周健[1]1999年在《波形纤维蛋白转基因小鼠白内障的形成机制及波形纤维蛋白在人老年性白内障晶状体的表达》文中研究表明目的：老年性白内障在老年人中的罹患率达60％，是人类主要的致盲疾病，确切病因尚不清楚。随着转基因技术的发展，利用转基因动物从分子水平研究白内障的发病机理成为可能。1989年Capetanaki等报告了波形纤维蛋白转基因小鼠出现白内障。我们研究组制作了波形纤维蛋白转基因白内障小鼠模型。本系列研究从组织病理学及波形纤维蛋白表达等方面观察白内障小鼠晶状体的改变。为进一步探讨波形纤维蛋白表达在老年性白内障发病中的作用，我们又观察了人老年性白内障晶状体上皮细胞的形态改变及其中波形纤维蛋白的变化。探讨转基因小鼠白内障的形成机制及老年性白内障的发生机理。 方法：用显微注射法将12.7kb的鸡波形纤维蛋白基因转入ICR小鼠受精卵的雄前核中，发育成小鼠后，经Northern杂交法筛选出整合阳性小鼠，经杂交传代培育获得转基因白内障小鼠。用裂隙灯观察小鼠晶状体出现混浊的时间、程度。摘除白内障眼球，4例制备石蜡切片，在
周健, 惠延年, 李燕, 马吉献, 张平[2]1999年在《波形纤维蛋白在其转基因小鼠晶状体的表达》文中研究指明目的:观察波形纤维蛋白(Vimentin)在转基因小鼠晶状体的表达,探讨波形纤维蛋白与白内障形成的关系。方法:用显微注射法将鸡的12.7kb波形纤维蛋白基因导入小鼠受精卵的雄前核内,经培育、杂交传代得到20只波形纤维蛋白转基因白内障小鼠。取4只白内障眼球及4只正常眼球,制备石蜡切片,采用ABC免疫组化方法,观察波形纤维蛋白在晶状体的表达。再分别取正常、部分混浊和完全混浊的小鼠晶状体各1只,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,Western印迹法检测波形纤维蛋白。结果:波形纤维蛋白除在其转基因小鼠晶状体上皮细胞有表达以外,还在前部皮质及赤道部有异常的较强表达。在晶状体的尿素溶性蛋白中,经SDS-PAGE及Westem印迹法检测出57KD、与波形纤维蛋白抗体有特异反应的蛋白,在正常鼠、部分混浊和完全混浊的晶状体中,该蛋白带的灰密度(grey density)分别是15.56、34.59和33.06;波形纤维蛋白在溶于尿素的蛋白中的百分比分别是7.26％、9.05％和9.17％。结论:波形纤维蛋白的过度、异位表达可影响晶状体细胞的分化,导致白内障形成。眼科学报1999;15:199—203。
赵子德[3]2010年在《祛障穴冷冻疗法与随机改变冷冻位点对亚硒酸钠诱导大鼠白内障抑制作用差异性的实验研究》文中研究表明目的:1.建立大鼠白内障模型,并探讨亚硒酸钠诱导大鼠白内障模型晶状体混浊的发生机制。2.探讨祛障穴冷冻疗法和改变冷冻位点对亚硒酸钠诱导大鼠白内障模型晶状体混浊进展的抑制和延缓机制。3.通过对祛障穴冷冻疗法和改变冷冻位点方式的对比分析,探索优势冷冻位点,并探讨后者针对年龄相关性白内障治疗的有效性和可行性。4.为低温生物医学揭示冷冻对白内障抑制延缓作用的机理提供宝贵资料。方法:对35只大鼠行裂隙灯检查,排除晶状体病变。随机抽取5只大鼠作为正常对照组,其余大鼠随机分为3组,每组10只,隔日于颈背部皮下注射1mmol/ L的亚硒酸钠,共注射3次,正常组给予等剂量0.9%生理盐水,监测大鼠晶状体混浊变化。待晶状体刚刚出现混浊时,祛障穴冷冻治疗组大鼠给予祛障穴冷冻疗法,每周1次,5周一疗程,方法参照李永才发明祛障穴冷冻疗法。冷冻位点改变治疗组大鼠,于大鼠角巩膜缘12点位每次随机抽取4位点,行冷冻治疗,操作方法同祛障穴冷冻治疗组。未治疗组不予处理。通过裂隙灯观察并记录大鼠晶状体混浊的进展。晶状体混浊分级标准采用英国牛津大学眼科实验室方法。6wk时处死大鼠,取出晶状体,测定其中水溶性蛋白质含量、谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽还原酶(GR)及过氧化氢酶(CAT)活性。结果:1.除正常组以外,其余三组大鼠双眼均于1wk开始出现混浊,2wk～6wk白内障未治疗组大鼠双眼晶状体混浊进展较快,而两治疗组大鼠双眼晶状体相对B组混浊进展较慢,且混浊程度轻于B组,具有高度统计学意义(右:P=0.000,左:P=0.002)。2.晶状体可溶性蛋白质含量,与正常组相比,未治疗组大鼠显著降低,有高度统计学意义(右:P=0.010,左:P=0.001),祛障穴冷冻组右眼、冷冻位点改变组双眼低于正常组,但无统计学意义(P>0.05),祛障穴冷冻组左眼眼较正常组显著降低,具有高度统计学意义(P=0.016)。3.GR活性,各组大鼠双眼晶状体比较其差别无统计学意义(P>0.05);4.GSH比较,与正常组大鼠双眼比较白内障未治疗组、祛障穴冷冻组和冷冻位点改变治疗组双眼晶状体GSH含量明显降低,有高度统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。5.CAT活性,与正常组大鼠双眼比较白内障未治疗组、祛障穴冷冻组和冷冻位点改变治疗组双眼晶状体CAT活性明显降低,有高度统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。祛障穴冷冻组和冷冻位点改变治疗组CAT活性高于白内障未治疗组,右眼分别为41.4%和35.9%(P=0.003,P=0.012),左眼分别为32.3%和27.4%(P=0.008,P=0.031),具有高度统计学意义。6.色素沉着,祛障穴冷冻组和冷冻位点改变治疗组在对大鼠角巩膜缘进行冷冻治疗瞬间均形成冻斑,随即冻斑消失,6wk少数祛障穴冷冻组大鼠角巩膜缘冷冻位点处出现不同程度色素沉着,而这一表现在冷冻位点改变治疗组大鼠中未能出现。结论:1.亚硒酸钠诱导大鼠白内障模型是白内障发病机制及疗效评价的可靠模型。2.晶状体内氧化损伤可能贯穿于白内障的发生发展。3.祛障穴冷冻疗法对大鼠初发期白内障晶状体混浊有较好的抑制、延缓作用4.祛障穴冷冻疗法与随机改变4冷冻位点在对白内障大鼠晶状体混浊的抑制、延缓作用的比较中无显著性差异,而后者能够更好的分散由冷冻对局部组织引起的刺激和伤害。5.依据祛障穴冷冻疗法治疗老年性未成熟期白内障规范化整理研究成果(国家中医药管理局诊疗技术课题,国中医药科2001ZL27号),预计角巩膜缘随机选取4冷冻位点冷冻治疗年龄相关性白内障将取得较好疗效。
杨鑫[4]2012年在《JNK/c-Jun通路及其靶基因Bim与PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中的实验研究》文中认为1前言先天性或后天性因素引起的晶状体混浊即为白内障。白内障是目前最常见的致盲和视力残疾的原因之一。白内障的发病机制迄今尚未完全揭示,为了寻求有效的药物疗法,白内障的病因研究已成为眼科研究热点之一。已知多种因素均可诱导白内障的发生,目前认为氧化应激是诱导白内障发生的最初因素。近来对白内障发病机制的研究主要集中在细胞和分子生物学水平。晶状体上皮细胞可以维持整个晶状体的透明性,保持其内环境的稳定,且晶状体上皮细胞的凋亡被认为是除了先天性白内障以外所有类型的白内障发生的细胞学基础,因此防治原发性或后发性白内障的研究重点是如何调控晶状体上皮细胞的凋亡。PUMA、Bim是Bcl-2蛋白家族BH3-only亚家族中重要的促凋亡基因,在多种因素诱导的细胞凋亡启动和多种疾病的发生过程中都发挥着重要的作用。目前尚没有PUMA、Bim在过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3凋亡中作用的相关报道,探讨PUMA、Bim对人晶状体上皮细胞凋亡的作用及其诱导表达的途径和机制,进一步阐明白内障发病机制,可以为基因治疗提供前期的理论依据。JNK信号通路参与了多种生理和病理过程,激活后的JNK能激活包括转录因子在内的多种效应蛋白,产生生物学效应。C-jun是JNK的主要下游因子,编码的蛋白产物可以构成转录因子AP-1,转录因子AP-1是细胞内JNK/SAPK作用的重要目标。在活化条件下,JNK磷酸化c-jun,并增加其转录活性,c-jun蛋白可以根据不同的细胞类型决定诱导细胞凋亡或者抑制细胞凋亡。有关氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中JNK/c-jun通路的变化尚无报道。在不同的细胞中,PUMA> Bim的表达有不同的调节方式,如转录水平、翻译后修饰和蛋白水平的调控等。Bim还可受到多种信号通路的调节,如PI3K/Akt、 MLK/JNK、RAS/MAPK等。在晶状体上皮细胞的凋亡过程中,氧化应激是通过什么途径介导PUMA、 Bim的表达上调,目前尚不清楚,进一步了解介导途径,通过抑制特定转录因子的活性从而抑制PUMA、Bim的表达可能会成为白内障治疗的一种新途径。2目的研究Bim、PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3凋亡中的作用；探讨JNK/c-Jun信号通路的激活与其靶基因Bim、PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3凋亡中上调的关系,从而进一步阐明人晶状体上皮细胞凋亡的分子生物学机制。3方法3.1细胞的培养：贴壁HLEC-B3细胞在37℃、5%二氧化碳孵育箱、含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,2-3d以1：2传代1次；3.2细胞凋亡的检测：过氧化氢刺激体外培养的人晶状体上皮细胞,Hoechst33258染色观察细胞形态,凋亡细胞呈现典型的细胞核致密浓染或碎块状致密浓染,计数细胞凋亡率；3.3Western Blot:采用western blot方法检测Caspase-3及JNK是否激活,观察c-Jun、Bim及PUMA蛋白水平；3.4RT-PCR:采用RT-PCR方法检测c-Jun、Bim、PUMA RNA表达水平；3.5小分子干扰：采用JNK/c-Jun通路抑制剂CEP11004及SP600125观察能否保护氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡,采用小分子干扰片段敲除Bim、 PUMA,观察能否保护氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡。4结果4.1氧化应激诱导人晶状体上皮细胞HLEC-B3凋亡采用50μmol/L H2O2处理晶状体上皮细胞4h、8h、12h后,分别引起约4.30%±1.15%、27.08%±0.74%、46.59%±0.91%细胞凋亡,与无H202处理组(2.74%±0.21%)相比差异有统计学意义。凋亡相关的关键蛋白Caspase-3发生时间依赖的表达上调。以上结果充分表明：氧化应激能诱导人晶状体上皮细胞发生典型的凋亡。4.2氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞HLEC-B3凋亡中,JNK/c-Jun通路激活,Bim及PUMA表达上调H202处理2小时JNK磷酸化水平就显著升高,并在后续的检测时间点持续增加,而JNK蛋白质总量保持一致,说明JNK被激活。激活后的JNK磷酸化下游底物c-Jun,使c-Jun转录活性增加。c-Jun磷酸化水平在H202处理2小时后显著增加,与JNK磷酸化变化趋势基本一致。这一结果表明氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞HLEC-B3凋亡过程中JNK/c-Jun通路激活。伴随着细胞凋亡的发生,Bim及PUMA蛋白在4h开始发生显著上调,早于显著凋亡形态发生的时间点(8h),进一步采用RT-PCR手段检测后发现Bim及PUMA mRNA在2h已有显著上调。以上结果表明,氧化应激在诱导HLEC-B3凋亡的同时,同时也诱导了促凋亡关键蛋白Bim及PUMA转录依赖的上调。4.3过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡过程中,NK/c-Jun介导了Bim及PUMA上调H202处理的人晶状体上皮细胞中加入JNK/c-Jun信号通路抑制剂CEP11004或SP600125处理4小时后WB检测,以无H202或H2O2+DMSO处理的细胞分别作为阴性对照和阳性对照,结果发现,CEP11004及SP600125可完全抑制H202引起的c-Jun蛋白水平增加,说明CEP11004及SP600125阻断了JNK活性。同时发现Bim及PUMA的表达上调可被CEP11004及SP60012明显抑制。我们的结果表明JNK介导了Bim及PUMA的表达上调。同时我们发现,JNK通路抑制剂能明显降低H202诱导的人晶状体上皮细胞凋亡(12h),使凋亡率由43.49%±1.05%降低为13.29%±0.57%(CEP11004)及15.89%±1.03%(SP600125)。4.4小分子干扰Bim及PUMA保护过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡首先我们验证了小分子干扰片段的有效性。当细胞融合度为60%时,转染Bim或PUMA小分子干扰片段,24h后用H202处理细胞,处理细胞后8h收蛋白,用western blot检测Bim及PUMA的表达情况,结果表明,Bim及PUMA的小分子干扰片段分别有效抑制了氧化应激诱导的Bim及PUMA蛋白质表达上调。在验证了小分子干扰片段的有效性后,我们在敲除Bim或PUMA表达的基础上观察H202诱导HLEC-B3凋亡的情况。H2O2处理HLEC-B312h后引起约47.70%±0.42%细胞发生凋亡,而敲除Bim的表达后细胞凋亡率显著降低,降为25.50%±1.02%(siBim1)及30.39%±0.62%(siBim2);相似的干扰PUMA也能明显降低人晶状体上皮细胞凋亡,由44.50±0.63%降为20.51%±0.78%(siPUMA1)及23.23%±0.58%(siPUMA2)。以上结果表明敲除Bim或PUMA的表达对HLEC-B3有一定的保护作用,Bim及PUMA参与了氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡。5结论过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中,PUMA、Bim的表达上调,JNK/c-Jun介导过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中PUMA、Bim的上调。JNK/c-Jun介导的Bim及PUMA上调参与了过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡,可能在白内障的发生发展中发挥重要作用。此研究更深入的探讨了人晶状体上皮细胞的凋亡机制,为白内障的发病机制和白内障的防治提供更多的理论依据。
参考文献：
[1]. 波形纤维蛋白转基因小鼠白内障的形成机制及波形纤维蛋白在人老年性白内障晶状体的表达[D]. 周健. 第四军医大学. 1999
[2]. 波形纤维蛋白在其转基因小鼠晶状体的表达[J]. 周健, 惠延年, 李燕, 马吉献, 张平. 眼科学报. 1999
[3]. 祛障穴冷冻疗法与随机改变冷冻位点对亚硒酸钠诱导大鼠白内障抑制作用差异性的实验研究[D]. 赵子德. 长春中医药大学. 2010
[4]. JNK/c-Jun通路及其靶基因Bim与PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中的实验研究[D]. 杨鑫. 郑州大学. 2012