王扬 黎承杨（通讯作者）
（广西医科大学研究生学院 广西 南宁 530021）
【摘要】 目的：观察体外培养条件下大鼠肾小管上皮细胞在钙离子诱导下的氧化应激损伤的情况。方法：体外培养大鼠肾小管上皮细胞，使用含钙钙离子的培养液作为诱导剂，实验共分为三组：(1)正常对照组（+正常培养液）；（2）Ca I组（+10mmol/L Ca2+液）；（3）Ca II组（+20mmol/L Ca2+液）。各组细胞分别培养至6h、12h、24h时，采用MTT法检测细胞增殖活性。培养12h时收集细胞培养上清液，采用化学比色法分别检测各组细胞上清液过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）的浓度。结果：结果显示细胞的抑制率随着钙离子浓度的增加而增加。对照组、Ca I组、Ca II组的细胞上清液H2O2浓度分别是7.40±1.24mmol/L, 18.20±0.96mmol/L, 21.34±1.23mmol/L。经统计学分析，各组差异有统计学意义（P＜0.05)。对照组、Ca I组、Ca II组的细胞上清液丙二醛（MDA）浓度分别是30.41±2.33nmol/L, 56.45±4.38nmol/L, 67.57±3.89nmol/L。经统计学分析，各组差异有统计学意义（P＜0.05)。结论：本研究的结果提示：钙离子能诱导大鼠肾小管上皮细胞出现氧化应激损伤。
【关键词】 大鼠肾小管上皮；钙离子；H2O2；MDA；氧化应激
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）09-0026-02
Study of oxidative stress injury of rat renal tubular epithelial cell induced by calcium Wang Yang
Guangxi Medical University, Guangxi, Nanning 530021, China
【Abstract】Objective To investigate the oxidative stress injury of calcium on the rat renal epithelial cells (NRK52E) in vitro. Methods Cultured rat renal epithelial cells (NRK52E) were divided into 3 groups in this study:(1) the control group (+normal media); (2) CaⅠgroup (+10mmol/L Ca2+ media); (3) CaⅡgroup (+20 mmol/L Ca2+ media) . The cells were incubated with or without additives for 6 h、12 h and 24 h . The cell activity of each groups were measured by the MTT at 6 h、12 h、24 h, respectively. At 12 h, the production of H2O2 and MDA in the media were measured by chemical colorimetry. Results MTT test showed that the cell proliferation inhibition rate increased significantly with the increase of calcium concentration in media. The concentrations of H2O2 in the media of the control, Ca I, Ca II are 7.40±1.24mmol/L, 18.20±0.96mmol/L, 21.34±1.23mmol/L. The concentrations of H2O2 in the media of the control, Ca I, Ca II are 30.41±2.33nmol/ml, 56.45±4.38nmol/ml, 67.57±3.89nmol/ml. Conclutions our study shows that calcium can induced rat renal epithelial occurs oxidative stress injury.
【Key words】Rat renal epithelial cell; Calcium; Hydrogen peroxide; MDA; Oxidative stress
1.前言
尿石症是一种危害全球并造成重大疾病负担的病症，据报道1%～20%的成年人会罹患尿石症[1]。而其中草酸钙结石又是最为常见的成分[2]。含钙肾结石形成的原因仍然不清楚，可能的病因学说有著名的Randall斑学说、结石形成抑制物缺乏学说、过饱和晶体学说等等。而高钙尿是最为常见的含钙肾结石患者的代谢障碍。另外，含钙肾结石的形成与肾小管上皮细胞的氧化应激损伤又密切相关[3-5]。本研究拟在体外培养大鼠肾小管上皮细胞，探讨钙离子对大鼠肾小管上皮细胞的氧化应激损害。
2.材料和方法
2.1 正常培养液、含钙离子培养液的配制
正常培养液：Hyclone DMEM+10% FBS+1%双抗。含钙离子培养液：取13.32克无水氯化钙（CaCl2）配制成含0.6mol/L Ca2+的母液，经过高温高压灭菌冷却后用Hyclone DMEM稀释成含10mmol/L Ca2+、20mmol/L Ca2+的培养液。上述操作均在超净工作台内完成。
2.2 细胞培养
大鼠肾小管上皮细胞NRK52E（购自中国典型培养物保藏中心）。收到细胞后先通过肉眼观察培养液是否浑浊，是否有漂浮物，再在显微镜下观察细胞培养液是否有微生物污染以及细胞形态和生长情况。没有异常后将细胞培养液吸入离心管中备用。用PBS清洗培养瓶，加入1ml胰酶于37℃消化2min，在显微镜下见细胞收缩后立即加入含FBS的培养液终止消化，用巴氏管吹打后加入离心管中1000转/分离心5min，去上清，加入新的培养液后重悬分装到新的培养瓶中在37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。
2.3 细胞传代
当细胞长满培养瓶底时要进行细胞传代。先要吸去培养液，用PBS清洗，加入1ml胰酶在37℃下消化2min，在显微镜下观察大部分细胞收缩时立即加入含FBS的培养液终止消化，用巴氏管吹打后加入离心管中1000转/分离心5min，去上清，加入新的培养液后重悬分装到新的培养瓶中在37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。
2.4 实验分组
使用2个不同钙离子浓度液作为诱导剂。实验共分为三组：(1)正常对照组（+正常培养液）；（2）Ca I组（+10mmol/L Ca2+液）；（3）Ca II组（+20 mmol/L Ca2+液）。各组细胞分别培养至6h、12h、24h时，采用MTT法检测细胞增殖活性。培养12h时收集细胞培养上清液，采用化学比色法分别检测各组细胞上清液过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）的浓度。
2.5 MTT法检测各组细胞的抑制率
取生长良好的第3代NRK52E细胞，以1×104个/mL的密度接种于96孔板，细胞融合后，更换为不含胎牛血清的正常对照组（+正常培养液），Ca I组（+10mmol/L Ca2+液），Ca II组（+20mmol/L Ca2+）。每组设10个孔，6h、12h、24h后，每孔加入20μL的MTT溶液，37℃孵育4h后，弃上清液，每孔加入 200μL DMSO，混匀。用酶联免疫检测仪于450nm波长下，测定吸光度(Optical Density,OD)值。根据公式：增殖抑制率= 1-(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)计算抑制率。以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制细胞抑制曲线。
2.6 化学比色法检测各组细胞培养上清液过氧化氢的浓度
取生长良好的第3代NRK52E细胞，以3×105个/mL的密度接种于6孔板，待细胞融合后，加入含不同浓度钙离子的培养液。12h后收集细胞培养上清液，3500RPM离心10min后～80℃保存。按试剂盒（南京建成）说明标准管和测定管中各加入标准样品、样品和试剂一，混匀，37℃准确反应1分钟再加入试剂二，混匀后与405nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值，并计算过氧化氢的浓度。
2.7 化学比色法检测各组细胞培养上清液MDA的浓度
取生长良好的第3代NRK52E细胞，以3×105个/mL的密度接种于6孔板，待细胞融合后，加入含不同浓度钙离子的培养液。12h后收集细胞培养上清液，3500RPM离心10min后-80℃保存。按试剂盒（南京建成）说明操作加入各试剂后在95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值并计算MDA浓度。
3.结果
3.1 MTT法检测细胞增殖抑制率
采用MTT法检测各组不同时间点（6h、12h、24h）的OD值（表1），绘制成细胞抑制曲线图（图1）。结果显示细胞的抑制率随着钙离子浓度的增加而增加。经统计学分析，各浓度钙离子诱导组与对照组相比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。
注：*表示与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）
4.讨论
高钙尿症被认为是特发性肾结石形成的一个重要危险因素[6]。有临床研究报告，接近50%的含钙肾结石患者会表现出尿钙排泄增多的现象。而且在结石复发的患者中，存在尿钙浓度比结石没有复发的患者的尿钙浓度高的现象[7]。这表明高钙尿症和含钙肾结石的形成有着密切的关系。另外，越来越多的研究表明肾小管上皮细胞发生氧化应激损害在肾结石的形成过程中起重要的作用。氧化应激损伤是氧化物和抗氧化物的比例失调引起的，主要表现为氧化物质的增多和抗氧化物的减少。活性氧族（ROS）是细胞代谢过程中的一类性质活泼的分子，主要产生部位在线粒体，具有较强的氧化能力，过氧化氢（H2O2）是其中一种重要的组成部分[8]。H2O2的水平能准确的反应细胞氧化应激水平的高低。生理水平上的ROS在细胞的增殖、分化、炎症反应等的信号转导体系中扮演重要角色。然而大量的活性氧自由基的产生，会使细胞产生损害，氧自由基会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并由此形成脂质过氧化物，比如丙二醛，这也是氧化应激损伤的重要指标[6][9]。本研究在体外培养的条件下，用钙离子诱导大鼠肾小管上皮细胞，发现其H2O2表达量和MDA的表达量均较正常对照组增高，而且随着钙离子浓度的增高而增高。这进一步表明，钙离子能诱导大鼠肾小管上皮细胞出现氧化应激损伤。
【参考文献】
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论文作者:王扬,黎承杨（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年3月第9期
论文发表时间:2016/5/14
标签：培养液论文; 细胞论文; 肾小管论文; 浓度论文; 离子论文; 肾结石论文; 抑制论文; 《医药前沿》2016年3月第9期论文;