（四川省医学科学院?四川省人民医院肝胆胰外 四川 成都 610072）
【摘要】目的：分析聚肌胞苷酸（Poly I:C）对氧糖剥夺损伤（oxygen-glucose deprivation，OGD）星形胶质细胞TLR3信号转导通路的影响。方法：对星形胶质细胞进行缺血缺糖培养12h建立氧糖剥夺损伤模型，观察组不同浓度Poly I：C预孵育对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞Toll受体3（TLR3）、磷酸化干扰素调节因子（pIRF3）、磷酸化核因子（pNF-KB）蛋白表达的影响。结果：OGD组和Poly I: C+OGD组TLR3、pNF-KB表达水平均高于对照组（P<0.05），pIRF3与对照组对比无差异性（P>0.05）。Poly I: C+OGD组与OGD组对比，pIRF3蛋白表达水平增加（P<0.05），pNF-KB表达水平降低（P<0.05），TLR3表达无差异性（P>0.05）。结论：Poly I：C通过促进氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pIRF蛋白的表达，进而上调下游抗炎因子干扰素-β的表到相关。
【关键词】聚肌胞苷酸；氧糖剥夺损伤；星形胶质细胞；TLR3信号通路；影响
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）36-0031-03
Effect of polyinosinic acid on TLR3 signaling pathway in astrocytes damaged by oxygen-glucose deprivation
Gong Jun,Lu Xiangyu, Xiong Wei, Xu Jian, Zhang Hao, Yu Xiaojiong
Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu, Sichuan 610072,China
【Abstract】Objective To analyze the effect of poly-inosinic acid (Poly I: C) on oxygen-glucose deprivation (OGD) astrocyte TLR3 signal transduction pathway. Methods The astrocyte was cultured for 12 hours after ischemia and glucose-deficient culture. The oxygen glucose deprivation injury model was established. The concentration of Poly I:C pre-incubation on oxygen glucose deprivation damage astrocyte Toll receptor 3 (TLR3), phosphoric acid The effects of interferon regulatory factor (pIRF3) and phosphorylated nuclear factor (pNF-KB) protein expression. Results The expression levels of TLR3 and pNF-KB in OGD group and Poly I: C+OGD group were higher than those in control group (P<0.05). There was no difference between pIRF3 and control group (P>0.05). Poly I: Compared with OGD group, the expression of pIRF3 protein was increased (P<0.05), pNF-KB expression level was decreased (P<0.05), and TLR3 expression was not different (P>0.05). Conclusion Poly I:C can up-regulate the expression of pIRF protein in astrocytes by promoting oxygen glucose deprivation, and then up-regulate the expression of downstream anti-inflammatory factor interferon-β.
【Key words】Cytidine; Oxygen and sugar deprivation injury; Astrocytes; TLR3 signaling pathway; Impact
聚肌胞苷酸（polyinosinic polycytidylic acid，Poly I：C）为Toll样受体3（TLR3）的特异性配体，且TLR3对TRIF依赖性信号通路专一介导。大量研究发现[1-4]，TLR3的特异性激动剂Poly I：C在体内外对缺血缺氧的神经细胞均有保护作用。研究发现[5-8]，Poly I：C对脑缺血损伤小鼠的神经细胞具有保护作用，并且可增加脑缺血小鼠及体外氧糖剥夺损伤处理的星形胶质细胞TLR3-TRIF信号通路下游IFN-3的表达起到抑制炎症反应的作用。但现阶段尚未明确其具体作用机制，因此本研究采用Western blot检测氧糖剥夺损伤星形胶质细胞模型TLR3信号通路中的相关蛋白质表达的变化，进一步探讨Poly I：C对神经细胞的保护作用机制。
1.材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
SD乳鼠，购自于凯学生物科技（上海）有限公司。Poly I：C（购自于上海玉博生物科技有限公司），TRIF、TLR3一抗（购自于上海研盟生物工程有限公司），pIRF3、NF-KB一抗（购自于上海沪震实业有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 于超净工作台取出生1d SD大鼠大脑皮质组织，在DMEM/F12青霉素小瓶中剪成1mm3的组织块，加入等体积的0.25%胰蛋白酶37℃消化5min，后加入含20%胎牛血清的完全培养液终止消化。液体采用200目滤网过滤，离心去上清，沉淀细胞接种于完全培养液中，在传代6次后即可使用。
1.2.2 实验分组和模型建立 分为对照组、氧糖剥夺组（OGD）、Poly I：C（10、20ug/ml）、预适应组（Poly I：C+OGD）。取第6代细胞按照分组分别采用DMEM或Poly I：C与DMEM孵育24h，对照组使用有糖培养基培养，其余各组采用无糖培养基培养。培养12h后进行指标检测。
1.2.3 Western blot检测TLR3、pIRF3、pNF-KB表达 在各组细胞中加入80ul的含有蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂的低温蛋白裂解液，4℃处理0.5h，12000r/min离心15min，取上清。配置含蛋白50ug电泳样品，制备厚度为1.0mm的5%聚丙烯酰胺凝胶（pH=6.8），8%分离胶（pH=8.8）。浓缩胶80V电泳0.5h，分离胶103V电泳至溴酚蓝燃料前沿至凝胶末端处。取出后4℃、横流电流250mA转膜2～3h，常温封闭90min，随后加入一抗，4℃过夜孵育，采用TBST洗膜后加入二抗常温孵育90min。加入ECL reagent显色液，暗室下胶片曝光、扫描后采用软件定量分析。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（x-±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞TLR3蛋白表达影响
与对照组对比，OGD组和Poly I：C+OGD组星形胶质细胞TLR3表达水平增加（P＜0.01）；OGD组、Poly I：C+OGD各组之间互相对比星形胶质细胞TLR3表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），结果见图1。
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图2 Western blot检测Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pIRF3蛋白表达影响
注：与空白对照组对比，#P＜0.05；与OGD组对比，*P＜0.05
2.3 Poly I：C对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pNF-KB蛋白表达影响
OGD组和Poly I：C+OGD组星形胶质细胞pIRF3表达水平均高于对照组（P＜0.05），OGD组、Poly I：C+OGD各组之间互相对比星形胶质细胞TLR3表达水平无差异性（P＞0.05）。结果见图3。
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图3 Western blot检测Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pNF-KB蛋白表达影响
注：与空白对照组对比，#P＜0.05，##P＜0.01
3.讨论
大量研究证实，TLR3特异性受体激动剂Ploy I：C在缺血缺氧条件下对神经细胞存在保护作用。如Packard等[9]在小鼠闹缺血前给予Ploy I：C可有效缓解对神经细胞的损伤。宋璞等给予皮层神经元细胞Ploy I：C处理，结果表明Ploy I：C可有效缓解缺糖缺氧导致的原代神经细胞损伤。Borysiewicz等[10]采用H2O2处理建立缺糖缺氧星形胶质细胞缺氧模型，结果表明Ploy I：C可有效缓解H2O2导致的神经细胞损伤。
本研究结果表明，OGD组和Poly I：C+OGD组TLR3、pNF-KB表达水平均高于对照组（P＜0.05），pIRF3与对照组对比差异无统计学意义（P＞0.05）。Poly I：C+OGD组与OGD组对比，pIRF3蛋白表达水平增加（P＜0.05），pNF-KB表达水平降低（P＜0.05），TLR3表达无差异性（P＞0.05）。
综上所述，Poly I：C通过促进氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pIRF蛋白的表达，进而上调下游抗炎因子干扰素-β的表达相关。
【参考文献】
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论文作者:龚军,路翔宇,熊伟,许建,张浩,俞小炯
论文发表刊物:《医药前沿》2019年36期
论文发表时间:2020/2/24
标签：星形论文; 胶质论文; 细胞论文; 损伤论文; 蛋白论文; 神经细胞论文; 对照组论文; 《医药前沿》2019年36期论文;