张敏 姚源璋（通讯作者）
（江苏省中西医结合医院肾内科 江苏 南京 210028）
【摘要】 目的：研究金银花水提取物对TNF-α刺激小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES13培养上清液IL-1、MCP-1表达的影响，以探讨金银花治疗慢性肾病的有效机制。方法：MTT筛选金银花对体外培养SV40 MES13的有效浓度，将体外培养SV40 MES13分为5组：对照组：正常培养SV40 MES13不加任何药物刺激；刺激组：TNF-α（终浓度10ng/ml）；金银花组：TNF-α（终浓度10ng/ml）+不同浓度金银花（终浓度分别为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml）。MTT检测各组对SV40 MES13生长的影响，ELISA检测各组细胞培养上清液中IL-1、MCP-1的含量。结果：与对照组相比，刺激组SV40 MES13明显增值，细胞培养上清液中IL-1、MCP-1的表达水平显著升高。金银花各组能抑制SV40 MES13的增值及培养上清液中IL-1、MCP-1的表达，并且呈浓度依赖性。结论：金银花可能通过对炎症反应相关因子的影响，从而达到延缓肾脏病理进程,发挥对慢性肾脏病的治疗作用。
【关键词】 金银花；肾病；肾小球系膜细胞
【中图分类号】R965 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2015）27-0231-03
近年来诸多研究发现，慢性肾脏病尤其是慢性肾衰竭(CRF)患者普遍存在着微炎症反应状态[1]。微炎症反应时所导致的肾小球系膜细胞增殖和系膜细胞外基质增加是几乎所有慢性进展性肾脏病最重要的组织学特征[2]。因此肾小球系膜细胞的研究对于肾脏疾病诊断与治疗具有重要意义。
目前诸多研究表明[3]清热解毒中药具有抗炎性细胞因子、免疫调节、抗血小板聚集、抗氧化应激等作用，恰当合理的应用往往能解除或缓解肾脏的损害，促进肾脏病变的修复。因此本文选取临床治疗慢性肾病中应用较为广泛的金银花作为研究对象，观察其对TNF-α刺激的小鼠肾小球系膜细胞IL-1、MCP-1表达的影响，探讨其治疗慢性肾病的有效机理。
1.材料
1.1 细胞株
小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES13 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：GNM21，接种于含5%FBS、95%HEPES的DMEM/F12(3:1)培养液中，37℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养。
1.2 药物及主要试剂
金银花购自江苏省中西医结合医院中药房、MTT、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，DMEM培养液、胎牛血清FBS、胰蛋白酶消化液均购自美国Invitrogen公司、Mouse MCP-1及IL-6ELISA试剂盒购至上海依科赛生物制品有限公司。
2.方法
2.1 中药水提取物的制备
称取金银花200g，在2000mlddH2O中浸泡30min后100℃煎煮1h，过325-网筛，收集流出液。加1000mlddH2O至药渣重煎30min后合并两次煎熬液，小火浓缩至200ml，使药液浓度为1.0g/ml。离心(2000rpm/min)5min。上清经0.22μm滤膜过滤分装，于-2O℃每管100ul冻存备用。实验中用不含FBS的95%HEPES的DMEM/F12(3:1)培养液溶解中药水煎剂。
2.2 MTT检测金银花水提取物对SV40 MES 13生长的影响
取对数生长期SV40 MES 13细胞，以1×105/ml、100μl/孔接种于96孔板，37℃、5% CO2培养箱培养。24小时后加入不同浓度梯度的金银花水提取物（无血清DMEM溶解），每种浓度设置3个复孔。药物作用24h后加10ul MTT，37℃孵育4h，加DMSO100ul，震荡10min，于570、630nm波长处测定各孔吸光度（A）值。
抑制率=1-（A570-A630）实验组/（A570-A630）对照组
2.3 MTT检测金银花水提取物对TNF-α刺激的SV40 MES 13增值的影响
取对数生长期SV40 MES 13细胞，以1×105/ml、100μl/孔接种于96孔板，37℃、5% CO2培养箱培养。24小时后分组处理：对照组不加任何药物处理；刺激组仅给予TNF-α（终浓度10ng/ml）刺激；药物处理组先用不同浓度金银花水提取物（2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml）处理30min，再加TNF-α（终浓度10ng/ml）；每组均设3个复孔，37℃、5% CO2培养。24h后加10ul MTT，37℃孵育4h，加DMSO100ul，震荡10min，于570、630nm波长处测定各孔吸光度（A）值。
抑制率=1-（A570-A630）实验组/（A570-A630）对照组
2.4 ELISA检测金银花水提取物对TNF-α刺激的SV40 MES 13培养上清液中MCP-1、IL-6水平的影响
取对数生长期SV40 MES 13细胞，以2×105/ml、2ml/孔接种于6孔板，37℃、5% CO2培养箱孵育过夜。血清饥饿同步化处理12小时后分组处理：对照组不施加任何药物处理；刺激组仅给予TNF-α（终浓度10ng/ml）刺激；药物处理组先用不同浓度金银花（2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml）处理30min，再用TNF-α（终浓度10ng/ml）刺激；每组均设3个复孔，37℃、5% CO2培养箱培养。药物作用12小时后收集上清液，2000rpm离心5min，收集上清。按ELISA试剂盒说明书检测各组上清液中MCP-1、IL-6水平。
2.5 统计学处理
数据处理采用SPSS17.0统计分析软件。数据符合正态分布采用t检验（组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验标准，方差不齐时用非参数方法进行检验），不符合正态分布采用非参数检验，以P＜0.05表示具有统计学意义，以P＜0.01表示有高度统计学意义。
3.结果
3.1 金银花水提取物对SV40 MES 13增值的影响
MTT结果（表1）显示：2.5mg/ml浓度以上金银花作用24小时后SV40 MES 13增值明显减低，抑制率增加，呈浓度依赖性。金银花2.5mg/ml浓度时对SV40 MES 13的抑制率接近50%，对SV40 MES 13有毒性，不宜用于药物研究。因此选用该浓度以下3个浓度2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml作为后续实验工作浓度。
表1 不同浓度金银花水提取物对小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响（x-±s，n=3）
注：表中处理组与对照组相比较，★P＜0.01，与A组比较☆P＜0.01，
与B组相比较△P＜0.01，与C组比较▽P＜0.01
3.2 MTT检测金银花水提取物对TNF-α刺激的SV40 MES 13增值的影响
从表2可以看出终浓度10ng/ml 的TNF-α能明显促进SV40 MES 13增殖，与对照组相比具有显著统计学意义（P＜0.01)。金银花组促进SV40 MES 13的增值明显减低（P＜0.01），并且随药物浓度的增加抑制作用越明显，呈浓度依赖性（P＜0.01)。
表2 金银花水提取物对TNF-α刺激的SV40 MES 13增值的影响（x-±s，n=3）
注：与对照组比较，★P＜0.01；与刺激组比较，☆P＜0.01；
金银花组间比较△P＜0.01
3.3 ELISA检测金银花水提取物对TNF-α刺激的SV40 MES 13培养上清液中MCP-1、IL-6表达水平的影响
表3 ELISA检测清热解毒中药对TNF-α刺激的SV40 MES 13
如表3所示：终浓度10ng/ml 的TNF-α能明显促进SV40 MES 13培养上清液中MCP-1、IL-6的表达，与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）。金银花能够抑制MCP-1、IL-6的表达，与刺激组比较具有统计学意义（P＜0.05），并且呈浓度依赖性。
根据ELISA试剂盒中标准品分别绘制MCP-1、IL-6的标准曲线，并建立计算出标准表达式：yMCP-1=0.006x+0.410，yIL-6 =340.3x-136.5。X为A值，y为浓度，单位（pg/ml）。标准曲线如图所示：
4.讨论
慢性肾脏病患者体内存在持续的炎症状态并非由外源性病原微生物感染或体内机会性病原微生物感染所引起的，而是机体在微生物、内毒素、各种化学物质、补体、免疫复合物等的刺激下，单核巨噬细胞系统激活，白细胞介素-l(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-1，IL-6)和肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等为主的促炎症细胞因子释放所引起的，是一种缓慢发生和持续存在的轻微炎症反应，其实质为免疫炎症[4]。已有的研究发现，多种肾脏疾病中存在炎症介质水平的增高，如TNF-α、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-B)、血小板源性生长因子 (Platelet-derived growth factor, PDGF)和IL-I等。炎症介质又可趋化、激活炎症细胞，各种炎症介质间相互促进或制约，形成一个复杂的网络关系，促进肾小球、小管间质慢性进展性损害[5] 。
其中单核巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）作为一种重要的炎症趋化刺激因子，主要趋化单核细胞和T淋巴细胞，诱导单核细胞、内皮细胞表达黏附分子，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集[6]。局部分泌的趋化因子在肾脏炎症的起始和放大阶段介导白细胞的聚集，而浸润的白细胞通过释放炎症和促纤维化因子而加重肾损害[7]。IL-6是肾脏病进展中一种非常重要的促炎细胞因子。正常肾脏细胞自发的产生微量的IL-6，当GMC受到IL-1β、TNF-α或脂多糖的刺激后，IL-6mRNA的表达明显增高。IL-6能促进GMC的增殖和系膜基质增多[8]。
清热解毒法在肾脏病的临床应用中疗效显著，大量的临床实践己经证实运用清热解毒中药可有效地缓解症状，减缓疾病的进展。但是有关治疗肾脏病的有效机理并不明确，且在临床应用中大都根据经验用药，较难提供客观依据。因此本课题中将系统观察临床应用较为广泛的金银花对肾小球固有细胞增殖影响及一些炎症因子表达影响，试图阐明其可能的分子机制。
金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾，含有挥发油、有机酸、黄酮类、皂苷类等多种有效成分，现代药理研究[9]表明金银花及其同属植物，其具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫调节等作用。本实发现金银花能够有效抑制TNF-α诱导的SV40 MES 13增值，降低细胞培养上清液中IL-6、MCP-1的水平，并且呈浓度依赖性，从而推测金银花正是通过抑制肾小球系膜细胞的增殖下调IL-6、MCP-1为主的促炎因子的表达进而达到治疗肾脏病的目的。但是金银花化学成分复杂，具体是何种成分起到关键作用尚未证实。金银花又是通过何种途径抑制IL-6、MCP-1的表达，是否通过调控炎症的总开关NF-κB途径发挥作用尚未证实。本课题将在后续实验工作中进一步证实金银花与NF-κB的关系及起关键作用的有效成分，为中药治疗慢性肾脏病提供更多客观依据。
【参考文献】
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[3] 张敏,姚源璋.清热解毒中药在肾脏病中的应用研究[J].吉林中医药.2011,(10):1011-1012.
[4] 陈秀益,刘必成,尹莲芳.微炎症应状态与终末期肾病[J].临床荟萃,2005,20(12):712-715.
[5] 曾贵峰.肾脏病肾组织中的表达及其与临床病理的关系[.D].兰州大学,2008.(01).
[6] 邢燕,孙致连,董崇周等.血管紧张素Ⅱ对肾小球系膜细胞MCP-1表达的影响[J].中国实验诊断学.2011,(01):57-59.
[7] 王海燕.肾脏病学[M].北京：人民卫生出版社，2009：742.
[8] 王海燕.肾脏病学[M].北京：人民卫生出版社，2009：750.
[9] 季雪峰.金银花药理学研究[J].安徽医药.2003,(04):311-313.
本课题为江苏省中医药局基金资助项目(No．LZ11067)
通讯作者：姚源璋（1956-）男，中国中医科学院江苏分院，江苏省中西医结合医院肾内科 主任医师 研究方向：中医药治疗慢性肾脏病机制研究。
论文作者:张敏,姚源璋（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第27期供稿
论文发表时间:2015/11/4
标签：浓度论文; 炎症论文; 细胞论文; 肾小球论文; 提取物论文; 肾脏论文; 对照组论文; 《医药前沿》2015年第27期供稿论文;