（1.长沙市中心医院急诊科；2.中南大学硕士研究生导师）
摘要：目的 分析探讨大剂量维生素C对人胶质瘤SHG44细胞的影响作用。方法 培养人胶质瘤SHG44细胞，将不同浓度维生素C作用于处于对数生长期的SHG44细胞，以顺铂（20mg/L）作为对照组，采用MTT法检测细胞的生长抑制率；用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；用RT-PCR法检测SHG44细胞中HIF-1α和VEGFmRNA的表达。结果 维生素C呈浓度依赖性抑制SHG44细胞生长；当维生素C浓度＞1.25mmol/L，作用SHG44细胞48h细胞出现明显的增殖抑制和大量死亡；顺铂组和维生素C组细胞早期凋亡较空白对照组显著增加（P<0.05）。维生素C组和顺铂组S期SHG44细胞较空白对照组减少（P<0.05）。与空白对照组比较比，维生素C组和顺铂组SHG44细胞中HIF-1αmRNA的表达增高，VEGF mRNA表达下降（P<0.05）；维生素C组和顺铂组之间VEGFmRNA表达差异无统计学意义 （P>0.05）。结论 维生素C能抑制人胶质瘤SHG44细胞的增殖，促进细胞的凋亡。维生素C的作用机制可能跟降低细胞中VEGF mRNA的表达，抑制组织细胞的血管生成有关。
关键词：维生素C；胶质瘤；SHG44细胞
本研究通过培养人胶质瘤SHG44细胞，给予不同浓度维生素C处理SHG44细胞，以顺铂处理作为阳性对照组，观察维生素C对SHG44细胞增殖、凋亡的影响，以及对细胞中HIF-1α和VEGFmRNA表达水平的影响。探讨维生素C对SHG44细胞的可能作用机制。
1资料与方法
1.1仪器与试剂
实验细胞为人胶质瘤SHG44细胞（来源于中国科学院上海细胞库）；主要试剂：胰蛋白酶，DMEM培养基，PRMI-1640培养基，AnnexinV-FITC-PI双染试剂盒，MTT，DMSO，顺铂，维生素C，小牛血清，胎牛血清，逆转录试剂盒，miR逆转试剂盒。主要仪器：精密分析天平、分光光度计、荧光定量PCR仪、流式细胞仪、CO2细胞培养箱、CORNING 96孔细胞培养板、酶标仪等等。
1.2方法
1.2.1细胞培养
将人胶质瘤SHG44细胞株在含10%小牛血清的PRMI-1640培养基培养瓶中进行培养，每天进行换液与清洗；置于37℃，含5%CO2的恒温箱中进行培养，培养后进行传代，每3~4天进行一次传代，使用细胞计数板计数（重复3次操作）。细胞长满培养瓶后，移除培养基，并清洗除去血清，离心后使用完全培养基进行重悬[1]。完成后继续进行冻存、复苏。
1.2.2MTT比色实验、生长抑制率检测、细胞周期和凋亡检测
①将不同浓度维生素C（0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0mmol/L）作用于处于对数生长期的SHG44细胞，采用MTT比色法检测细胞的IC50值；②将不同浓度维生素C（0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mmol/L）和顺铂（20mg/L，阳性对照）作用于处于对数生长期的SHG44细胞，采用MTT法检测细胞生长抑制率[2]；③将维生素C（0、1.5 mmol/L）和顺铂（20mg/L）作用于处于对数生长期的SHG44细胞24小时，采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，RT-PCR法检测细胞中HIF-1α和VEGFmRNA的相对表达[3]。空白对照组：采用不含有维生素C与顺铂的常规培养基进行处理。
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1.3统计分析
采用SPSS19.0对数据进行统计分析，其中计数资料采用%表示，行卡方检验；计量数据采用（）表示，行t检验；当P＜0.05时，表示组间差异具有统计学意义。
2结果
2.1维生素C对人胶质瘤SHG44细胞毒副作用
空白对照组培养24h后，细胞大量增值，增值率为39.3±5.3%；维生素C呈浓度依赖性抑制SHG44细胞生长，在570nm波长，作用24小时后，维生素C浓度在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0mmol/L下的抑制率分别为5.2±0.5%、20.3±1.2%、83.3±4.2%、90.2±2.6%、92.1±2.2%、94.9±1.6%。与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着维生素浓度的增高，SHG44细胞抑制率呈增加的趋势，但二者无直线线性关系，在作用24h后，维生素C对肿瘤半数细胞抑制浓度IC50值为1.695mmol/L，顺铂组作用细胞24h后，抑制率达到89.9±2.8%，对比维生素C组与顺铂组，当维生素C浓度在2.0mmol/L以上时，细胞抑制率并无显著差异（P＞0.05）。
2.2维生素从对人胶质瘤SHG44细胞增殖的影响
对0、1.0、2.0mmol/L维生素对SHG44细胞24h、48h、72h作用发现，随着浓度的增高，作用时间的延长，抑制率增强，与空白对照组比较维生素C组24h、48h、72h的MTT值显著更小（P＜0.05）；与顺铂组比较，维生素C组起效较慢，而当维生素C的浓度大于1.25mmol/L，并作用SHG44细胞48小时后细胞出现明显的增殖抑制并大量死亡，效果与顺铂组表现基本一致；
2.3各组SHG44细胞凋亡情况
作用24h，空白组细胞早期凋亡率2.5±0.2%，晚期凋亡率1.5±0.3%；顺铂组早期凋亡率9.6±0.2%，晚期凋亡率9.0±0.3%；维生素C组（1.5mmol/L）早期凋亡率8.7±0.2%，晚期凋亡率0.3±0.1%；顺铂和维生素C对细胞的处理都使得细胞的早期凋亡较空白对照组显著增加（P<0.05）。
2.4各组细胞周期分布
经流式细胞仪检测，24h后空白对照组细胞周期相对分布：G1/G0期占53.8±1.3%，S期占20.8±1.5%，G2/M期占23.8±2.0%；顺铂组：G1/G0期占78.8±2.0%，S期占10.6±1.0%，G2/M期占9.6±1.1%；维生素C组（1.5mmol/L）：G1/G0期占57.8±2.0%，S期占16.7±1.1%，G2/M期占25.8±1.2%；维生素C和顺铂的处理都使得S期的SHG44细胞较空白对照组减少（P<0.05）。
2.6 HIF-1αmRNA、VEGF mRNA的表达
与空白对照组相比，常氧条件下，维生素C和顺铂的处理都能升高SHG44细胞中HIF-1αmRNA的表达，和降低VEGF mRNA的表达（P<0.05）；维生素C组和顺铂组之间VEGFmRNA的表达其差异无统计学意义 （P>0.05）。
3讨论
胶质瘤也被称为神经胶质瘤，是一种颅内中枢神经最常见的肿瘤，起源于神经间质，占到人类脑肿瘤40%以上，具有广泛的侵袭性[4]。维生素C是一种水溶性己糖衍生物，生物学功能多样且临床应用无明显毒副作用，相关临床研究发现对肝癌、膀胱癌、白血病等多种恶性肿瘤患者给予大剂量维生素C可对肿瘤生长起到明显的抑制作用[5]。
为探讨大剂量维生素C对胶质瘤SHG44细胞的影响及作用机制，本次研究给予不同浓度维生素C处理SHG44细胞，结果显示大剂量维生素C可在常氧环境下有效抑制SHG44细胞的增值，加速细胞凋亡，减少细胞S期DNA合成。尽管大剂量维生素C可对细胞HIF-1αmRNA表达进行上调，但VEGF mRNA的表达下降。
参考文献
[1]张苳，刘阳，杨福兵.缺氧诱导因子在胶质瘤中的表达与意义[J].中华神经外科疾病研究杂志，2010，9（4）：325-327.
[2]胡伟鑫，陈春美，石松生，等.诱导型一氧化氮合酶及缺氧诱导因子-1α在人脑胶质瘤的表达意义与肿瘤血管生成关系的研究[J].中国实用神经疾病杂志，2011，14（2）：9-12.
[3]吴洁玲，韩璐，杨丽肖.雷帕霉素联合顺铂对宫颈癌Hela细胞生长和对HIF-1α与VEGF表达影响的观察[[J].中华肿瘤防治杂志，2013，20（14）：1075-1078.
[4]赵文钱，刘璐，李光宇.缺氧诱导因子家族与胶质瘤的研究进展[J].解剖科学进展，2013，（4）：370-373.
[5]曾冉，况建国.胶质瘤发病机制的研究进展[J].广东医学，2013，34（6）：973-976.
论文作者:刘祚仁1,郭塨2（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2017年第8期
论文发表时间:2017/6/21
标签：细胞论文; 维生素论文; 和顺论文; 浓度论文; 抑制论文; 凋亡论文; 胶质瘤论文; 《航空军医》2017年第8期论文;