【摘 要】目的 研究POKemon、p14ARF 基因在结直肠癌细胞系中的表达情况。方法 采用RT－PCR、细胞免疫化学技术检测POKemon、p14ARF 在5 种人结直肠癌细胞中的表达。 结果 POKemon 在SW480、SW480/M5、LOVO、SW620 中阳性表达，在HCT116 阴性表达；p14ARF 在HCT116 阳性表达，其余细胞均阴性表达。结论 结直肠癌细胞系中存在POKemon的表达，且与p14ARF 作用负相关。
【关键词】POKemon 基因；p14ARF 基因；大肠癌【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-08-042-02
POKemon 是近年发现的肿瘤发生相关基因，是抑癌基因p19ARF 启动子的特异性转录抑制因子，间接调控着p53 通路，最终促进细胞增殖及瘤性转化。本研究以大肠癌细胞为研究对象，从mRNA 与蛋白质水平分别检测POKemon、p14ARF 基因表达情况，检测其表达并分析两基因相互作用。
1 材料与方法1.1 细胞大肠癌细胞株SW620 、SW480 、HCT116 、LOVO 、SW480/M5，细胞株均购于ATCC。其中 LOVO 和 SW620 是结直肠癌淋巴结转移癌建系 ,具有高转移性 ,SW480 和 HCT116是结直肠癌原发癌建系, SW480/M5 是结直肠癌肝转移癌建系。
1.2 试剂RPMI-1640 培养基（GIBCO Inc）,小牛血清（GIBCO Inc），胎牛血清（杭州四季青）， DEPC （ 北京赛百盛公司），Trizol(Invitrogen Inc), POKemon、p14ARF 引物用 Primer 5 软件自行设计POKemon：5’-GAAGCCCTACGAGTGCAACATC-3’， 5’-GTGGTTCTTCAGGTCGTAGTTGTG-3，962bp；p14ARF：5’-AGTGGCGCTGCTCACCTC-3’，5’-TCCCGAGGTTTCTCAGAG-3’360bp；β-actin：5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCT-3’ 5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’，670bp,由赛百盛公司合成。POKemon 一抗由Robin M （Department of PathologySloan-Kettering USA）博士惠赠，p14ARF（NeoMakers 公司）， SABC免疫组化试剂盒（博士德公司）。
1.3.方法1.3.1 细胞培养人结直肠癌细胞株采用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养液培养，置 37℃、5% CO2 培养箱内培养 ,取生长状态良好的细胞用于实验。
1.3.2 RT-PCR待细胞长至状态良好 ,铺满瓶壁后 ,参照说明书 ,用Trizol 试剂常规提取细胞总 RNA；用紫外分光光度计检测RNA的产量，测量260nm 和280nm 处的吸光度，1OD=40ug/ml。将处理好的RNA 样品，稍离心，80V 恒压电流25mA 电泳20 分钟,在紫外凝胶成像仪上观察结果。cDNA 链合成，PCR 扩增目的片断。PCR 产物检测及鉴定，琼脂糖凝胶电泳；收集PCR产物，4℃保存，由博亚公司测序分析。
1.3.3 免疫细胞化学方法检测蛋白表达制备单细胞悬液接种于六孔板中的盖玻片上，5%CO2 培养箱内培养 36 小时，取出，PBS 漂洗 ；95%乙醇固定, PBS漂洗；滴加5%BSA 封闭液，室温15min；去掉多余液体，不洗，滴加一抗、二抗、SABC 复合物、DAB 与H2O2，显微镜观察显色，蒸馏水洗中止；苏木素衬染，分化反蓝，脱水封片。
结果判断：POKemon 和p14ARF 均为胞膜或胞浆显现棕黄色者为阳性，以PBS 代替一抗作为阴性对照。
2 结果2.1 细胞培养：生长状态良好，贴壁状态伸展。
2.2 RT－PCR2.2.1 经紫外分光光度计检测，提取的总RNA 含量，均大于1μg/μl，A260/A280 的比值符合实验要求，变性凝胶电泳检测均为3 条带，28S 和18S 两条带清晰可见，无拖尾，证明RNA 质量良好，未发生降解。
2.2．2 POKemon 和p14ARF 的PCR 产物电泳5 种结直肠癌细胞中,POKemon 基因在SW480、SW480/M5、LoVo、SW620 阳性表达, 在HCT116 阴性表达。
2.2.3 POKemon 和p14ARF 的PCR 产物测序，测序结果碱基排列与genebank 提供序列相同。
2.3 POKemon 和p14ARF 免疫细胞化学检测POKemon 在细胞株SW480、SW480/M5、LoVo、SW620的细胞膜与浆均有阳性信号表达，在HCT116 细胞中阴性表达。 P14ARF在HCT116 中阳性表达，其余细胞中阴性表达。
3.讨 论POKemon 作为POK 家族的成员之一, 最初作为特异连接HIV-1 启动子区域被证实[1]。Maeda T[2]等用癌基因分别或联合转染WT MEFs，结果表明：单个癌基因的过表达不能引起细胞的瘤性转化；当二个癌基因联合转染后，可引起细胞的增殖与瘤性转化；但zbtb7－/－的MEFs 在上述癌基因联合转染后，细胞的生长及分化没有受丝毫影响，由此可见POKemon 在细胞增殖与瘤性转化中是必不可少的。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在把分别含有myc、ras的逆转录病毒转染WT MEFs 后，分别引起细胞的凋亡、早衰[3，4]，分别与POKemon 联合转染后，POKemon 阻断了细胞的凋亡和早衰，呈现明显的增殖优势，并且在软琼脂培养基上很容易地形成细胞克隆；此外，POKemon 还阻断E1A 诱导的凋亡[5]。因而得出结论：POKemon 可以阻断部分细胞的凋亡、早衰，并且可能与其它癌基因协同作用促进肿瘤的发生。
POKemon 不但能使正常细胞发生瘤性转化，还可使其它致癌基因产生作用。
本研究结果表明，POKemon 基因在癌细胞中无论在mRNA水平还是在蛋白水平均具有较普遍性的表达, p14ARF 基因总体上表达减弱,且二者的表达状态反。初步结果显示，Pokemonp14ARF基因调控链亦存在于大肠癌细胞中，可能参与了大肠粘膜细胞的癌变及其他生物学过程。
POKemon 直接与p19ARF 启动子连接并抑制其转录。POK蛋白通过POZ 域的蛋白连接功能辅助抑制，从而作为转录抑制因子发挥功能[6]。Maeda T[2]筛选了一个有着与转录因子SP1相似的序列且富含GC 序列作为既定的DNA 连接域，证实POKemon 确实存在DNA 连接序列实现其转录抑制功能，且与p19ARF 启动子连接并抑制其功能。而且，POKemon 不能抑制第二外显子突变的p19ARF 的表达，暗示了其在ARF 的连接区位于转录起始区上游50 个碱基处。POKemon 缺失时，p19ARF 表达水平在热休克或致癌性转化实验中均显著升高。有趣的是，在POKemon 缺失的MEFs 细胞中，与p19 共用编码框的p16INK4a 基因的表达却没有明显增高。实验结果统计表明： POKemon 与p19ARF 的表达负相关，但和p16INK4a 的表达无相关性，均证实POKemon 对p19ARF 抑制的特异性。
抑癌基因ARF 通过减弱mdm2 介导的p53 基因的降解而发挥作用。抑癌基因INK4a-ARF 共用两个阅读框，同时编码p16ARF 和p14ARF（小鼠同源物为p19ARF）两个细胞周期调控因子,分别通过pRb 和p53 通路调控细胞周期。ARF 与p53的结合依赖mdm2 的介导，ARF 与mdm2 的结合区域是位于mdm2 中央的第235-264 和270-289 个氨基酸残基，p53 与mdm2 的NH2-末端17-125 个氨基酸残基结合，二者以非竞争方式分别结合mdm2 的不同区域，Kussie P [7]用免疫共沉淀法表明三者形成三体复合物，从而使p19ARF（p14ARF）基因通过减弱mdm2 介导的p53 基因的降解而发挥作用[8]。因而，Pokemon、p19ARF/ p14ARF、mdm2、p53 四者穿插作用，互为因果，共同构成基因调控链，构成肿瘤发生过程中庞大基因调控网络的一部分。
综上所述，新发现的POKemon 基因在大肠癌细胞中可能发挥重要作用，并且抑制p14ARF 转录，二者作用呈负相关，它们在大肠癌中的生物学特性中的详细作用机制需进一步探讨。
参考文献1．Zindy F,et al.Myc signaling via the ARF tumor suppressorregulates p53-dependent apoptosis and immortalization.Genes Dev.2012,12:2424-2433.2．Maeda T, Hobbs RM, Merghoub T, et al. Role of theproto-oncogene Pokemon in cellular transformation and ARFrepression. Nature, 2010,43(3):278–285.3．Serrano M,Lin A,Mccurrach M,et al.Oncogenic ras provokespremature cell senescence associated with accumulation of p53 andp16.Cell ,2013,88:593-602.4．Mironchik, Y., Winnard Jr., P.T., Vesuna, et al. Twistoverexpression induces in vivo angiogenesis and correlates withchromosomal instability in breast cancer. Cancer Res. 2011;65:10801–10809.5. Jones MB, Krutzsch H,Shu H,etal. Proteomic analysis andidentification of new biomarkers and therapeutic targets for invasiveovarian cancer. Proteomics ,2012,2(1):76284.6. Sadatmandi N, Tyler T, Husang Y, et al. Growthsuppression by a p14ARF exon l beta adenovirus in human tumoncell lines of varying p53 and Rb starus. Cancer GeneTher,2010,9:830-830.7.Takahiro M, Robin M,Paolo P,et al.The Transcription FactorPokemon: A New Key Player in Cancer Pathogenesis. CancerRes ,2009, 65: (19). 8575-8578。
8.Agrawal A,Yang J,Murphy RF,et al. Regulation of thep14ARF-Mdm2-p53 pathway: an overview in breast cancer.ExpMol Pathol. 2010 Oct;81(2):115-22. Epub Aug 17.作者单位：山西省肿瘤医院 ；通讯作者：杨晓棠
论文作者:李亚玲1 郭江红1 白 玮1 高 宁1 杨晓棠
论文发表刊物:《系统医学》2015年第1卷第8期供稿
论文发表时间:2016/1/18
标签：基因论文; 细胞论文; 转录论文; 转染论文; 抑制论文; 阴性论文; 阳性论文; 《系统医学》2015年第1卷第8期供稿论文;