检出浓度分别为0.053、0.065、0.078、0.091mg/mL，计算不同加标水平下苯甲酸的加标回收率，回收率分别为95.92%、98.13%、98.68%、98.36%。
实验要求，加标回收实验的回收率应该在90％-110％之间。根据数据可知，本实验不同加标水平的加标回收率都满足一般实验要求，说明该实验方法是准确可靠的。
4.结论
通过高效液相色谱法检测不同酱油样品的苯甲酸含量，实验测得三个酱油样品的苯甲酸含量分别为0.39g/kg、0.50g/kg、0.81g/kg。国家卫生部发布的GB2760-2014《食品安全国家标准，食品添加剂使用标准》规定酱油中苯甲酸含量不得高于1g/kg，故三种酱油的苯甲酸含量均符合食品安全国家标准。将同一酱油样品在相同色谱条件下进行多次检测，重复性实验的RSD=1.030%<2%，证明实验重复性良好。通过加标实验，在不同加标浓度下，测得苯甲酸的回收率都在90%-110%之间，回收率符合一般实验要求。综上所述，该实验方法的系统误差小，精确度高，结果较为可靠，完全满足国家质量监督和卫生部门的检验要求。本实验方法样品前处理简单，测定速度快，结果准确可靠，也可用于汽水，配制酒类中苯甲酸含量的检测。
论文作者:王勤
论文发表刊物:《防护工程》2017年第21期
论文发表时间:2017/12/25
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