武慧丽[1]2002年在《树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎发病和耐受中作用的研究》文中研究说明EAE是T细胞介导的CNS脱髓鞘疾病，是MS的经典动物模型。小剂量口服自身抗原诱导免疫耐受可有效地抑制EAE和MS，这已被诸多研究所证实，但其机制尚不清楚。DCs作为免疫反应的启动者，在免疫耐受中作用研究报道较少。本研究共分两大部分：第一部分，口服髓鞘素抑制EAE的实验研究。每只大鼠四足挚皮内注射GPSCH和CFA制成的油包水剂0.4ml，足背皮下注射百日咳减毒活菌2.5×10~9成功诱导EAE模型。在免疫前7、5、2天，免疫当天和免疫后2、5、7天喂食梯度离心法制成的牛髓鞘素诱导口服耐受模型。第二部分，DCs在EAE发病和口服耐受中的作用。在免疫后第4、7、9、15、23天分别取EAE组和口服耐受组大鼠的腋窝、腹股沟淋巴结、脑、脊髓组织，冰冻切片，HE染色、直接免疫荧光染色、淋巴结DCs的流式细胞仪分析，结果如下所示： 1．EAE组在10d p．i．开始发病，而口服耐受组在12d p．i．开始发病。15d p．i．，EAE发病达高峰，口服耐受组发病率22.2％(n=18)，明显比EAE组发病率77.8％(n=18)低。临床症状评分两组间差异显着(口服组，0.56±1.13，n=18；EAE组，1.44±1.13，n=18；P＜0.05)。口服耐受组病灶数量及疾病严重程度较EAE组明显减轻。 2．DCs免疫荧光染色观察到在4、7、9d p．i．，外周淋巴结DCs逐渐增多，9d p．i．脊髓、脑中可见DCs浸润，口服耐受组与EAE组无显着差别。15 p．i．、23d p．i．DCs浸润数量与疾病症状严重程度相一致。山岌『医科大学祠吐d忿学亡比创含j仁 3.流式细胞仪检测15d p.i.大鼠外周淋巴结CDllc卡、cD86+DCs数量，口服耐受组与EAE组I旬虽差异不显着，但不同症状间差异显着。 结论: 1.加用百日咳减毒活菌对EAE不敏感的Wistar大鼠成功地诱导出EAE模型，病程、病变、临床表现典型，发病率高，经济易行，很适一于在国内开展。 2.喂食牛髓鞘素使EAE发病率明显降低，发病延迟，发病高峰症状减轻，表明口服髓鞘素对EAE起保护作用。 3.外周淋巴结和CNS局部DCs在自身免疫性疾病EAE的发生、发展、转拼〕尤其在触发发病中起着重要作用。 4.EAE的口服耐受可能涉及许多机制，如克隆删除、主动抑制等。DCS作为免疫反应的始动者，其数量变化在口服耐受的产生机制中起着一种次要作用。
刘杨[2]2005年在《中枢神经系统中树突状细胞在实验性自身免疫性脊髓炎及免疫耐受中的作用》文中认为目的:明确中枢神经系统中树突状细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病以及口服抗原耐受中的作用。 方法:使用牛脊髓髓鞘碱性蛋白(MBP)与福氏免疫佐剂,辅以百日咳杆菌,制作EAE模型。部分动物分别于制作模型前、后灌胃MBP加蛋白酶抑制剂制作口服抗原免疫耐受的预防和治疗模型,观察小鼠发病时间、发病例数、发病病程等变化,同时用HE染色、Luxol快蓝染色(LFB)以及免疫组化法观察EAE以及口服MBP耐受后,中枢神经系统中浸润的淋巴细胞和树突状细胞的变化。 结果:对照组无一发病;EAE组于发病率75%,病程持续7.2±1.3天;MBP预防组,相对EAE组发病时间晚,发病率明显降低,临床得分和病程也较低。MBP治疗组,相对EAE组发病时间、发病率没有明显差异,但临床得分和发病病程明显降低。 组织学检查可以见到在对照组偶尔可以见到CD11b+、CD11c+阳性细胞。EAE组在发病高峰期有明显的炎症细胞浸润、神经纤维肿胀疏松及CD11b+、CD11c+阳性细胞,未见明显表达CD8α+细胞。MBP预防组和MBP治疗组免疫细胞浸润相对EAE对照组病理变化情况明显减轻,CD11b+、CD11c+树突样细胞也明显少。 结论:1.在正常脑组织中存在少量DC1细胞,是DC1而不是DC2细胞与中枢神经系统免疫以及EAE病程及其组织损伤有关。树突状细胞激活在EAE的发病及进展中起重要作用。2.使用口服MBP方法可以导致动物对EAE的免疫耐受,可以保护动物免受到自身免疫反应的损伤。3.使用口服MBP诱导免耐受的动物脑组织中DC细胞较未免疫耐受的脑组织中数量明显减少。进一步提示DC1存在于脑组织中与EAE发病及组织损伤有关。
王克玲[3]2011年在《FOXP3基因过表达腺病毒转染未成熟树突状细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎免疫耐受作用的研究》文中研究说明目的:多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种主要由T细胞介导,以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是MS的经典动物模型。目前病因及发病机制尚未明确。大量的研究表明MS和EAE的发生与T细胞的异常活化有关,发现CD4+T细胞在MS的发病机理中处于核心地位。既往比较认可的机制为Th1/Th2失衡导致MS。Th1通过分泌IL-2、IL-12、IFN-γ等因子,加重MS病情;Th2通过分泌IL-4、IL-5、IL-10等因子,缓解病情。新近又提出Th17/Treg失衡导致MS,Th17通过分泌IL-17加重炎症,调节性T细胞(regulatoryT cell, Treg)可抑制免疫反应,减轻炎症。对免疫耐受机制及其诱导方法的研究,已成为目前MS免疫研究的重点之一。树突状细胞(dendritic cell, DC)是迄今为止惟一能刺激初始T细胞活化、增殖的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)。DC是特异性免疫应答的启动者,在MS的病理免疫应答中起关键作用。近来研究发现DC在免疫调节中发挥免疫应答和免疫耐受的双重作用,故而提出了耐受性DC( tolerogenic dendritic cell, tDC)的概念。即DC向T细胞提呈抗原可有两种不同结果:免疫刺激(免疫原性)或免疫抑制(耐受原性)。根据成熟程度,将DC分为未成熟DC ( immature DC, imDC)和成熟DC (mature DC, mDC)。两种DC形态、细胞表型和功能不同。DC可通过细胞表面分子和分泌细胞因子的改变,调节抗原特异性T细胞分化,引起不同的免疫应答。不同类型的DC具有不同的特征,imDC能诱导免疫耐受,mDC有很强的抗原提呈能力,能够激发初始T细胞的活化。基因修饰DC,诱导耐受性DC,从而治疗多发性硬化等自身免疫病,已成为目前研究的热点。Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor )称为叉状头/翅膀状螺旋转录因子,是FOXP3+Tregs特异性转录因子,在调控Treg细胞的发育和功能上起重要作用。将FOXP3基因转染细胞,诱导产生有调节功能的细胞,为调节性细胞用于多发性硬化等自身免疫性疾病的临床免疫治疗提供了可能。吲哚胺-2,3双加氧酶(Indoleamine 2, 3-xygenase, IDO),是色氨酸分解代谢的限速酶,可在局部形成低色氨酸环境。DC表达IDO参与了机体的免疫耐受。DC表达IDO,通过色氨酸衰竭和毒性代谢产物来诱导T细胞无能,抑制T细胞增殖、促进凋亡。新近发现IDO还可以诱导产生Treg,进而介导免疫耐受。两者之间存在着相互促进的关系,即IDO可以诱导产生新的Treg,而Treg又可诱导IDO的表达。Treg可通过表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)与DC表面B7-1/B7-2结合,激发DC细胞IDO的高表达。本研究应用FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC,观察转染后imDC(DC.FOXP3)的生物学特性、细胞表型及自身各种细胞因子的表达和分泌的变化。在体外观察DC.FOXP3对EAE模型小鼠脾脏CD4+T细胞的影响,并用IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl tryptophan, 1-MT)拮抗IDO作用,从而探讨DC.FOXP3诱导免疫耐受的机制。为临床防治MS提供新的思路。方法:1小鼠FOXP3基因过表达重组腺病毒载体的构建和鉴定小鼠FOXP3基因为模板,PCR扩增目的基因,并将其克隆到腺病毒载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG上,测序后腺病毒包装、纯化、鉴定,测病毒滴度。分别将构建的质粒和腺病毒转染293细胞,通过荧光显微镜检测表达,观察到GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中FOXP3蛋白的表达。2小鼠FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC及鉴定体外从小鼠骨髓分离、培养、磁珠纯化DC,并采用光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态,流式细胞技术(flow cytometry, FCM)鉴定CD11c、MHCII、CD80、CD86的表达水平,CCK-8法检测混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)。FOXP3基因重组腺病毒转染小鼠骨髓源imDC后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,测定转染效率,分别用RT-PCR和western blot法,检测FOXP3基因转染imDC中FOXP3基因在mRNA及蛋白水平的表达。3 FOXP3基因过表达腺病毒转染对小鼠imDC生物学特性和表型的影响FOXP3基因重组腺病毒转染imDC后,采用扫描电镜和透射电镜观察转染后imDC的形态,FCM鉴定CD11c、MHCII、CD80、CD86的表达水平,用实时荧光定量PCR(RealtimePCR, QPCR)的方法检测了转染后imDC的mRNA基因水平各种细胞因子的表达。用ELISA的方法检测DC.FOXP3的细胞因子的分泌。4 FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC诱导EAE小鼠CD4+T细胞免疫耐受的作用MOG35-55皮下注射小鼠构建EAE模型。病理切片观察小鼠脑部和脊髓的炎症变化。磁珠分离EAE小鼠脾脏CD4+T细胞与DC.FOXP3共培养。通过CD4+T细胞计数及CCK8法检测DC.FOXP3刺激CD4+T细胞增殖的能力。用AnnexinⅤ-7AAD检测DC.FOXP3对CD4+T凋亡的影响。DC.FOXP3组与CD4+CD25-T细胞共培养, FCM检测CD4~+CD25+FOXP3+Treg细胞数量占CD4+细胞数量的百分比。磁珠分选共培养体系中的CD4+T细胞,采用QPCR检测CD4+T细胞中各种细胞因子mRNA的表达。ELISA法检测上清中的细胞因子。应用IDO拮抗剂1-MT后观察CD4+T细胞数量,凋亡细胞数,CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数量的改变,CD4+T细胞中各种细胞因子mRNA的表达和上清中的细胞因子的改变。结果:1小鼠FOXP3基因过表达重组腺病毒载体的构建和鉴定PCR扩增FOXP3基因片段并将其克隆到腺病毒载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG上,测序与Pubmed基因库FOXP3基因序列相符。重组腺病毒的包装、鉴定成功。测定腺病毒滴度为1.25X1011PFU/ml。通过荧光显微镜观察荧光强度高,观察到GFP的表达。Western Blot检测转染的293细胞,可观察到Foxp3-GFP-FLag融合蛋白阳性条带,基本判断FOXP3蛋白表达。2小鼠FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC及鉴定①DC形态学改变:DC在光镜下观察,培养第5天的细胞有少量突起,集落数量增多。符合imDC形态。扫描电镜观察,imDC细胞形态呈圆形和类圆形,细胞表面皱褶多,突起少、短、细。mDC细胞形态多样,表面大量皱褶,有多量树枝状突起,粗细不均,较长。透射电镜观察,imDC细胞形态比较规则,表面突起短少,核多偏向一侧,胞浆内有较多吞饮泡及溶酶体,中等量的线粒体、内质网、核糖体。有的可见失去正常形态的“C”形溶酶体。mDC细胞形态不规则,表面有较长的突起,胞体较大,胞核不规则,胞浆内囊泡状结构、溶酶体减少,细胞器丰富,有多量线粒体,内质网、核糖体、高尔基体。②流式细胞仪检测DC细胞表面分子:磁珠分选imDC和mDC均高表达CD11c,纯度大于90%。imDC上细胞表面分子分别为MHCII(27.2%)、CD80(27.5%)、CD86(29.5%)呈低表达,mDC上分别为MHCII(99%)、CD80(98.8%)、CD86(98.4%)显着高表达。③MLR中DC对同种异基因T细胞的刺激增殖能力:imDC和mDC两组DC刺激T细胞增殖的能力均随DC所占比例增大而增强。相同反应比例imDC刺激T细胞的增殖能力,显着低于mDC,两组间差异均有统计学意义。④倒置荧光显微镜下观察:转染目的基因AD-FOXP3组imDC(DC.FOXP3)和转染空病毒AD-GFP组imDC(DC.GFP)均可见绿色荧光,未转染组imDC(DCN)未见荧光,表明FOXP3基因过表达腺病毒转染成功,转染率大于90%。⑤RT-PCR可检测到DC.FOXP3中FOXP3 mRNA的表达,Western Blot可检测到DC.FOXP3中FOXP3蛋白的表达。而DC.GFP和DCN中不能检测到FOXP3 mRNA和蛋白表达。3 FOXP3基因过表达腺病毒转染对小鼠imDC生物学特性和表型的影响①扫描电镜和透射电镜观察DC.FOXP3和DC.GFP与DCN相比,维持了imDC的未成熟表现。②FCM检测细胞表型:AD-FOXP3转染对imDC表面CD11c、MHC-II、CD80、CD86等分子的表达无影响,仍以未成熟型为主。③QPCR检测结果显示:在mRNA水平上,与DCN和DC.GFP比较,DC.FOXP3上FOXP3明显高表达,而对照组无表达。DC.FOXP3的Th1类细胞因子IFN-γ和Th17类细胞因子IL23、IL17表达明显减低,而Th2类细胞因子IL-10和IDO表达明显增高。④ELISA检测结果显示,与对照组相比,DC.FOXP3培养液上清中Th1类细胞因子: IFN-γ和Th17类细胞因子IL17分泌明显减低,而Th2类细胞因子IL-10分泌增高。4 FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC诱导EAE小鼠脾脏CD4+T细胞免疫耐受的作用①本部分实验成功建立了小鼠EAE模型。光镜下病理切片观察HE染色示EAE组小鼠的大脑、颈、腰段脊髓有大量炎性细胞浸润，血管周围呈袖套样改变，主要分布在脑室周围及脊髓腰膨大区域的白质部分，并伴有脊膜增厚。对照组小鼠大脑和脊髓未见异常。②imDC与EAE小鼠CD4+T细胞共培养，与DCN和DC.GFP比较，DC.FOXP3能抑制EAE小鼠脾脏CD4+T细胞增殖，表现为CD4+T细胞数量减少和CCK-8检测DC.FOXP3刺激CD4+T增殖的能力减低。AnnexinⅤ-7AAD检测结果显示DC.FOXP3促进CD4+T细胞凋亡。③imDC与CD4+CD25-T细胞共培养,FCM检测DC.FOXP3能诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+FOXP3+Treg的转化。④QPCR检测共培养体系中的CD4+T细胞中各种细胞因子的mRNA的表达，结果显示：DC.FOXP3抑制Th1细胞的转录子T-bet及细胞因子IFN-r和Th17细胞的转录子RORγt和细胞因子IL-17及促进IL-17分泌的IL-23的mRNA表达；上调Th2细胞的转录子GATA-3及细胞因子IL-4和Treg细胞的转录子FOXP3及细胞因子CTLA-4的mRNA表达。⑤ELISA检测结果显示：与DCN和DC.GFP比较，DC.FOXP3与CD4+T细胞共培养上清中IFN-γ、IL-17含量减低，IL-4、IL10含量增高。⑥DC.FOXP3与CD4+T细胞共培养体系中添加IDO拮抗剂1-MT后CD4+T细胞数量增加，凋亡细胞数减少，对CD4+CD25-T细胞极化作用减弱，Th1、Th17细胞的转录子及细胞因子mRNA水平增高，Th2、Treg细胞的转录子及细胞因子mRNA水平减低。ELISA法检测共培养液中分泌的细胞因子水平，IFN-γ、IL-17增高、IL-4、IL10减低。结论：1成功构建FOXP3基因过表达重组腺病毒载体。2成功培养、诱导、扩增大量DC，并鉴定了imDC和mDC的生物学特性和细胞表型。成功构建FOXP3基因高表达imDC细胞模型。3 AD-FOXP3转染后的imDC细胞表型无改变，下调自身Th1、Th17类炎性因子和上调Th2类抑制炎症因子的表达和分泌。并且细胞高表达IDO，从而增强了imDC的耐受原性。4 AD-FOXP3转染imDC可以在体外抑制EAE小鼠脾脏CD4+T细胞增殖、促进CD4+T细胞的凋亡、诱导Treg产生、抑制Th1和Th17功能,增强Th2和Treg功能,逆转了Th1/Th2和Th17/Treg细胞失衡。用IDO拮抗剂1-MT后EAE小鼠脾脏CD4+T细胞功能恢复,说明了DC.FOXP3可能通过激活IDO的功能促进免疫耐受。
阎晓波, 凌云阳, 孟若娟, 包忠蕾[4]2010年在《树突状细胞在多发性硬化免疫机制和治疗中作用的研究》文中指出目的研究树突状细胞(dendritic cell,DCs)在多发性硬化(multiple sclerosis,MS)免疫机制及治疗中的作用。方法建立实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)E组、对照(C)组和耐受组模型,采用混和淋巴细胞反应(MLR)检测各组脾脏DC培养上清液刺激淋巴细胞增殖的能力,采用ELISA双夹心法测量各组脾脏DC培养液中细胞因子水平。结果叁组脾DC刺激淋巴细胞增殖能力的差异具有统计学意义,EAE组最强、EAE耐受组最弱(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。叁组模型脾脏DC培养上清液的TNF-α、IL-10及IL-12水平每两组间进行比较,除了EAE组和对照组及EAE与耐受组之间比较IL-10水平没有统计学差异外(P>0.05),余均有统计学差异(分别为P<0.01,P<0.05)。结论DC具有功能异质性和功能可调性,DC调控免疫反应类型与其调节淋巴细胞的增殖和其分泌细胞因子水平有密切关系,可能在MS免疫机制及治疗中起重要作用。
李华[5]2002年在《MBP对PBMC产生IFN-γ、NO和CD11c表达的影响》文中进行了进一步梳理中枢神经系统(central nervous system，CNS)脱髓鞘性疾病是神经系统常见病，其病因和发病机制迄今尚未完全清楚。目前认为它是由特异性抗原介导的 CNS 的自身免疫性疾病，其发病可能与病毒感染有关。其发病机理推测与其他自身免疫性疾病相似，是自身抗原、非特异性T细胞活化和T细胞介导的炎症反应共同参与了脱髓鞘疾病的发病过程。髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein ，MBP)既是神经髓鞘的重要成份，又是CNS脱髓鞘疾病的重要抗原。用MBP免疫动物诱发的实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergicencephalomyelitis，EAE)是T细胞介导的CNS 自身免疫性疾病，在临床表现、免疫病理和免疫化学方面与人类CNS 脱髓鞘疾病有很多相似之处，因而是研究CNS 脱髓鞘病的经典动物模型。用 EAE 易感动物的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear，PBMC)和树突状细胞(dendritic cell，DC)等在离体条件下与MBP共培养，可用于探索和研究它们在EAE中的作用。DC作为机体内功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC) ，目前已知其具有启动免疫应答和免疫耐受双重作用，参与机体免疫反应的调节，其在自身免疫性疾病发病中的作用已受到人们的重视。近年来的研究发现，DC具有致病性和促恢复性的双重作用，通过体外培养 MBP对 PBMC、DC产生 IFN－Y、NO和 CDll。的表达影响环境的调控可以改变DC 的功能或使其定向分化。因为DC 的免疫功能具有多样性和易变性，所以有可能成为治疗自身免疫病的突破口。但DC在CNS脱髓鞘疾病中的作用，国内外在此领域的研究起步较晚，关于DC在EAE发病中的作用国内尚未见报道。 本实验采用体外细胞培养的方法，分离EAE 易感性BALB／C小鼠PBMC 和DC，在体外与MBP 共培养。观察经MBP 活化的PBMC 分泌IFN—Y以及NO 的含量变化，以证实T 细胞非特异性活化的参与机制在CNS 脱髓鞘性疾病发病中的作用。通过检测经 ＼1 P 活化的 P B ＼IC 和 D C 中 D CI 的标志性抗原 C DllC 的表达，以观察C＼S 脱髓鞘性疾病过程中DC 前体细胞向DCI 分化变化。为设法使DC 前体细胞定向分化或者改变其功能，促进CNS脱髓鞘性疾病的恢复，或减少复发提供实验资料。 本研究的主要结果如下：①经 MBP 刺激的 BALB／C ／J’鼠PBMC 分泌IF＼－b，的含量明显增加，实验组为43．83士6．06pg／ml，对照组为ZS．52土2．18pg／。1，二者具有极显着性差异（P＜0．01）。②i4 MBP 刺激后的 BALB／C ’］＼鼠 PBMC 分泌＼0 的含量明显增加，实验组为 180．76土20．75 11 mol／L，对照组为 9 5．61土 13．0 9 u mo／L，h者具有极显着性差异（P＜0．of）。③经 MBP 刺激的 BALB；／C ／J’鼠 PBMC CDllC 的表达明显增强，实验组CDllC 平均荧光强为 15．16士1．92 D，对照组为 8．76 士 1．70 D，二者具有极显着性差异 卜＜0．01）。④＠ MBP刺激的 BALB／C 小鼠 DC CDllC 的表达明显增强，实验组平均荧光强度为 17．41．62 D，对照组为9．13士0．66 D，二者具有极显着性差异（尸＜0．01）。⑤去除DC 的 BALB／C 小鼠脾单个核细胞，MBP 刺激后其 CDI IC 的表达无明显增强，实验组平均荧光强度为 S．86士 1．SS D，对照组为8．69上L．12 D，二者无显着性差异（尸＞O．05）。 MBP对PBMC、DC产生IFN．Y、NO和CDllc的表达影响 本实验提示：①被诱导抗原MBP激活的EAE易感性BALB／C小鼠 PBMC 分泌 IF＼－Y 和 NO增加。②EAE易感性BALB／C 小鼠DC 前体细胞与MBP共培养可以促进其向DCI 亚型分化。
闫晓波, 王爽, 凌云阳, 俞春江, 孟若娟[6]2011年在《DCs在EAE鼠免疫耐受的症状及分泌细胞因子的变化》文中进行了进一步梳理目的研究树突状细胞(dendritic cells,DCs)在实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)免疫耐受对细胞因子的影响。方法建立EAE组及耐受组模型,评价EAE模型及耐受鼠发病情况。采用ELISA双夹心法测量各组脾脏DCs培养液中细胞因子水平。结果 EAE模型组全部发病,平均12～14天达高峰。EAE组脾脏DCs培养上清液的TNF-αI、CAM-1较耐受组明显增高,差异有显着意义(P<0.01,P<0.01);而IL-10水平耐受组较EAE组显着增高,组间比较有统计学差异(P<0.05)。结论 DCs调控免疫反应并影响细胞因子分泌水平,可能在MS免疫耐受机制中起重要作用。
王强[7]2006年在《携带供者抗原的第叁方树突状细胞诱导小鼠皮肤移植耐受的研究》文中提出研究背景及研究目的随着烧伤治疗基础理论和临床实践的发展,人们发现在帮助大面积深度烧伤患者平稳度过休克和克服早期脏器功能损害后,一个新的矛盾凸现出来,即患者自体皮源严重不足与待手术植皮创面过大,大面积的裸露创面不仅增加了体液和营养的丢失,而且成为烧伤后细菌感染的主要来源,是引起病人迅速衰竭乃至死亡的重要原因。因此,如何解决创面覆盖这一难题已成为大面积深度烧伤治疗的“瓶颈”。近年来器官移植领域内取得的一些重大进展显示,同种异体皮肤移植也许是一个充满希望的思路,但是移植后的排斥反应使异体皮仅局限于作为生物敷料使用,而不能成为创面永久的覆盖物。虽然免疫抑制剂的应用可以有效地阻断宿主免疫系统对移植皮片的攻击,但对于严重烧伤病人而言,长期大剂量地使用免疫抑制剂是需要慎重考虑的,因为虽然它可以延长异体皮片的存活时间,但同时也极大地削弱了患者的免疫防御功能,增加了患者发生难以控制的严重感染的几率。于是,探寻建立抗原(Antigen, Ag)特异性免疫耐受的方法,即仅对移植抗原产生耐受,而保留和不干预机体的其他免疫功能,成为众多学者孜孜以求的目标。在啮齿类动物皮肤移植的研究中,人们发现联合移植来自同一供者的皮肤和未成熟树突状细胞(Dendritic cell, DC)能成功诱导针对供者抗原的耐受。供者源的未成熟DC由于其自身携带有供者抗原,而又缺乏协同刺激分子,这样当它与受者体内能特异性识别供者抗原的T淋巴细胞结合后,不仅不能激活该T淋巴细胞,反而诱导其不应答或无能,从而建立抗原特异性免疫耐受。正是基于上述特点,使应用未成熟或基因工程修饰DC诱导免疫耐受成为当前研究的热点,并在肾、肝、心脏、胰腺和小肠等器官移植中取得了令人满意的效果。但是在临床工作中,我们所使用的未成熟DC主要来自健康志愿者,异体皮主要来自死后捐赠者,也就是说由于活体献皮的困难,病人往往接受的是来自并非同一供者的皮肤和未成熟DC,即第叁方(Third-Party Type)模式,而第叁方的未成熟DC由于其表面并不携带皮肤供者抗原,它进入受者体内后,要发挥诱导耐受的作用首先必须
顾春瑜[8]2005年在《未成熟树突状细胞的体外培养及生物免疫学功能研究》文中进行了进一步梳理目的: 建立一种简便实用的体外培养未成熟树突状细胞的方法,并鉴定和研究其形态、表型以及生物免疫学功能。观察不同成熟状态的树突状细胞对T淋巴细胞功能的影响,探讨未成熟树突状细胞在诱导机体产生免疫耐受中的作用,为树突状细胞在降低移植免疫排斥反应和治疗某些自身免疫性疾病的临床应用提供一些理论和实验依据。 方法:1.小鼠骨髓源树突状细胞的培养:取小鼠的骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞,利用细胞因子rmGM-CSF和IL-4联合刺激,手法筛选树突状细胞集落,培养6天后收集疏松贴壁细胞,即为小鼠骨髓来源的树突状细胞。将培养的树突状细胞分成两组,一组在培养结束前18h加入LPS刺激其成熟(以下称成熟DC组);一组不加入LPS刺激,使其保留未成熟树突状从不特性(以下称未成熟DC组)。 2.树突状细胞的形态学观察:在光镜、电镜下观察两组细胞的形态,比较成熟组树突状细胞与未成熟组树突状细胞形态学上的差别。 3.树突状细胞的表型测定:利用流式细胞术检测两组细胞表面标志,检测小鼠树突状细胞的特异性标志CD11c评估树突状细胞纯度;检测MHC-Ⅱ类分子以及共刺激分子(CD40,CD86等)评价树突状细胞成熟度。 4.树突状细胞分泌IL-12的水平测定:收集两组树突状细胞培养上清,用ELISA法检测上清中IL-12的表达水平,了解树突状细胞分泌IL-12的水平与其成
包杰[9]2007年在《RNA干扰RelB慢病毒载体的构建及其诱导骨髓致耐受树突状细胞的实验研究》文中指出研究背景和目的：胸腺抗原特异性T细胞耐受的诱导和在外周的维持是预防自身免疫病的关键。树突状细胞(Dendritic cells，DCs)作为一种专职的抗原提呈细胞，除了刺激作用外，许多证据表明其在维持和调节T细胞外周免疫耐受方面也具有重要作用。这种控制功能是由某种成熟阶段和不同来源亚型来决定，并受到某种免疫调节剂的影响。DC诱导T细胞耐受或T细胞活化取决于DC的成熟状态。在缺乏病原入侵或无炎症的稳定状态下，DC是以不成熟的形式存在。未成熟DC倾向于诱导免疫耐受的产生，成熟DC则倾向于诱导免疫应答。骨髓来源的DC倾向于诱导免疫应答，淋巴来源的DC则倾向于诱导免疫耐受的产生。近年来人们利用未成熟状态的DC具有诱导免疫耐受的能力，采用基因修饰、抗体技术、反义寡核苷酸技术以及体外培养等方法维持DC的未成熟状态，制备致耐受DC，在实体器官移植和自身免疫病的防治中起到了举足轻重的作用。IL-4基因修饰小鼠骨髓DC可显着减少小鼠的胶原诱导性关节炎发病。IL-10基因修饰的骨髓DC可显着延长同种心脏移植物的存活。用RNAi技术干扰DC的IL-12水平，可产生具有致T细胞免疫耐受的DC，即致耐受DC。尽管DC在免疫介导的疾病中起重要作用，但机体内DC的含量甚微，在外周血单个核细胞中不到1％，为痕量细胞群体。20世纪90年代DC体外大规模扩增技术的发展为DC的研究带来了前所未有的机遇。在低剂量的GM-CSF和IL-4的联合作用下可诱导骨髓前体细胞产生大量的DC。在DC体外大规模扩增技术的基础上，采用最近发展的RNAi技术(RNA interference，RNAi)针对影响DC发育成熟的关键基因NF-κB／RelB进行干预，筛选出干扰效率最高的shRNA，包装成慢病毒，感染骨髓DC(Bone marrow derived DC，BM-DC)，获得RNAi RelB DC，并对RelB基因沉默的BM-DC进行形态学、表型和免疫功能的鉴定，以期构建出RelB基因沉默的新型致耐受DC，即RNAi RelB DC，研究其在T细胞免疫耐受诱导中的可能机制，为成功应用这种新型DC治疗移植排斥反应及自身免疫病提供一定的理论依据。方法：1、小鼠骨髓DC的体外培养和鉴定：无菌分离C57BL／6小鼠骨髓前体细胞，在低剂量的重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)作用下，经轻柔手法筛选并结合CD11c+免疫磁珠分选方法，培养扩增骨髓来源DC(BM-DC)，并利用脂多糖(LPS)于细胞培养结束前24h刺激诱导DC成熟。实验分两组：①对照组DC(Control-DC)：经手法筛选后免疫磁珠分选体外培养第6天的DC，即未成熟DC；②脂多糖刺激DC组(LPS-DC)：在培养结束前24h终浓度为1μg／mL的LPS刺激DC，即成熟DC组。并在细胞形态、细胞表面分子表达和同种混合淋巴细胞反应(allogenic mixed lymphic reaction)免疫功能以及RelB基因表达水平等方面进行检测和鉴定。2、RNA干扰RelB基因慢病毒载体的构建与鉴定：根据不同成熟状态的骨髓DC表达RelB基因水平的不同，我们利用https://maidesigner.invitrogen.com/maiexpress/在线软件设计2个位点的RelB干扰序列。采用U6慢病毒表达载体系统构建目标基因RelB的慢病毒shRNA表达载体，经测序验证，在293FT细胞中包装病毒粒子，病毒包括3种，目标基因RelB的R2和R5以及阴性对照T6。分别对这3个病毒粒子进行滴度测定。采用体外培养第4天的骨髓来源的未成熟DC进行感染，利用RT-PCR和免疫荧光染色方法进行各感染组的RelB表达水平检测。同时设置未成熟DC对照组。3、骨髓致耐受树突状细胞的诱导及免疫功能研究：在有效沉默BM-DC表达RelB的基础上，进一步探讨RelB沉默的BM-DC的生物免疫学功能。实验设4组：①未成熟DC对照组；②LPS刺激成熟DC对照组；③RelB沉默的BM-DC组；④LPS刺激RelB沉默的BM-DC组。分别对这4组DC的形态、表面分子表达和细胞免疫功能(IL-12分泌水平、Th1／Th2细胞因子分泌、混合淋巴细胞反应等)方面探讨RelB沉默的BM-DC的生物免疫学功能。结果：1、在低剂量的rmGM-CSF和rm-IL-4的诱导下，成功地诱导出大量的骨髓DC，每2只小鼠获得BM-DC约1～2×10~7，基本上可满足实验需要。手法筛选的BM-DC的CD11c阳性细胞达70％，结合免疫磁珠分选后CD11c阳性细胞的可获得90％以上纯度的BM-DC。经流式细胞术鉴定，对照组DC(Control DC)低水平表达MHC-Ⅱ类分子、CD86和CD40，符合未成熟DC的特点，视为未成熟DC组；脂多糖刺激DC组(LPS-DC)高水平表达MHC-Ⅱ类分子、CD86和CD40，符合成熟DC的特点，视为成熟DC组。对上述2组的细胞形态学观察也显示Control DC细胞形态多为圆形，表面多褶皱，突起较少，细胞器较少，但细胞内含有较多的吞饮泡样结构；而LPS-DC细胞内囊泡样结构较少，细胞内线粒体和粗面内质网等细胞器丰富，细胞质回缩，突起明显。对DC分泌IL-12的水平的ELISA结果显示，Control DC的IL-12分泌水平显着低于LPS-DC(P＜0.01)。刺激同种异基因T细胞增殖(MLR)(P＜0.01)以及RelB基因表达水平的研究也得到了类似的结果。2、设计合成2个位点的RelB基因(NM 009046)，行95℃退火处理，经4％琼脂糖凝胶电泳检测得到了退火产物dsOligo，将该产物与pENTR~(TM)／U6连接，转化TOP10感受态细胞，卡那霉素抗性(50μg／mL)平板筛选阳性克隆，U6前引物(5'-GGACTATCATATGCTTACCG-3')测序结果显示获得了阳性克隆。将目标基因阳性克隆质粒与慢病毒载体进行重组，转化Stb13感受态细胞，氨苄青霉素(Amp)抗性筛选后，进行30μg／mL氯霉素的LB平板中的药物负筛选，U6前引物测序再次表明2个位点的重组子均为阳性重组子。将阳性重组子与ViraPower~(TM)包装质粒混合物在质脂体Lipofectamine~(TM) 2000的介导下，在293FT细胞中包装病毒，收获含病毒的上清液，-80℃保存。利用系列稀释法(10~(-2)～10~(-6))测定慢病毒贮液滴度，进行杀稻瘟菌素(浓度为10μg／mL)的药物筛选，感染的细胞形成肉眼可见的克隆，在显微镜下计数克隆数，测定病毒的滴度为6×10~5TU／mL(Transducing Unit(TU)／mL)。将2个位点的慢病毒和1个阴性对照对骨髓未成熟DC进行RNAi实验。流式表型分析各实验组DC表面分子表达水平，显示R5位点表面CD40分子表达最低，RT-PCR显示其中R5位点RelB基因表达较低；细胞免疫荧光分析结果也显示R5位点RelB蛋白表达水平也较低，也即R5位点干扰效果最好。3、用R5位点慢病毒感染未成熟BM-DC，发现细胞形态为圆形或椭圆性，细胞内有大量囊泡结构，部分囊泡可见吞噬的异物，细胞核多偏向一侧，溶酶体和线粒体等细胞器少，表面突起少，形态较规则。细胞表达MHC-Ⅱ类分子、CD40、CD86等表面分子较低，MLR显示较弱的刺激T细胞增殖能力。IL-12的ELISA结果显示细胞低水平分泌IL-12，MLR反应中诱导Th0向Th2细胞偏倚，IL-2和IFN-γ分泌抑制，IL-10和IL-4分泌相对占优势。结论：1、在低剂量的rmGM-CSF和nnIL-4诱导下，从小鼠骨髓前体细胞中可扩增得到大量的BM-DC。经小鼠CD11c~+免疫磁珠阳性分选，可获得纯度高达90％以上的高纯度BM-DC。对成熟BM-DC和未成熟BM-DC进行免疫学功能及RelB基因表达水平的比较显示未成熟BM-DC倾向于诱导免疫耐受且低水平表达RelB基因，而成熟BM-DC倾向于诱导免疫应答且高水平表达RelB基因，RelB基因表达水平与DC的成熟状态有关。2、成功地构建了小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体，克隆出R2和R5两个位点的干扰载体，并进行慢病毒的包装和滴度测定。3、成功地获得了RNAi RelB DC，发现用R5位点的慢病毒感染未成熟DC，其干扰效果最好，且用该位点的慢病毒感染的DC其细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫学功能等均具有与未成熟DC相似的特点，且这种DC不能被LPS刺激成熟，具有致耐受DC特性，有望进一步应用于移植排斥反应及自身免疫性疾病的防治。主要创新点：1、首次利用慢病毒载体的方法对DC进行RelB基因的RNAi实验，并探讨其应用于自身免疫性疾病生物治疗的可行性，目前国内外尚未见类似报道。2、利用RNAi技术沉默BM-DC的RelB基因，获得了一个新的RelB基因沉默的有效位点，为RNAi数据库提供了新的有效作用位点。3、体外构建了RelB沉默的BM-DC，该DC表现为未成熟DC的形态和功能特点，是一种新型的致耐受DC。可能成为器官移植和自身免疫性疾病的生物制剂，为进一步应用RelB沉默的BM-DC的体内试验研究进行了有益的探索。
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[8]. 未成熟树突状细胞的体外培养及生物免疫学功能研究[D]. 顾春瑜. 第一军医大学. 2005
[9]. RNA干扰RelB慢病毒载体的构建及其诱导骨髓致耐受树突状细胞的实验研究[D]. 包杰. 南方医科大学. 2007
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