方亮[1]2007年在《新型CA-4类化合物MZ3的抗白血病作用与其机制研究》文中指出目的:评价新型CA-4类化合物MZ3对白血病体内与体外的抑制作用,研究MZ3的抗白血病作用机制。方法:采用MTT法评价MZ3体外抑制六种人白血病细胞(NB4,Molt-4,HL60,K562和耐药细胞株HL60R,K562R)的活性,测定MZ3对这六株细胞的IC_(50)值;采用荷HL60人白血病细胞的SCID小鼠模型评价MZ3体内抗白血病活性,绘制小鼠的存活曲线,计算中位生存时间(mediam survival time,MST)。采用DAPI染色观察MZ3诱导K562产生的凋亡小体;采用DNA电泳检测MZ3诱导HL60和K562细胞产生的DNA梯状电泳;采用PI染色结合流式细胞术检测MZ3诱导HL60和K562细胞凋亡的作用。采用JC1染色结合流式细胞术检测MZ3对HL60细胞线粒体膜电位(mitochondrial membranepotential,ΔΨm)的影响;采用Carboxy-DCFDA染色检测MZ3对HL60细胞活性氧族(reactive oxygen species,ROS)含量的影响;采用PI染色结合流式细胞术检测MZ3对K562细胞周期分布的影响;采用免疫荧光法观察MZ3对K562细胞内微管蛋白的影响;采用Western blotting检测MZ3对HL60和K562细胞中凋亡相关蛋白(caspase-3,PARP)的影响,MZ3对HL60细胞中线粒体相关蛋白(ERK1/2,P38,JNK,p-ERK1/2,p-P38,p-JNK,Bax,Bcl-2)的影响,MZ3对K562细胞中周期相关蛋白(cyclin B1,cdc2,cdc25C,Wee1,CDK7,MPM-2)和微管蛋白的影响。结果:1.MZ3对所选的六株白血病细胞均有较好的抑制作用,IC_(50)值均小于8.0μM,对白血病耐药株也呈现较好的抑制活性,对NB4,Molt-4,HL60和K562的IC_(50)值分别为1.2±0.2μM,4.2±0.4μM,2.7±0.2μM,3.4±0.1μM,对白血病耐药株HL60R和K562R细胞的IC_(50)分别为3.5±0.5μM和8.0±0.3μM。2.在荷HL60人白血病细胞的SCID小鼠实验中,对照组6只小鼠在接种HL60细胞后20天内全部死亡,中位生存时间(MST)为15天;而环磷酰胺阳性对照组和MZ3给药组第一只小鼠死亡分别发生在第25和第26天,MST分别为26.5天和33.5天。环磷酰胺(10.0mg/kg)和MZ3(10.0mg/kg)均可以延长白血病SCID小鼠的生存时间,且MZ3效果优于环磷酰胺。3.DAPI染色显示,16.0μM MZ3作用K562细胞24 h后可使细胞产生凋亡小体。DNA电泳结果显示,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用HL60细胞24 h均可使细胞产生凋亡特征性的DNA梯状条带;8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24 h可使细胞产生凋亡特征性的DNA梯状条带。4.流式细胞术结果表明,8.0μM MZ3作用HL60细胞0 h,6 h,12 h,24h,48h和72h均能诱导HL60细胞发生凋亡,其凋亡率分别为0.9%,2.5%,14.2%,30.5%,65.5%和85.4%,呈时间依赖性关系;16.0μM MZ3作用K562细胞0 h,6 h,12 h和24 h均能诱导K562细胞发生凋亡,其凋亡率分别为2.5%,2.8%,5.8%和31.3%,呈时间依赖性关系;0.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24 h能够诱导K562细胞发生凋亡,其凋亡率分别为4.4%,35.0%,36.6%和31.3%K562细胞发生凋亡。5.Western blotting结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞12 h和24 h可使细胞内procaspase-3被切割激活,进而水解其底物PARP,最终诱导细胞凋亡;4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24 h可使细胞内procaspase-3被切割激活,进而水解其底物PARP,最终诱导细胞凋亡。6.JC1染色法检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞0 h,8 h,16 h和24 h可分别可使2.0%,3.0%,18.9%和48.4%HL60细胞呈现绿色荧光,即ΔΨm降低,呈时间依赖性关系。7.Carboxy-DCFDA染色法检测细胞ROS含量结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞0 h,1 h,2 h,3 h和4 h后细胞绿色荧光强度分别为22.9,26.5,38.3,32.4和29.5;细胞内ROS含量在2 h点升到最高,为0 h点的1.7倍,随后ROS含量回到给药前水平。8.1.0μM,2.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3与或不与ROS抑制剂NAC(200.0μM)同时作用HL60细胞72h后分别可抑制8.8±11.0%,59.0±8.7%,81.7±9.1%,87.1±4.2%,87.9±3.6%和17.1±5.2%,57.8±9.1%,82.2±5.2%,86.7±2.8%,87.6±2.1%细胞的生长。说明NAC不能抑制MZ3的细胞毒作用。9.Western blotting结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞6 h,12 h和24 h还可使细胞内Bax呈时间依赖性递增,Bcl-2呈时间依赖性递减,Bax/Bcl-2的比例分别为2.2,15.7和28.5。8.0μM MZ3作用HL60细胞6h,12h和24h可使细胞内P-ERK1/2显着递减,减弱ERK1/2的活性,P-p38和P-JNK显着递增,增强p38和JNK的活性。说明MZ3可通过影响HL60细胞中MAPK家族和Bcl-2家族蛋白的表达和活化,激活线粒凋亡通路,最终导致细胞凋亡。10.流式细胞术结果表明,16.0μM MZ3作用K562细胞0h,6h,12h,24h分别能够使6.1%,11.1%,31.1%和38.1%K562细胞阻滞于G2/M期,呈时间依赖性关系;0.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24h分别能够使10.8%,25.7%,28.2%和38.1%K562细胞阻滞于G2/M期呈剂量依赖性关系。11.免疫荧光结果显示,16.0μM MZ3作用K562细胞24h使得许多细胞内微管数量明显减少。分离细胞内可溶性的微管蛋白(即未聚合的微管蛋白)分离后,通过western blotting检测,结果显示1.0μM,2.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24h后,细胞内的可溶性微管蛋白含量呈剂量依赖性增加,暗示着细胞内聚集状态的微管蛋白有所减少。说明MZ3也可通过影响K562细胞中微管蛋白的聚合,导致K562细胞阻滞于G2/M。12.Western blotting结果显示,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24h后使得细胞内cyclin B1和MPM-2水平升高,cdc2c和dc25C水平降低,Wee1活性增加。说明MZ3可通过影响K562细胞中周期调节蛋白,导致K562细胞阻滞于G2/M。结论:MZ3在体内和体外均有较好的抗白血病作用,且能够对抗多药耐药细胞,为一非常有前景的抗白血病药物。MZ3能够诱导HL60和K562细胞产生凋亡,其机制可能是:1)影响MAPK家族和Bcl-2家族蛋白的表达和活化,激活线粒体凋亡通路;2)影响周期调节蛋白和细胞内微管蛋白的聚合,使细胞阻滞于G2/M期。
杨文华[2]2013年在《活性氧在蓝萼甲、乙和丙素对莴苣的化感调节和HL-60细胞凋亡诱导中的作用研究》文中研究表明蓝萼香茶菜（Rabdosia japonica (Burm. f.) Hara var. glaucocalyx (Maxim.) Hara）为唇形科（Labiatae）香茶菜属多年生落叶植物，广泛分布于中国东北等地。香茶菜属植物富含的对映-贝壳杉烷二萜化合物会随着植株枯萎被释放到土壤中，对其他植物的生长产生抑制或促进作用（化感作用或他感作用，allelopathy）。许多单萜和倍半萜化合物被证实为化感节物质，蓝萼香茶菜含有丰富的贝壳杉烷二萜次生代谢产物如蓝萼甲素（GlaA）、蓝萼乙素（Gla B）和蓝萼丙素（Gla C），它们是否具有强烈的化感作用，以及在其自然生境中是否发挥重要的生态作用？目前尚无相关报道。另一方面，蓝萼香茶菜全草入药，具有抗菌、调节心肌血流量、抗肿瘤活性。我们实验室的前期研究已表明：GlaA可诱导白血病HL-60细胞凋亡，活性氧（ROS）参与了线粒体途径诱导的细胞凋亡，但对ROS来源及其调节方式的研究还未见报道。本研究分别以莴苣（Lactuca sativa L.）和HL-60细胞为对象，探讨Gla A、Gla B和Gla C的化感作用和凋亡诱导机制，挖掘对映-贝壳杉烷二萜化合物诱导的ROS作为植物生长调节和肿瘤细胞凋亡中的信号意义，为深入了解蓝萼香茶菜的化学生态学意义和抗肿瘤药学应用提供理论参考和依据。本论文已成功完成以下四部分内容：一、GlaA-C的化感作用研究初探我们测定了GlaA-C对莴苣种子萌发和幼苗净生长率的影响，发现低浓度的GlaA（20-40μM）和Gla B（20μM）对莴苣根的生长具有促进作用，Gla A（40μM）和Gla B（20μM）作用莴苣幼苗48h后，与对照组相比，处理组细胞长度分别增加了17.34%和14.48%，细胞有丝分裂指数（MI）分别提高了21.59%和28.04%。高浓度（80-200μM）的GlaA、B对莴苣根的生长具有抑制作用，200μM的GlaA、B作用莴苣幼苗48h后，与对照组相比，处理组细胞长度分别下降了35.03%和38.54%，MI分别下降了30.98%和40.34%。另外，20-200μM的Gla A处理48h后，与对照组相比，莴苣根毛长度的下降率为23.39-96.95%，根毛密度的下降率为26.15-86.15%。Gla B处理组中莴苣根毛长度的下降率为15.76-96.71%，根毛密度的下降率为3.46-91.15%，说明Gla A、B对莴苣根毛发育的抑制作用在20-200μM范围内具有浓度依赖性，而Gla C对植物均无影响。本研究结果表明：Gla A、B对莴苣根的生长具有“低浓度促进高浓度抑制”的双向生长调节作用，并且这种调节作用是通过影响根细胞大小和细胞有丝分裂速率来实现的。二、GlaA、B诱导的活性氧与化感作用的关系研究Gla A、B（20-200μM）处理莴苣3h，莴苣根中莴苣中超氧阴离子（O2）分别比对照的增加1.10-1.55倍和1.11-1.65倍，而Gla C处理则不能诱导产生O2。200μM的GlaA、B处理48h后，莴苣根中丙二醛（MDA）水平分别上升了50.74%和77.32%，导致脂质过氧化，产生氧化压力。同时，细胞中抗氧化酶系如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性显着提高，200μM的GlaA处理48h后，莴苣根中的这叁种酶活性分别上升了33.71%、43.83%和81.37%；Gla B处理组中，莴苣根中的这叁种酶活性分别上升了45.37%、60.18%和111.22%，而Gla C处理后不能引起此抗氧化酶系的变化。为了进一步证明ROS在Gla A, B诱导的化感抑制中的作用，我们用ROS清除剂钛铁试剂（Tiron）和二甲基硫脲（DMTU）（100μM）预处理莴苣幼苗2h，发现ROS清除剂能有效缓解Gla A、B对根的生长抑制。本实验结果提示：ROS可能介导了对映-贝壳杉烷二萜化合物如GlaA、B的化感抑制作用，该类化合物在植物化感作用中的化学生态学意义值得进一步研究。叁、GlaA-C诱导HL-60细胞凋亡Gla A在4h、12h、24h、48h的IC50（半数抑制率）分别为34.14μM、23.98μM、6.15μM和4.48μM，Gla B在相应时间的IC50分别为30.84μM、18.68μM、5.86μM和3.61μM，GlaA、B对HL-60的生长抑制具有浓度和时间依赖性，而Gla C经过相应处理后不能对HL-60细胞产生生长抑制作用。我们应用流式细胞仪测定Sub-G1峰表征凋亡，实验结果标明：2-32μM的GlaA处理HL-60细胞24h后，凋亡率为对照的1.18-9.74倍，Gla B处理组中，凋亡率为对照的1.52-10.57倍，而且Gla A、B对HL-60的凋亡诱导具有浓度依赖性，但在Gla C处理组中没有发现相应的凋亡现象发生。另外，Gla A、B能诱导HL-60产生G2/M细胞周期阻滞、DNA损伤和ROS积聚，而Gla C处理组中没有以上作用。本研究表明：Gla A、B能诱导HL-60细胞产生凋亡，而与GlaA、B结构相似的Gla C不能诱导HL-60细胞凋亡。四、活性氧和谷胱甘肽（GSH）在HL-60凋亡诱导中的作用我们应用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）作为探针，用流式细胞仪测定细胞ROS含量，与对照组相比，32μM的Gla A、B处理HL-60细胞3h后， ROS上升了6.70和5.64倍，而Gla C不能诱导ROS产生。GSH系统在生物体内抗氧化和解毒代谢中起着重要作用，我们用1mM的GSH或者GSH前体N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理细胞1h，能显着降低Gla A、B造成的细胞毒害、ROS迸发和细胞凋亡诱导和周期阻滞；而10μM的GSH合成抑制剂丁硫氨酸亚砜胺（BSO）预处理细胞12h后，则加剧细胞的毒害作用。Gla A、B（16-32μM）处理HL-60细胞24h后，分别使细胞内的GSH含量下降19.92%-44.24%和23.81%-53.95%，而Gla C不能影响细胞内的GSH含量。32μM的Gla A、B处理HL-60细胞24h后，谷胱甘肽还原酶（GR）活性分别下降了52.75%、71.02%，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性分别下降了60.47%、67.97%。实验结果标明：含α, β-不饱和酮结构的Gla A、B可能通过直接与GSH反应或间接地使酶（GPX、GR）失活，从而导致细胞内GSH水平下降、引发细胞ROS迸发。本实验结果表明：Gla A和Gla B是具有植物生长调节活性的化感物质和HL-60细胞凋亡的诱导物质，首次证明了ROS可以介导贝壳杉烷类二萜化合物的化感调节和诱导HL-60细胞凋亡，Gla C诱导活性失活提示了贝壳杉烷类二萜化合物可能的生理活性基团—α, β-不饱和酮结构的。我们的研究还揭示了GSH氧化还原系统在ROS介导的贝壳杉烷类二萜化合物诱导的细胞凋亡中的重要调节作用。本实验为探讨蓝萼香茶菜的化学生态学作用和Gla A、Gla B的农业应用提供了依据，为贝壳杉烷类二萜化合物作为抗肿瘤先导化合物提供了理论参考。
马媛媛[3]2016年在《Surfactin对舌鳞癌Tca8113细胞株增殖、凋亡和迁移影响的研究》文中提出目的:初步探讨枯芽孢杆菌发酵产物Surfactin对体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞株发生和发展影响。方法:观察细胞的生长状态,当细胞铺满瓶壁约85%-90%时,分别加入20μg/m L、40μg/m L、60μg/m L、80μg/m L、100μg/m L浓度的药物,培养箱内培养24h、48h,SRB染色法检测Surfactin对舌鳞癌生长的影响;克隆形成实验,通过计数分析Surfactin对舌鳞癌细胞克隆数目的影响;Hochest/PI双染法观察Surfactin作用于肿瘤细胞后细胞的形态的变化;流式细胞术检测早期凋亡;Wound healing和Transwell迁移实验分别观察Surfactin作用下对舌鳞癌细胞划伤伤口的愈合能力和对细胞迁移的影响;免疫印迹法检测与细胞迁移有关的蛋白MMPs表达的含量。结果:1.由SRB实验结果知,Surfactin能够有效抑制舌鳞癌细胞的生长,Surfactin对肿瘤细胞的抑制率随着药物剂量的加大也增大,24h、48h的IC50分别为74μg/m L和53μg/m L。2.克隆形成实验结果显示Surfactin能够抑制舌鳞癌细胞的克隆形成,Surfactin浓度分别为25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L时,克隆聚集率分别为28.3%±0.42%、26.5%±0.71%、20.7%±0.42%,Surfactin可以明显的减少细胞克隆的数目。3.Hochest/PI双染荧光显微镜下观察细胞呈高亮、核固缩等表现。流式细胞术检测当Surfactin浓度为25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L时,早期凋亡率分别为11.4%、43.45%、72.74%,与未加药物组比较,药物干预组细胞凋亡率显着升高,呈现一定的规律性;4.划痕愈合实验观察,Surfactin可明显阻碍细胞划伤后的伤口愈合能力;5.Transwell小室迁移实验结果得出,当药物浓度分别为0μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L,作用24h后,细胞迁移的数目分别为429.33±28.92、234.44±7.02、141.67±29.40、52.000±17.69,随着药物剂量的加大,Surfactin上室的细胞转移到下室的数目依次变少。6.Surfactin能够通过下调MMPs的含量阻碍舌鳞癌细胞的迁移。结论:Surfactin有可能作为一种潜在的治疗复发性和转移性舌癌病人的药物。
徐冰[4]2007年在《骨髓间质干细胞对1-甲基4-苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡的保护作用》文中研究说明骨髓间质干细胞对1-甲基4苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡的保护作用目的近来研究发现，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)或称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有干细胞特性，有多向分化的潜能，MSCs取材容易，在体外容易培养和增殖，自体MSCs移植又避免了免疫排斥反应。因而骨髓间质干细胞用于中枢神经系统疾病及其损伤修复的细胞学治疗基础，具有广阔的应用前景。帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种慢性进展性神经系统变性疾病，主要病理特征是黑质纹状体的多巴胺能(DA)神经元发生退行性变，形态学研究表明PD病人脑内DA能神经元呈凋亡样改变，提示细胞凋亡可能参与了PD的发病过程。1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl4-phenyl pyridium，MPP~+)能选择性地损害黑质DA能神经元。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，其所含的受体及递质与黑质DA能神经元相似，能与原代培养的神经细胞说明一致的问题，所以MPP~+制备的PC12细胞模型常作为研究PD的细胞模型。MSCs对DA能神经元的保护作用考虑与其能分泌的细胞因子有关。本实验采用体外培养、纯化MSCs并收集其条件培养液，检测其分泌的对DA能神经元有保护作用的细胞因子(GDNF、BDNF、IL-6)，通过评价MSCs分泌物对MPP~+制备的PC12细胞的c-Jun、bcl2和caspase3的影响，初步探讨MSCs分泌物对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。方法1、原代骨髓间质干细胞培养液的收集和浓缩2、MSCs细胞表面抗原测定(免疫荧光检测)一抗为CD44及CD45，二抗为CY3。3、MSCs分泌神经营养因子GDNF、BDNF、IL-6蛋白水平测定(ELISA法测定)4、PC12细胞培养和药物处理实验分组为：①空白对照组，在细胞培养体系中不加入任何药物；②MSCs上清液处理组，细胞接种后24h在细胞培养体系中加入MSCs上清液，MSCs上清液30μl、60μl、120μl，并用5％FBS／RPMI1640将终体积补足至300ul，使MSCs上清液体积分数分别为10％、20％、40％。③MPP~+处理组，细胞接种后24h在细胞培养体系中加入MPP~+，终浓度为100μmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1；④联合组，接种后24h在细胞培养体系中加入200μmol／L MPP~+，24h后再分别给予MSCs上清液30，60，120μL。各组细胞给药后24和48h进行下列指标的检测。5、细胞活力测定(MTT法)6、透射电镜观察PC12细胞凋亡7、PI染色流式细胞仪(FCM)检测PC12细胞凋亡8、bcl2、TH、c-Jun、caspase3蛋白的检测(免疫细胞化学法)9、bcl2、c-Jun、caspase3、THmRNA的检测(RT-PCR法)细胞给予MSCs上清液和MPP~+处理后不同时间点用Trizol提取细胞的总RNA，RT反应结束后以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增反应结束后每组目的基因各耳义5μL，NADPH取相同体积于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用凝胶图像分析仪分析，根据目的基因与内参照基因电泳条带密度的比值，进行bcl2、c-Jun、caspase3和THmRNA表达水平的半定量分析。结果1、MSCs可在体外分离扩增，其表面抗原CD44阳性而CD45阴性贴壁细胞呈长梭形，为单个或几个细胞的克隆，细胞形态均一。培养2～5d为生长潜伏期，细胞增殖较慢，细胞数变化不明显。6～12d为细胞快速增殖期，排列有一定方向性，呈旋涡样生长。培养15～18d，细胞出现80％～90％的融合，克隆间出现重迭，无接触抑制现象发生。胰酶消化传代的细胞于12h内完全贴壁、伸展并重新变为长梭形，保持原代细胞形态，生长迅速，7～10d达到完全融合。MSCs表面抗原的鉴定通过免疫荧光检测显示，CD45表达为阴性，证明其为非造血类细胞；CD44表达阳性，证明其为干细胞类细胞(图一A，B，C，D)。2、MSCs培养上清中能分泌神经营养因子GDNF、BDNF、IL-6(表1)3、MTT法MSCs上清液可以抵抗MPP~+对PC12细胞的细胞毒作用，提高细胞生存率MPP~+的终浓度为lOOμmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1孵育24h后，细胞活力与对照组相比(对照组设为1)分别降低至0.76±0.06、0.47±0.02、0.34±0.01；孵育48h后，细胞活力与对照组相比(对照组设为1)分别降低至0.61±0.01、0.30±0.04、0.20±0.04，随着MPP~+浓度的增加，PC12细胞活力逐渐下降，且相邻浓度间比较有显着性差异(P＜0.05)。在相同MPP~+浓度下随着时间的延长，PC12细胞活力逐渐下降，比较有显着性差异(P＜0.05)(图二A，B)。与MPP~+200μmol·L-1孵育24h组相比，联合组(MSCs上清液浓度分别为30μl、60μl、120μ1)，细胞活力由0.47±0.02上升至0.67±0.03、0.77±0.02、0.85±0.01；与48h组相比，联合组细胞活力由0.30±0.04上升至0.50±0.01、0.65±0.05、0.75±0.05(图二C)，比较有显着性差异(P＜0.05)，随着MSCs上清液剂量的增加，PC12细胞活力逐渐增加，且相邻剂量间比较有显着性差异(P＜0.05)(图二C)。4、透射电镜能观察到MPP~+所致PC12细胞凋亡观察到细胞体积缩小和染色质浓缩、边集，核周隙增大，核质比小，细胞膜不完整等细胞凋亡征象(图叁B)。5、流式细胞术检测显示MSCs上清液可以降低MPP~+诱导PC12细胞凋亡的凋亡率空白对照组PC12细胞的凋亡率为(1.51±0.11)％，在100μmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1 MPP~+作用PC12细胞24h后，细胞的凋亡率分别增加至(27.76±1.45)％、(42.04±3.21)％、(56.63±4.01)％(P＜0.05)(图四A)。作用48h后，空白对照组PC12细胞的凋亡率为(1.54±0.18)％，MPP~+暴露组细胞的凋亡率分别增加至(43.78±3.29)％、(55.36±3.98)％、(79.35±6.25)％(P＜0.05)(图四B)。200μmol·L-1MPP~+作用PC12细胞24h后，细胞的凋亡率为(42.34±3.21)％，加入30μ1、60μl、120μl MSCs上清液同时处理24h后，PC12细胞的凋亡率分别降为(31.96±2.89)％、(17.89±1.78)％、(10.08±0.91)％(P＜0.05)(图五A)；作用48h后，细胞的凋亡率为(55.36±3.98)％，加入30μl、60μl、120μl MSCs上清液同时处理48h后，PC12细胞的凋亡率分别降为(39.43±3.08)％、(23.13±2.18)％、(14.21±1.41)％(P＜0.05)(图五B)；随着MSCs上清液浓度的增加，PC12细胞的凋亡率依次降低，相邻浓度之间比较有显着差异(P＜0.05)。6、免疫细胞化学法显示MSCs上清液可以增加bcl-2和TH蛋白的表达，降低c-Jun和caspase3蛋白的表达bcl2和TH在200μmol·L-1MPP~+损害后48h，联合组bcl2和TH荧光染色阳性细胞数与MPP~+损害组相比，明显增加(图六和图七)。c-Jun和caspase3在200μmol·L-1MPP~+损害后48h，联合组c-Jun和caspase3荧光染色阳性细胞数与MPP~+组相比，明显减少(图八和图九)。7、RT-PCR法显示MSCs上清液可以增加bcl-2和TH mRNA的表达，减少c-Jun和caspase3mRNA的表达联合组(MSCs上清液浓度分别为30μ1、60μl和120μl)损害后24和48h，bcl-2和THmRNA表达量与GADPHmRNA比值分别升至0.63±0.02、0.71±0.02、0.85±0.01(24h)和0.49±0.01、0.57±0.01、0.67±0.01(48h)及0.55±0.02、0.62±0.01、0.69±0.01(24h)和0.43±0.02、0.52±0.01、0.60±0.01(48h)；联合组的bcl2和THmRNA含量均高于相应时间点的MPP~+组(P＜0.05)；随着MSCs上清液浓度的增加，bcl2和THmRNA表达量依次增加，相邻剂量之间bcl2和THmRNA表达量比较有显着差异(P＜0.01)(图十A，B和图十一A，B)。联合组(MSCs上清液浓度为30μl、60μl和120μl)损害后24和48h，c-Jun和caspase3mRNA表达量与GADPHmRNA比值分别降至0.59±0.01、0.52±0.02、0.43±0.01(24h)和0.68±0.02、0.60±0.01、0.52±0.01(48h)及0.59±0.01、0.53±0.01、0.44±0.03(24h)和0.63±0.01、0.56±0.01、0.50±0.01(48h)：联合组的c-Jun和caspase3mRNA含量与相应时间点的MPP~+组比较明显减低(P＜0.01)；随着MSCs上清液浓度的增加，c-Jun和caspase3mRNA表达量依次降低，相邻剂量之间c-Jun和caspase3mRNA表达量比较有显着差异(P＜0.01)(图十C，D和图十一C，D)。结论研究发现MSCs除了分化为间充质细胞谱系外，还具有向非间充质细胞谱系如神经细胞分化的多向分化潜能。MSCs在体外容易分离培养，并且具有很高扩增能力，使其成为最吸引人、最理想的治疗工具。对MSCs研究中的一项难题是迄今还未发现特异性的MSCs细胞标记物。目前比较公认的相对特异性的MSCs细胞标记物是表达CD90，CD71及CD44抗原，而无CD34，CD45和CD11b等造血干细胞的抗原标志。本实验通过免疫荧光检测细胞表面抗原CD44和CD45，标记为CD44阳性和CD45阴性的细胞即为实验所需的MSCs。MSCs对DA能神经元的保护作用考虑与其能分泌的细胞因子有关，可能是MSCs减少神经元凋亡的机制之一。在生理状态下，MSCs可以分泌NGF、VEGF、GDNF、BDNF、bFGF、HGF、CSF 1等多种生长因子；分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11等细胞因子；这些神经营养因子可能通过不同的机制，起着神经保护作用，减少神经元凋亡。MSCs治疗PD的一个机制是MSCs可以刺激产生多种神经营养因子。本实验用ELISA法检测到MSCs培养上清中能分泌神经营养因子GDNF、BDNF及IL-6。MSCs分泌神经营养因子GDNF、BDNF及IL-6对MPP~+损坏的DA能神经元发挥神经保护作用。尤其GDNF是公认的能促进中脑DA细胞存活的神经营养因子。GDNF对发育及成熟的DA能神经元有保护、修复作用，可增强体外培养的DA能神经元对DA的摄取，促进DA能神经元的分化。BDNF对培养的胚胎基底前脑胆碱能神经元、黑质DA能神经元和氨基丁酸能神经元均有营养作用。IL-6作用于DA(儿茶酚胺)能神经元，酪氨酸羟化酶活性增强，神经元生存期延长，细胞内DA增多。本研究MTT法揭示了与MPP~+暴露组相比，联合组细胞活力明显提高。表明MSCs上清液可以有效保护MPP~+对PC12细胞的毒性损伤，并且浓度越高MSCs上清液的保护作用越好。PI染色FCM检测发现与MPP~+暴露组相比，联合组细胞的凋亡率明显降低，提示MSCs上清液可明显减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；随着MSCs上清液浓度的增加，其减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡作用在增加。帕金森病是一种慢性进展性神经系统疾病，帕金森病的发病机制一直是人们研究和关注的热点，近年来随着神经生物化学和组织化学研究技术的进步，发现细胞凋亡与帕金森病发生存在重要联系。黑质DA能神经元凋亡的细胞内部调控是一个极其复杂的过程，ROS、bcl2、bax、caspases3均充当了重要的角色，其核心环节可能是内外环境的毒素破坏了钙离子平衡，造成钙超载，导致呼吸链产生自由基增多，降低bcl2，并激活caspases3来共同参与细胞凋亡的调控，最终引起DA能神经元的凋亡。本研究免疫细胞化学法bcl2蛋白检测结果提示联合组bcl2荧光染色阳性细胞数与相应时点MPP~+损害组相比，明显增加，提示MSCs上清液可通过增加抗凋亡因子bcl2蛋白含量，减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；RT-PCR法bcl2mRNA的检测结果提示联合组的bcl2mRNA含量均高于相应时间点的MPP~+组，提示MSCs上清液可明显增加抗凋亡因子bcl2mRNA含量，从而减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；随着MSCs上清液浓度的增加，bcl2mRNA表达量依次增加。以上结果从mRNA水平提示，随着MSCs上清液浓度的增加，其减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡作用在增加。bcl2蛋白是一种膜整合蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜上。研究表明，bcl2蛋白对黑质DA能神经元的保护作用可以通过抗氧化作用来实现。我们的研究显示，MSCs可以改善MPP~+损害所致的bcl2mRNA和蛋白水平的下调，从而发挥神经保护作用。本研究免疫细胞化学法c-Jun和caspase3蛋白检测结果提示相对于MPP~+组，联合组的荧光染色阳性细胞数明显减少。提示MSCs上清液可通过降低促凋亡因子c-Jun和caspase3蛋白含量，减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；RT-PCR法c-Jun和caspase3mRNA的检测结果提示联合组的c-Jun和caspase3mRNA含量均低于相应时间点的MPP~+组，提示MSCs上清液可明显降低促凋亡因子c-Jun和caspase3mRNA含量，从而减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；随着MSCs上清液浓度的增加，C-Jun和caspase3mRNA表达量依次降低。以上结果从mRNA水平提示，随着MSCs上清液浓度的增加，其减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡作用在增加。caspase是细胞凋亡的效应器，特别是caspase3被认为是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路。中脑黑质DA能神经元的丢失是PD的主要病理特点。用免疫组化方法测定PD患者死亡后脑组织时发现，中脑DA能神经元的丢失与caspase3阳性神经元呈正相关。我们的研究显示MSCs通过阻断caspases3的活化来抑制细胞凋亡的进程。已确定的凋亡前信号分子JNK(c-JunN末端激酶)与神经退变性疾病相关。JNK信号级联可能是MPTP诱导神经元死亡的机制之一。JNK可使与谷胱甘肽转移酶结合的谷胱甘肽-c-Jun聚合蛋白氨基末端磷酸化，从而启动c-Jun介导的细胞凋亡信号转导系统。MSCs对DA神经元的这种保护作用可能与其抑制JNK活性，减少c-Jun磷酸化作用有关。MSCs可在体外迅速扩增；其表面抗原CD44阳性而CD45阴性；MPP~+能诱导PC12细胞凋亡；MSCs能分泌GDNF、BDNF、IL6等多种对退变DA能神经元有保护作用的神经营养因子，因此MSCs对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡有保护作用，这种保护作用的强弱与其上清液浓度有关，其作用机制是通过增加抗凋亡因子bcl2和抑制促凋亡因子c-Jun和caspase3等多种渠道来实现的。本研究为MSCs治疗帕金森病提供了一定的实验基础。
李凌[5]2008年在《Honokiol作为一种具有新的抗肿瘤机制的小分子药物的研究》文中研究指明研究背景和厚朴酚(Honokiol)是联苯类木脂素的代表,主要来源于传统中药厚朴。它具有多重药理作用,包括抗感染、抗焦虑、抗氧化等。近年来,其抗肿瘤作用受到重视,已有一些文献报道和厚朴酚可诱导一些肿瘤细胞株的凋亡。最近,两篇来自美国哈佛大学Dana-Farber肿瘤研究所的报道指出其可诱导原代B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia)和多发性骨髓瘤细胞(multiple myeloma)凋亡。但是,由于其多重药理功能,和厚朴酚被认为是一种功能众多,靶点“模糊”的活性小分子。“模糊”的小分子例如反应停,阿司匹林等都是到目前为止适应面极广的抗肿瘤明星药物。例如,阿斯匹林除了镇痛、抗关节炎,还有很多其他功能如降低血液粘稠度、抗血小板凝集、抗孕前惊厥、抗肿瘤作用等。同理,本课题组研究的其他具有体内外广谱抗肿瘤作用的小分子药物,例如五味子乙素,左旋紫草素无不是作用多个靶点,干预多条信号通路。而且,从病因学以及病理学上来说,恶性肿瘤是一个高度复杂的整体,它包含了多条信号通路以及很多关节点。可以说,恶性肿瘤是一个多因素的问题,只有采用针对多因素的办法来解决。因此,我们认为:凡是具有开发潜力的抗肿瘤药物,其优势应该是“模糊的”即一药“多功能”——从多个环节打击肿瘤。这也能解释许多单一靶点药(如伊瑞莎)失败的原因:其高度的专一性,太容易因为多机制的耐药性而失效。肿瘤耐药性是化疗的主要障碍,与90%肿瘤相关的死亡直接的或间接的与肿瘤耐药有关。从当前研究成果看,肿瘤耐药可能机制具体主要包括(1)药物转运泵的表达增高或活性增强,例如P-gp、MRP-1、BCRP的过量表达;(2)凋亡相关通路的改变:尽管临床使用的化疗药有不同的靶位和机理,但一般均引起肿瘤细胞的凋亡,由于肿瘤组成的异质性以及其基因组的高度不稳定性,肿瘤细胞即使开始对凋亡诱导较敏感,但最终会产生凋亡耐受。因此,抗癌的小分子药物的药效好坏与否,与肿瘤细胞对这些小分子的耐药机制有关。而且,越来越多的证据表明(比如MDR逆转剂研制,伊瑞莎、格列卫的使用),最佳解决肿瘤耐药的方法还是在治疗过程中避免耐药的产生,而不是等到有了不良结果后才去弥补,这也是更新一代抗癌药物的开发原则。本课题组一直从事有关抗肿瘤耐药性的研究工作。本文以报道和厚朴酚能够绕开传统的耐药机制,以一种非凋亡的线粒体通透性转换孔依赖的死亡方式攻击肿瘤细胞的基础研究为主干,兼顾和厚朴酚在临床原代样本以及体内模型的应用性研究。目前,尚无他人报道本研究成果。研究目的明确和厚朴酚对于多药耐药的肿瘤细胞的药效;研究和厚朴酚是否可以通过非凋亡的其他程序性死亡机制诱导肿瘤细胞死亡;探索和厚朴酚是通过何种机制引起非凋亡的细胞死亡;评估和厚朴酚对原代细胞的药效及探索其可能机制;要将一个有潜力的抗肿瘤小分子推向临床,那么临床前体内实验必不可少,通过建立荷HL60的NOD/SCID小鼠模型来明确和厚朴酚对白血病细胞移植瘤的体内药效。研究内容第一部分Honokiol对MDR细胞与亲本细胞的抗肿瘤作用的探讨(1)以K562/ADR与K562,HL60/ADR与HL60,MCF-7/ADR与MCF-7,Bcap37/MDR与Bcap37为研究模型。四对细胞株经Honokiol诱导后,用MTT法检测Honokiol对所有MDR细胞株与亲本细胞株的IC_(50)。通过与叁种常规化疗药物比较,发现Honokiol具有对亲本细胞和MDR细胞效应相当的特点。结合本课题组过去的研究报告,我们认为Honokiol非药泵的底物;(2)为了进一步研究Honokiol的抗肿瘤机制,我们检测经药物诱导后细胞的Caspase-3的活性,发现至少在HL60/ADR与HL60,MCF-7/ADR与MCF-7细胞中Caspase凋亡通路没有被激活。通过电镜观察,发现HL60/ADR与HL60,MCF-7/ADR与MCF-7细胞死亡过程中检测不到凋亡细胞;(3)因为Honokiol具有对亲本细胞和MDR细胞效应相当的特点,所以研究Honokiol对亲本细胞的作用机制便具有代表性。在K562、HL60、MCF-7、Bcap37细胞上,通过Hoechst染色、台盼蓝染色确证,Honokiol的抗肿瘤作用除了诱导细胞发生凋亡,也可以诱导细胞发生非凋亡的死亡。第二部分Honokiol能够以一种可调控的非凋亡的方式诱导肿瘤细胞死亡以HL60细胞株为研究非凋亡死亡方式的模型,发现该死亡方式有以下特点:(1)流式细胞仪AV/PI双染、PI拒染法发现HNK主要引起时间依赖性且浓度依赖性的细胞膜完整性受损;(2)HNK对HL60细胞周期无明显影响,DNA电泳也不出现梯带化,Caspase总抑制剂z-VAD-FMK不能抑制细胞死亡;(3)免疫荧光检测AIF转位实验,证实AIF介导的凋亡也未参与过程;(4)而且这种死亡不受凋亡耐受影响,因为过表达Bcl-2或者Bcl-xL无法抑制该药物的诱导死亡作用;(5)用15μg/ml的和厚朴酚处理HL60细胞不同时间长度后,将药物洗净,换上新鲜的培养液,测定细胞死亡率。继续培养24小时后,再次测定细胞死亡率。结果可见,药物处理1或2小时后撤药,细胞死亡比例增加很少,死亡基本可逆。而随着药物处理时间增长,死亡增加比例也随之增高,但仍然低于15μg/ml的和厚朴酚连续处理24小时的死亡率。Wash out实验证实该死亡作用是可逆的;(6)线粒体PT孔抑制剂Cyclosporin A(CsA)可以抑制细胞死亡;(7)在MCF-7细胞上也发现和厚朴酚能引起类似HL60的死亡作用。第叁部分线粒体通透性转换孔(PT pore)是Honokiol新的抗肿瘤机制的关键通过第一部分电镜的观察,我们发现药物诱导的早期,细胞的线粒体便发生了形态学的改变,说明线粒体在细胞死亡中起着关键的作用。它在细胞死亡信号传递中起着承上启下的整合作用。(1)15μg/ml的和厚朴酚处理HL60细胞0、6、12、18小时后,线粒体染料JC-1染色,流式细胞仪检测到JC-1~(LOW)细胞(即低线粒体膜电位细胞)比例增多,3.1%±1.2%,15.2%±3.4%,35.0%±3.5%,55.1%±6.2%。而加入5μM的CsA后,以12小时为例,JC-1~(LOW)细胞比例有所下降,24.1%±2.4%。用15μg/ml的和厚朴酚处理HL60细胞0、1、3、6、12小时后,ROS特异性荧光染料H_2DCFDA孵育半小时,流式细胞仪检测荧光水平,各样本均与正常细胞对照组相比,取其荧光强度比值进行分析。ROS的水平在和厚朴酚作用后,呈时间依赖性上升,加入5μM的CsA后ROS升高可被部分抑制;(2)15μg/ml的和厚朴酚处理6小时后,加入1mM的calcein-AM荧光染料及5mM的CoCl室温避光反应15分钟。加入CoCl是为了淬灭胞浆中的染料,只留下线粒体部分的荧光。当PT孔开放时,calcein-AM从线粒体溢出,线粒体荧光强度降低,由此检测PT孔开放情况。激光共聚焦显微镜观察结果显示,和厚朴酚处理组PT孔开放,绿色荧光明显较对照组减弱。加入5μM的CsA后,可抑制这一现象。我们推测,CsA的PT孔抑制作用是通过结合其靶蛋白亲环蛋白D(Cyclophilin D)来抑制孔道开放,继而影响细胞死亡的;(3)用SiRNA的办法Knock down肿瘤细胞内的亲环蛋白D表达水平,可影响Honokiol对肿瘤细胞的药敏。这就说明Honokiol抗肿瘤作用是线粒体PT孔道依赖性的;(4)有趣的是,我们还发现在药物诱导肿瘤细胞死亡的早期阶段,亲环蛋白D无论从mRNA水平还是蛋白水平都会升高;但是,在HNK诱导肿瘤细胞如K562凋亡的情况下(CsA不能抑制凋亡),亲环蛋白D的表达水平不发生变化。第四部分Honokiol对原代白血病细胞的抗肿瘤作用的研究为了进一步阐明和厚朴酚的抗肿瘤作用在临床上的应用前景。我们收集了15例急性白血病病人的血样。(1)测定对原代白血病细胞的LC_(50),发现Honokiol对于大多数原代白血病细胞有一定效果,24小时的LC_(50)在30μg/ml左右,且该效应浓度对正常人外周血单个核细胞无毒;(2)在其中10个病例中,与HL60类似,发现Honokiol在原代样本中还是具有新的抗肿瘤机制,表现为:PS不外翻,细胞膜完整性早期受损;z-VAD-FMK不能抑制细胞死亡,CsA可以抑制细胞死亡;Cyclophilin D表达升高;(3)我们还做了集落形成实验,将Honokiol或者AraC预处理过的白血病细胞在甲基纤维素基质上培养14天,发现Honokiol抑制集落形成的能力与化疗药物阿糖胞苷相当。以上的结果证实和厚朴酚的抗肿瘤作用是具有一定的临床应用价值。第五部分Honokiol对荷HL60小鼠的体内抗肿瘤作用的前瞻性研究(1)和厚朴酚可以有效延长荷HL60小鼠的生存时间。在尾静脉接种HL60组,对照和加药组的小鼠生存中值天数分别是17天,以及29天。在腹腔接种HL60组中,对照和加药组的小鼠生存中值天数分别是24.5天,以及37.5天;(2)Honokiol对腹腔接种产生的HL60移植瘤的抑制作用不理想(P＞0.05);(3)但是,通过免疫组化检测小鼠各重要组织中人源CD45细胞的阳性比例来确定HL60的浸润情况,发现Honokiol能减轻肿瘤细胞对脏器的浸润。研究结论1.Honokiol对MDR肿瘤细胞株和亲本肿瘤细胞株药效相近。2.Honokiol能够诱导以HL60为代表的肿瘤细胞株发生非凋亡的可调控的死亡,该死亡不受凋亡耐受影响。3.Honokiol所诱导的非凋亡的可调控的死亡是线粒体通透性转换孔依赖性的。4.Honokiol对原代急性髓系白血病细胞的作用机制包含了类似于其对HL60作用的抗肿瘤新机制。5.Honokiol能够延长荷HL60小鼠的生存时间,并且可以减轻HL60细胞的浸润。
邸彦橙[6]2012年在《维生素K3协同叁氧化二砷（As203）诱导雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3凋亡的研究》文中研究表明目的：叁氧化二砷(As_2O_3)可以诱导雄激素非依赖性前列腺癌（HRPCa）细胞株PC-3细胞凋亡，但是高剂量As_2O_3的毒副作用制约了其临床使用剂量，这严重影响了叁氧化二砷的临床疗效，而寻找一种可以增加As_2O_3诱导凋亡效应的辅助药物来打破As_2O_3临床应用剂量的瓶颈是一种新的思路。本课题通过研究维生素K3联合As_2O_3作用于PC-3细胞株生物学效应，探索维生素K3是否与As_2O_3有协同作用，为As_2O_3治疗HRPCa及众多实体瘤的临床应用奠定理论基础。方法：相差显微镜观察不同浓度的维生素K3和As_2O_3，单独或联合作用于体外培养的雄激素非依赖前列腺癌细胞PC-3细胞株，MTT法检测细胞的存活率，流式细胞仪（FCM）检测细胞的凋亡率，Annexin V、PI双染色法，荧光显微镜观察细胞凋亡，RT—PCR检测两种药物单独及联合作用后，HRPCa细胞株PC-3细胞中Survivin基因的表达情况。结果：MTT法检测结果显示：两种药物单用时，对细胞生长具有抑制作用，各组间具有统计学差异（P＜0.05）；两种药物联合使用时，与单独用药组相比，能明显增加HRPCa细胞株PC-3的生长抑制率，组间具有统计学差异（P＜0.01）；药物相互作用指数（CDI）均＜1，说明两药具有协同作用。FCM检测结果显示：两种药物单用时，均可见细胞死亡，以凋亡为主；二者联合应用时，细胞的死亡率明显高于二者单独作用细胞组，并且其死亡率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而提高，死亡细胞以凋亡为主。免疫荧光显微镜分析细胞死亡形态，正常细胞组基本未见荧光，用药组可见荧光，低浓度以绿色荧光为主，高浓度以红色荧光为主。RT—PCR检测结果显示Survivin基因的表达强度随着药物浓度的增加逐渐变弱。结论：维生素K3可协同As_2O_3诱导前列腺癌细胞株PC-3凋亡，故可降低As_2O_3了的使用剂量，从而减少其副作用，为As_2O_3治疗前列腺癌临床广泛应用奠定了基础。
彭光华[7]2002年在《类胡萝卜素及其抗乳腺癌机理研究》文中认为本研究以人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S(ER-)、MCF-7(ER+)作为离体试验模型，应用吖啶橙／溴乙锭双染法、MTT、法、原位末端标记法(TUNEL法)、单细胞电泳技术、流式细胞仪检测、划痕标记荧光染料传输法、RT-PCR技术以及基因芯片等现代分子生物学技术研究了类胡萝卜素对乳腺癌细胞的生长抑制、细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤、细胞间隙连接通讯功能以及基因表达的影响，旨在探讨类胡萝卜素抗乳腺癌的作用机理，为临床和流行病学大规模应用类胡萝卜素作为乳腺癌预防和辅助治疗剂及保健食品的开发提供理论基础，其主要研究结果如下： 1、类胡萝卜素对乳腺癌细胞的生长抑制影响 本文采用MTT方法检测了类胡萝卜素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S、MCF-7的生长抑制作用。β-胡萝卜素和虾青素对MCF-7和MDA-MB-435S细胞增殖有较强的抑制作用，随着作用的浓度增加和作用时间的延长，乳腺癌细胞的生长抑制率也随着增加，有明显的剂量和时间效应关系；玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S的生长有促进作用，对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长影响不十分明显；角黄素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S的生长有一定的促进作用，但对MCF-7的生长有明显的抑制作用；番茄红素对人腺癌细胞株MDA-MB一435S的生长有抑制作用，对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长影响不明显。 2、类胡萝卜素对乳腺癌细胞发生凋亡的影响 采用吖啶橙／溴乙锭双染法和TUNEL方法检测了类胡萝卜素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S、MCF-7细胞凋亡的影响。β-胡萝卜素、虾青素和番茄红素作用MDA-MB-435S细胞株后，均出现较多的凋亡阳性细胞，角黄素、玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯作用MDA-MB-435S细胞株后，均未出现凋亡阳性细胞。β-胡萝卜素、虾青素和角黄素作用MCF-7细胞株后，均出现了凋亡阳性细胞，番茄红素、玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯作用MCF-7细胞株后，均末出现凋亡阳性细胞。提示：β-胡萝卜素、虾青素和番茄红素对MDA-MB-435S细胞的凋亡发生有诱导作用；角黄素、玉米黄索和玉米黄素双棕榈酸酯对MDA-MB-435S细胞的凋亡发生无诱导作用；β-胡萝卜素、虾青素和番茄红素对MCF-7细胞的凋亡发生有诱导作用；番茄红素、玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯对MCF-7细胞的凋亡无诱导作用。 3、类胡萝卜素对乳腺癌细胞中DNA损伤的影响 采用单细胞电泳技术检测了类胡萝卜素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S、MCF-7细胞的DNA损伤影响。β-胡萝卜素和虾青素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S和华中农业大学2002届博士学位论文MCF一7细胞中DNA分子均有较大程度的损伤，且与处理的浓度和时间存在一定的相关性;玉米黄素和玉米黄素双棕搁酸酷对人乳腺癌细胞株MDA-卜侣一4355和MCF一7细胞中DNA分子均无损伤作用;角黄素对MCF一7细胞中DNA分子有一定的损伤作用，对入旧OA.MB一4355细胞中DNA分子无损伤作用;番茄红素对MDA一MB一4355细胞中DNA分子有一定的损伤作用，对MCF一7细胞中DNA分子无损伤作用。 4、类胡萝卜素对乳腺细胞增殖周期的影响 .采用流式细胞仪检测类胡萝卜素对人乳腺癌细胞增殖周期的影响。结果表明类胡萝 卜素对人乳腺癌细胞株MDA~MB一4355和MCF一7细胞的增殖周期无影响。 5、类胡萝卜素对乳腺癌细胞间隙连接通讯功能的影响 采用划痕标记染料示踪技术，检测类胡萝卜素对乳腺癌细胞间隙连接通讯功能的影响。p一胡萝卜素、虾青素和番茄红素对MDAeeMB一4355细胞细胞间隙连接通讯功能具有较强的促进作用;角黄素、玉米黄素和玉米黄素双棕搁酸酷对MDAeeMB一4355细胞细胞间隙连接通讯功能的影响不明显;p一胡萝卜素、虾青素和角黄素对MCF一7细胞的细胞间隙连接通讯功能具有较强的促进作用;番茄红素、玉米黄素和玉米黄素双棕搁酸酷对MCF一7细胞间隙连接通讯功能的影响不明显; 6、类胡萝卜素对人乳腺癌细胞株MCF-7 bd一2基因表达的影响 采用RT一PCR方法检测类胡萝卜素对MCF-7细胞株的Bd一2基因表达的影响，均呈不同程度的下调。p一胡萝卜素、虾青素、玉米黄素、番茄红素处理后，bcl一2基因的表达下调程度都较大，其次是角黄素，下调程度最小的是玉米黄素双棕搁酸酷。 7、p一胡萝卜素对人乳腺癌细胞株MCF-7的基因表达的影响 采用基因芯片检测p一胡萝卜素对人乳腺癌细胞株MCF一7的基因表达的影响。筛迭出18条下调基因和3条上调基因。其中下调基因是外压反应蛋白基因AFI 26028、NMee012177、AJ250915，细胞凋亡相关的蛋白基因U83857、AB014509、AF05364、U37547、U78798、NM_004849、NM_006595、hshsP90r、humtoPi、AFll7386、a印04711、AB01 505，，蛋白翻译合成基因NM一001 418，细胞信号和传递蛋白基因AFOSO，27免疫相关基因NM_005346。上调基因为与细胞凋亡相关的蛋白基因AF040958、AK001 555、941894。
赵柬云[8]2018年在《靶向CHK1治疗急性髓系白血病的研究》文中认为急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种难治性恶性血液肿瘤。近四十年来,治疗AML的首选标准疗法一直为“7+3”疗法(7天阿糖胞苷+3天柔红霉素),然而绝大多数的患者在治疗后会复发,而且复发后会对化疗药物产生耐药性,这极大地限制了治疗效果。因此,现在迫切需要寻找新药或新疗法来克服化疗耐药并提高AML病人的存活率,这具有重要的理论意义和临床应用价值。目前研究认为,通过靶向DNA损伤应答(the DNA damage response,DDR)是非常有前景的克服化疗耐药的途径之一。其中,细胞周期检验点激酶1(Checkpoint Kinase 1,CHK1)在DDR网络中扮演重要角色。抑制CHK1不仅可以影响DNA复制起始和复制叉稳定性,还可以去磷酸化CDC25而避免其降解或从细胞核中游离出去,这将导致CDC25对CDK1和CDK2的第15位酪氨酸去磷酸化,从而使CDK1和CDK2活化而消除G2/M和S细胞周期检验点,使细胞无法进行DNA修复,导致DNA损伤累积,最终导致细胞死亡。因此,通过靶向CHK1可以有效地克服化疗耐药,从而增强对白血病细胞的杀伤作用。LY2603618是新型的CHK1抑制剂,相比于第一代CHK1抑制剂,LY2603618具有卓越的CHK1选择性,但其在AML中的作用机制还不完全清楚,这是本论文所研究的第一个关键科学问题。首先,我们通过MTT实验检测了LY2603618在AML细胞株及AML患者临床样本中的抗AML活性。结果显示,LY2603618对AML细胞株具有良好的抗AML活性,而且其对初诊或复发的AML患者临床样本细胞具有相似的抗肿瘤活性。但是,实时定量RT-PCR实验结果显示,AML患者临床样本细胞对LY2603618的敏感性与CHK1的转录水平没有相关性。然后,我们证明LY2603618可以通过抑制CHK1使DNA损伤累积,从而导致Mcl-1的蛋白表达水平下降,降低其对促凋亡蛋白的抑制作用,从而诱导AML细胞凋亡。而这些过程都部分依赖CDK活性,因为CDK抑制剂Roscovitine能部分逆转以上现象。ABT-199是Bcl-2选择性小分子抑制剂,具有良好的抗AML活性。但是,在之前的研究中我们发现,Mcl-1的上调是部分AML细胞对ABT-199耐药的关键原因。因此,我们推测将LY2603618与ABT-199联合应用将能有效消除AML细胞对ABT-199的耐药性,从而显着增强其抗AML活性。我们通过将LY2603618与ABT-199联合处理AML细胞和AML患者临床样本细胞发现,LY2603618可以通过消除Mcl-1的上调来增强ABT-199的抗AML活性,有意思的是我们还发现ABT-199也同时可以增强LY2603618诱导的DNA损伤,这将进一步促进AML细胞死亡。这些结果表明,将LY2603618与ABT-199联合治疗AML初诊患者具有很好的前景,因此我们强烈推荐将LY2603618与ABT-199联合进行临床实验来验证该联合疗法对初诊AML患者的疗效。复发是临床医生治疗AML要面对的一个非常棘手的问题,而且绝大多数AML患者在化疗后会复发,并对化疗产生耐药性。到目前为止,对复发AML患者尚没有有效的治疗手段。我们推测,AML细胞在对化疗药物产生耐药性的过程中,可能会变得对S和G2/M细胞周期检验点更加依赖,因此对化疗耐药的AML细胞可能对细胞周期检验点抑制剂更敏感。这是本论文要研究的第二个关键科学问题。为检测上述可能性,我们在体外建立了两株对Ara-C耐药的AML细胞株,HL-60/Ara-C和CMK/Ara-C,并检测了其对CHK1抑制剂LY2603618和MK8776、ATR抑制剂AZ20和AZD6738以及Wee1抑制剂MK-1775的敏感性。有意思的是,HL-60/Ara-C细胞与其母本HL-60细胞相比,对上述细胞周期检验点抑制剂均显着更敏感;而CMK/Ara-C细胞与其母本CMK细胞相比,对ATR抑制剂AZD6738显着敏感,而对其它细胞周期检验点抑制剂趋于更敏感。而且,抑制CHK1可以有效杀伤Ara-C耐药的AML细胞,并引起γH2AX的表达水平增加,使G2/M期细胞减少。LY2603618与AZD6738(ATR抑制剂),LY2603618与MK1775(WEE1抑制剂)这两组药物组合可以协同杀伤Ara-C耐药的AML细胞,并且对正常细胞无毒性作用。综上所述,我们的研究结果证明CHK1在治疗AML过程中起关键作用,通过抑制CHK1可以有效杀伤AML细胞或Ara-C耐药的AML细胞。我们阐明了LY2603618抗AML的作用机制,并证明了LY2603618可以通过抑制Mcl-1的表达增强ABT-199的抗AML活性。最后,我们还证明了在Ara-C耐药的AML细胞中,LY2603618和AZD6738以及LY2603618和MK1775两组药物组合具有协同抗AML的作用。以上结果为临床开发CHK1抑制剂或应用CHK1抑制剂与其它药物联合治疗初诊或复发AML提供了理论和实验依据。
徐韧[9]2017年在《姜黄素对卵巢癌SKOV3/CDDP细胞化疗增敏作用及其机制的研究》文中认为目的:通过研究探讨姜黄素(Curcumin,Cur)对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CDDP体外增殖及其凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达影响,分析姜黄素对卵巢癌SKOV3/CDDP耐药逆转的可能机制,为中药辅助化疗剂的临床应用提供理论依据。方法:1体外培养亲本细胞SKOV3(人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞)及其顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP并连续传代,用不同浓度的顺铂(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml)分别作用于SKOV3及SKOV3/CDDP 24h,用MTS法测得SKOV3/CDDP的耐药指数。2以不同浓度的Cur(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L)分别作用于SKOV3/CDDP细胞24h、48h、72h后,以MTS法检测其对SKOV3/CDDP细胞生长的影响。检测低浓度的Cur(10μmol/L)联合顺铂较单用顺铂对细胞耐药指数的影响,观察Cur是否对SKOV3/CDDP有化疗增敏作用。3采用流式细胞术检测Cur对细胞凋亡的影响,实验分为以下四组:(1)对照组:仅含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液培养的SKOV3/CDDP细胞。(2)Cur组:10μmol/LCur作用的SKOV3/CDDP细胞。(3)CDDP组:3.8μg/ml顺铂作用的SKOV3/CDDP。(4)Cur+CDDP组:10μmol/L Cur和3.8μg/ml顺铂同时作用的SKOV3/CDDP细胞。4 Western-Blotting检测以上四种分组处理后细胞的凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、BAX的表达情况。5 RT-qPCR检测检测以上四种分组处理后细胞的凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、BAX的mRNA表达。结果:1不同浓度的顺铂分别作用SKOV3及SKOV3/CDDP 24h后,skov3/cddp的细胞生存率明显高于其亲本细胞skov3(p<0.001),skov3/cddp和skov3的ic50分别为31.79和3.72。耐药指数(ri)=ic50(skov3/cddp)/ic50(skov3)=8.54。2mts显示,0μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l、80μmo/lcur作用24h后skov3/cddp抑制率分别为(0.00±6.17)%、(4.82±5.06)%、(23.15±2.56)%、(40.38±3.49)%、(57.88±1.27)%、(59.72±2.11)%(f=242.67,p<0.001)。10μmol/l与空白对照组、60μmol/l与80μmol/l组相比无统计学意义,其他任意两两比较均有统计学意义。作用48h后抑制率分别为(0.00±6.48)%、(8.56±3.48)%、(35.05±4.09)%、(55.27±4.00)%、(69.42±2.05)%、(80.33±0.95)%(f=347.66,p<0.001)任意两两比较均有统计学意义。作用72h抑制率分别为(0.00±6.19)%、(23.18±6.49)%、(45.20±3.62)%、(77.07±1.49)%、(79.79±1.52)%、(80.35±1.01)%(f=349.96,p<0.001),40μmol/l、60μmol/l、80μmol/l叁组间无差异,其余任意两两比较均有统计学差异。生长抑制作用随药物浓度的增高和作用时间的延长而增加。当cur≤10μmol/l时无论作用24h、48h细胞生存率均≥90%,因此可以认为,姜黄素在此浓度对skov3/cddp细胞无细胞毒性作用,并将该剂量作为逆转剂量。经10μmol/lcur和顺铂联合作用于skov3/cddp细胞48h,较单用顺铂相比,细胞生存率明显降低,顺铂的细胞毒性作用明显增强,skov3/cddp细胞的ic50由(11.77±0.03)μg/ml下降至(3.47±0.54)μg/ml(p<0.001)。3fcm显示,空白对照组、10μmol/lcur组、3.8μg/ml顺铂组、联合用药组分别作用skov3/cddp细胞48h后细胞凋亡率分别为(0.02±0.02)%、(4.45±0.83)%、(6.49±2.11)%、(21.31±3.60)%(与对照组相比p=0.01<0.05、p=0.03<0.05、p=0.009<0.01),与对照组相比,10μmol/lcur单药组或与3.8μg/ml顺铂联合用药组均能诱导增加skov3/cddp细胞凋亡。且10μmol/lcur单药组与联合用药组相比差异有统计学意义,两者联合使用时诱导效果更加显着(p=0.004<0.01)。4western-blotting检测:空白对照组、10μmol/lcur、3.8μg/ml顺铂单独及联合用药作用于skov3/cddp细胞48h后,凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2的相对表达量。结果显示,联合用药组较空白对照组可显着增加凋亡蛋白caspase-3、bax的表达(p<0.001、p<0.001),降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.001)。且联合用药组与3.8μg/ml顺铂组相比,同样增加了凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达(P<0.01、P<0.001),降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.01)。5 RT-qPCR结果显示,空白对照组、10μmol/LCur、3.8μg/ml顺铂单独及联合用药作用于SKOV3/CDDP细胞48h后,联合用药组作用较空白对照组可增加SKOV3/CDDP细胞Caspase-3、Bax mRNA的相对表达量(P<0.001,P<0.01),降低Bcl-2 mRNA的相对表达量(P<0.001)。且联合用药组与3.8μg/ml顺铂组相比,也同样增加了SKOV3/CDDP细胞Caspase-3、Bax mRNA的相对表达量(P<0.001,P<0.01),降低Bcl-2mRNA的相对表达量(P<0.01)。结论:1 Cur明显抑制卵巢癌SKOV3/CDDP细胞体外增殖,其抑制作用具有剂量和时间依赖性。2低剂量的Cur对卵巢癌SKOV3/CDDP细胞具有化疗增敏作用,可以增强顺铂的细胞毒作用。3 Cur具有诱导卵巢癌SKOV3/CDDP细胞凋亡的作用,且这种作用在与顺铂联合使用时效果更好。4 Cur联合顺铂应用于SKOV3/CDDP细胞时,可以在基因转录水平及蛋白表达水平上调促凋亡蛋白Caspase-3、Bax,下调抗凋亡蛋白Bcl-2,可见Cur逆转耐药的机制可能是增强肿瘤细胞的凋亡作用实现的。
谢飞[10]2015年在《高糖诱发氧化应激反应激活TNFR1受体促内皮祖细胞凋亡的实验研究》文中研究指明目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是因遗传和坏境因素共同作用而引起的高血糖以及碳水化合物、脂肪和蛋白质等代谢失衡的慢性疾病。它不仅引起糖代谢紊乱,而且引起血管病变。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在维持血管健康和促进受损血管的重建过程中起着重要作用。当前,在糖尿病血管新生受损的机制研究中,EPCs功能失调相关因素已经受到广泛重视,其中,氧化应激与EPCs功能失调关系密切。已有研究表明:糖尿病患者的高血糖环境可以使EPCs凋亡增多,数量减少,而且凋亡增加可能是糖尿病血管病变中EPCs减少的主要机制。细胞凋亡是由基因控制的一种自主性、程序性的死亡过程,它可以由多种刺激因素引起并且主要通过死亡受体介导的途径介导凋亡,在死亡受体介导的凋亡途径中,肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)是当前研究发现的最大的死亡受体家族,其凋亡信号传递过程中,主要是由TNFR1介导的。有研究报道高糖能诱导EPCs中TNFR1表达,这种效应能被抗氧化剂抑制。因此,本实验主要通过观察体外高糖是否通过氧化应激反应激活TNFR1及其下游的凋亡信号通路,进而对大鼠骨髓源性EPCs凋亡产生影响,来探讨高糖对EPCs的作用和影响。方法:用颈部脱臼法处死SD大鼠,将其置于75%酒精中,浸泡并消毒15 min。然后将消毒后的大鼠放置于超净工作台上,用动物解剖器械分离大鼠的股骨和胫骨,分离完成后,用含1%肝素的无菌PBS液冲洗骨髓腔,直到冲洗液变无色透明为止,收集好冲洗液,并用离心机进行高速离心,离心后收集试管底部的细胞,选择使用Ficoll密度梯度离心法进行大鼠骨髓源性单核细胞的分离;分离后,将其接种于6孔板中,3天后进行首次换液,以后每隔3-4天换液,连续使用倒置显微镜观察细胞的形态变化并且使用激光共聚焦显微镜观察鉴定经Di I-ac LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的EPCs;用流式细胞仪检测经过不同含糖浓度(5.5、15、30、60 mmol/L)处理后的EPCs凋亡率,挑出最佳浓度;使用高糖(30 mmol/L)和氧化应激拮抗剂Tempol、TNFR1受体拮抗MAB430共同作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率;使用分子探针(DCFH-DA)检测不同糖浓度处理后EPCs的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量变化;使用Western blotting检测不同糖浓度和TNFR1受体拮抗MAB430处理EPCs后,其细胞表面TNFR1受体以及由其介导的细胞内信号通路相关蛋白(TRADD、TRAF2、RIP、NF-k Bp65、Caspase3)表达的情况。结果:在使用M199培养基培养3天后,EPCs大部分贴壁,呈圆形,逐渐增大伸展,培养至7天后,细胞生长迅速,镜下可见其呈集落样生长,培养至14天后,观察可发现细胞出现“鹅卵石”样形态分布。通过激光共聚焦显微镜观察细胞可见经过Di I-ac-LDL处理后阳性的EPCs为红色荧光,结合了FITC-UEA-1后的EPCs为绿色荧光,双染法阳性的细胞为正在分化的EPCs,表明所培养的细胞为EPCs。在高糖刺激EPCs的早期(24-48h),高糖组与对照组之间比较,没有明显的凋亡增加,而随着高糖刺激时间的延长,即高糖刺激的晚期(72-96h),可以发现高糖刺激组与正常对照组比较,凋亡细胞数目增加,高糖组(15mmol/L,30mmol/L,60mmol/L)与对照组进行组内比较,具有统计学意义(P<0.01);在同一时间点,将30mmol/L,60mmol/L的高糖组分别与15mmol/L高糖组相比,早期没有发现明显凋亡,而在刺激的晚期,仅发现60mmol/L的高糖组与15mmol/L的高糖组比较,细胞凋亡增加,具有统计学意义(P<0.01),在分别使用抗氧化剂Tempol、TNFR1受体拮抗剂MAB430处理EPCs24h、72h后,在与高糖组(30mmol/L)分别在24h,72h比较后,发现早期凋亡没有明显变化,而在晚期(72h)后,发现凋亡有明显下降,且数值具有显着统计学意义(P<0.01),同时在实验的早期,高糖组与对照组比较,ROS的值没有明显的增加,而随着刺激时间的延长,刺激的晚期(72h),发现高糖组ROS增加明显,与对照组比较,具有显着统计学意义(P<0.01),在刺激的早期和晚期,分别用Tempol、MAB430(TNFR1受体拮抗剂)处理后,发现与高糖组比较,早期ROS值没有明显的降低,而晚期ROS值有明显的降低,并且与高糖组比较,差异具有显着统计学意义(P<0.01),高糖(30mmol/l)刺激早期24h,TNFR1蛋白及其凋亡信号通路相关蛋白(TRAF2、TRADD、RIP、Caspase3)表达没有上调,而在刺激的72h后,相关蛋白表达明显上调,同时将上述蛋白表达量在72h与24h进行比较,差异具有显着统计学意义(P<0.01),氧化应激拮抗剂Tempol、TNFR1受体拮抗剂MAB430在72h能够降低上述TNF凋亡信号通路相关蛋白的表达,蛋白表达量有统计学意义(P<0.01),而随着高糖(30mmol/l)的刺激,NF-κBp65蛋白相对表达量是逐渐降低的,其蛋白表达量在72h与24h进行比较,差异具有显着统计学意义(P<0.01),在用Tempol、MAB430处理后,无论是早期还是晚期,与高糖组(30mmol/l)相比,其蛋白表达量是升高的,且差异具有显着统计学意义(P<0.01)。结论:1.高糖通过诱发内皮祖细胞氧化应激反应促进其凋亡,凋亡主要发生在刺激的后期,且具有浓度和时间的依赖性。2.高糖通过诱发内皮祖细胞氧化应激激活其TNFR1受体及其衔接蛋白TRADD,进而可能通过激活NF-κB p65转录因子,从而使得与凋亡直接相关的Caspase3蛋白表达增强,导致内皮祖细胞发生凋亡。
参考文献：
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[10]. 高糖诱发氧化应激反应激活TNFR1受体促内皮祖细胞凋亡的实验研究[D]. 谢飞. 四川医科大学. 2015