朱军莉[1]2004年在《阴沟肠杆菌B8拮抗相关基因簇的克隆及功能验证》文中研究说明阴沟肠杆菌B8是从水稻叶面分离获得的一株广谱拮抗菌，最初分离筛选时以白叶枯病菌作为指示菌，发现它对白叶枯病菌具有很强的拮抗活性，网室及田间定殖和抗白叶枯病试验也取得了较满意的结果。进一步发现它对水稻和蔬菜等的多种病原有良好的拮抗效果，还对人和动物的葡萄球菌等细菌也具有良好的抑制作用，因此它是一株具有良好生物防治潜力拮抗细菌。本研究从基因水平对B8菌株拮抗分子机理进行了研究，为该菌株更好地应用于生物防治提供理论基础。 通过转座子标签法已获得拮抗活性消失的突变菌B8F和B8B，并克隆到质粒pTLF和pTLB。经亚克隆测序获得pTLF质粒的735bp F片段序列，应用GPS-1系统测序获得pTLB质粒的2608bp B片段序列。在获得这两个片段序列基础上，设计合成多种接头，构建不同接头的多个B8基因组文库，应用相应的接头引物和根据已知序列设计的特异引物进行PCR，经4次染色体步行获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的2586bp序列和右侧的664bp序列，与F片段序列拼接，获得3985bp的F contig序列；经2次步行获得了B片段右侧的2003bp序列，与B片段序列拼接，获得4611bp的B contig序列。生物信息学分析显示，F contig中包含4个ORF，与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(AY192157)的admL、admM、admN和admO四个基因有较高的同源性；被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF)对应于admM(polyketide合酶基因)，插入位点位于该基因的2369bp处，即终止密码前214个碱基。而B contig序列包含7个ORF，3个位于Tn5插入位点的左侧，依次为约200bp的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段、390bp的调控因子ORF和450bp未知功能的ORF，在前两个ORF间的还有一段600bp与耶尔森氏菌高致病力毒力岛间有一定同源性的序列；4个ORF位于Tn5插入位点的右侧，其中3个分别与andrimid生物合成基因簇的admA、admB和admC叁个基因对应并有较高的同源性，另一个408bp的ORF(命名为anrP)位于‘admA’基因前286bp处，Tn5插入于‘admA’基因前894bp的“非编码区”，即anrP基因上游200bp处。同时对Tn5插断的anrF基因和AnrB片段进行PCR验证及片段两端测序。由此证明我们已经克隆到阴沟肠杆菌B8拮抗相关基因片段。 为了证明阴沟肠杆菌B8的基因组存在类似andrimid生物合成基因簇的拮抗相关基因簇，本研究应用了长距离PCR(LA PCR)扩增大片段DNA。选择B3750-90浙江大学硕士学位论文和F2000引物，并应用￡丫Taq酶扩增出公而“’基因和anrF基因之间预期的12.5kb片段。PCR产物经Hind川酶切后，获得BAI、BAZ和BA3叁条带，将两端均带有Hindm酶切末端的BAZ片段克隆到经Hindm酶切和CIAP处理的pUC18质粒，并对BAZ整个片段进行了测序。在已知BAZ片段序列的基础上，设计扩增BAI’和BA3’片段，并对BAI’片段进行了克隆和全序列测定。对BAI’、BAZ序列编辑和拼接后，得到4997bp的BA contig，生物信息学分析显示该序列与andrim记生物合成基因簇中的口以脚C、admD、口以脚E、口己脱F、admG和a如H有较高的同源性。另一方面，根据口以脚T和口以优U基因的序列设计引物，扩增出436bp对等的‘ad，;，T’墓因片段，而没有得到‘admU’基因片段。对该片段测序后，合成用于步行的引物，获得了包含，a dmT’基因及下游的sl7bP序列。对己获得868bp序列分析显示对等基因admT间的核普酸和氨基酸的同源性分别为83 .6%和89.7%，但是在3’端有一个氨基酸的缺失:而下游非编码区序列与admT和口以阴U基因间的非编码序列间同源性较低，并存在缺失和插入突变。与此同时，以，a dmo’基因上的FSI和‘ad，)，T’基因上的admT588为配对引物，应用Ex Taq酶PCR扩增出8288bp目的片段。山此可见，我们己获到了BS拮抗相关基因簇的整个序列，并对部分基因进行了测序。从得到的序列中发现，BS拮抗相关的基因在基因大小、结构、阅读框架排列等多方面与andrimid生物合成基因簇序列完全对应;从同源性分析也显示在基因的编码区内核普酸和氨基酸的同源性均很高，在75%一92%之间，而非编码区包括两种墓因簇的上游非编码区、勺d万ZD’和，adI”E’之间的非编码区及公以优厂基因下游的非编码区有较大的差异，并有多个碱基的缺失和插入。 为了进一步验证Ths插入破坏的BS拮抗相关基因簇的anrF基因(BSF突变株)和QcB片段(BSB突变株)与拮抗活性的相关性，木试验采用了荃因互补和基因敲除的方法。选择从pFastBacTMHTA质粒上扩增的庆大霉素(Genr)作为重组转化子的抗性筛选标记。PcR扩增获得完整的anrF基因，克隆于pMD18一T载体，获得pMD一F质粒，在原pMD18一T载体上的筋al位点插入Gen尸基因，构建用于anrF基因恢复的互补质粒pMD一FG，电转化到BSF菌株，挑选转化子经PCR鉴定，点种到wakimoto平板上，以x.口。忍口e Pv.口ryzae为指示菌检测拮抗活性，其中转化子F一3部分恢复了BS的拮抗活性。在Ths插入位点的周围设计引物，PCR扩增868bp的QCB片段，在QCB片段的助211位点插入Genr基因，构建了用于QCB片段敲除质粒pMD一BG并扩增获得线性打靶DNA片段QCBG，电转化BS菌株，转化子经PcR鉴定，指示菌拮抗活性检测，发现 pMD一BG重组质粒获得的墓因?
朱军莉, 李德葆, 余旭平[2]2012年在《阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定》文中认为为了阐明水稻白叶枯病拮抗菌阴沟肠杆菌B8的作用机理,文章采用转座子标签法和染色体步移技术克隆到突变株B8B中Tn5插入位点周边拮抗活性相关片段,并通过基因敲除验证了获得的拮抗相关片段admA’上游调控序列的功能。以转座子中Kan抗性基因为标签,克隆了B8B菌株中Tn5插入位点左侧2 608 bp序列,经两次染色体步移得到Tn5插入位点右侧的2 354 bp序列。序列拼接后获得B8菌株拮抗相关序列4 611 bp的Bcontig。生物信息学分析显示该序列含有7个ORF,分别对应于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)基因的部分编码区、2个LysR家族转录调控因子、弧菌假设蛋白VSWAT3-20465及成团泛菌(Pantoea agglomerans)andrimid生物合成基因簇的admA、admB和部分admC基因序列。B8B菌株Tn5插入分别位于同源于弧菌假设蛋白的anrPORF及‘admA’基因上游200 bp和894 bp处。通过同源重组技术,借助敲除质粒pMB-BG,获得拮抗活性消失的突变株B-1和B-3。结果表明B8B突变株中Tn5的插入可能影响了anrP蛋白的转录和表达,进而调控拮抗物质编码基因簇的生物合成。B8菌株中拮抗物质相关基因是类似于andrimid生物合成基因簇的基因家族,其上游调控区对该抗生素的生物合成具有重要的作用。
余旭平, 朱军莉, 姚学萍, 何世成, 黄海宁[3]2004年在《阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析》文中认为为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理,应用自杀性质粒pZJ25介导,将Tn5转座到B8的染色体上,筛选到两株拮抗活性丧失的菌株.选择其中B8F突变株,应用Tn5上的Kan抗性基因作为标签,对Tn5插入位点左侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆,筛选得到质粒pTLF,经亚克隆后测序,获得F片段735bp的序列.提取原始菌株B8基因组DNA,酶切后与Sau3A I和Pst I两种接头连接,应用两种接头配套的引物和根据F片段设计的特异引物PCR扩增,进行染色体步行,获得了Tn5插入位点右侧的1106bp序列.生物信息学分析显示:获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF,与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(AY192157)有较高的同源性,分别对应于AdmM、AdmN和AdmO叁个基因.被Tn5插入破坏的ORF(命名为Anr-F基因)对应于AdmM(Polyketide合酶基因),插入位点位于终止密码前214bp处.由此证明Anr-F基因与B8菌株的拮抗活性相关,推测B8菌株产生的拮抗物质为Andrimid。
参考文献：
[1]. 阴沟肠杆菌B8拮抗相关基因簇的克隆及功能验证[D]. 朱军莉. 浙江大学. 2004
[2]. 阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定[J]. 朱军莉, 李德葆, 余旭平. 遗传. 2012
[3]. 阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析[C]. 余旭平, 朱军莉, 姚学萍, 何世成, 黄海宁. 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第叁届第七次学术研讨会论文集. 2004