江苏丹阳市中医院 李韵
【 中 图 分 类 号 】 Ｒ４７３． ５【 文 献 标 识 码 】 Ｂ【 文 章 编 号 】 １５５０ －１８６８（ ２０１６） ０４
[摘要] 目的：分离鉴定源于急性淋巴细胞白血病（ALL）患者血液中的未知细菌。方法：采用常规及VITEK32微生物GNI鉴定卡鉴定细菌，K-B法进行药敏试验，PCR法扩增细菌的16S rRNA基因，通过测序并与GenBank中相关序列进行比对。结果：常规生化反应和微生物自动化鉴定系统不能鉴定。16S rRNA PCR扩增产物经测序与GenBank中序列比对，发现与草螺菌属有99％同源性。结论：来源于ALL患者血液中的未知细菌是草螺菌。
[关键词] 急性淋巴细胞白血病；草螺菌；16S rRNA
草螺菌（Herbaspirillum）是一类嗜用有机酸，耐性强的植物内微需氧固氮菌可在高糖培养基上生长并固氮，但不利用蔗糖的固氮菌,在临床标本中罕见，大多依附植物生长[1, 2]。本研究从我院一女患者血液中分离得到未知菌，经微生物自动化鉴定系统无法进行鉴别，后经基因检测分析，鉴定为草螺菌属。
一、材料与方法
1. 病例介绍：患者女，48岁。2008年3月经骨穿等检查确认为急性淋巴细胞白血病（ALL），接受化疗，同时输入红细胞、血小板，并使用重组人粒细胞刺激因子以增加 WBC。2009年1月21日17时30分患者无明显诱因突起寒战、高热，体温40.3 ℃，无头晕头痛、无呕吐、咽无充血，双肺呼吸音粗，未闻及明显啰音。血常规：WBC 5.0×109／L（中性粒细胞占0.93），抽血培养，同时使用头孢美唑联合加替沙星抗感染治疗。1月23日体温恢复正常。通过问诊得知，患者发热前两天内曾食用甘蔗汁。
2．细菌分离与生化表型鉴定：分别抽患者双臂静脉血各8 ml分别注入两FA血培养瓶，即刻放入法国生物梅里埃公司出品的BacT/ALERT 3D全自动培养仪（3D系统）中进行孵育。标本接种按操作规程[3]进行，分离菌株经革兰染色后，用显色氧化酶试剂、VITEK-32 GNI+鉴定卡进行鉴定。
3．药物敏感试验：采用琼脂纸片扩散法(K-B法)，参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准操作[4]。抗菌药物由英国Oxoid公司提供，放置在35 ℃的5% CO2孵箱中进行孵育。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。
4．16S rRNA基因检测：挑取少量新鲜培养的细菌，悬浮于100 μl PBS中，100℃煮沸10 min，8 000 r/min离心10 min，取上清为PCR的模板[5]。16S rRNA上游引物为：5’-GCGTGCTTAACACATGCAAGTC-3’，下游引物为 5’-TCCTCCTGATATCTGCGCATTC-3’。PCR反应体系为：10×EX Taq Buffer (Mg2+) 2.5 μl，dNTPs 2 μl，EX Taq 酶0.25 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板DNA 1 μl，加灭菌双蒸水至25 μl。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。所得产物行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
二、结果
1. 细菌形态观察 细菌培养结果：血培养仪在培养到34.5 h阳性报警，无菌操作抽取培养液，直接图片，革兰染色，镜检见略呈弯曲的革兰阴性杆菌（图1），转种血平板于5% CO2的35 ℃孵育箱中进行培养。24 h形成肉眼可见的灰白色小菌落（<0.5 mm）。
图1 草螺菌革兰染色图谱
2. 生化特征 VITEK-32 GNI+鉴定卡无法鉴定，鉴定编码为：60726220100（不能鉴定）。生化反应见表1.
表1 分离菌生化试验结果
注：DP3，三氯新作抑菌生长试验；OFG，葡萄糖氧化；GC，阳性生长控制；ACE，醋酸盐利用；ESC，七叶苷水解；PLI，植物脲蓝母；URE，脲酶；CIT，枸橼酸盐；MAL，丙二酸盐；TDA，色氨酸；PXB，多粘菌素B；LAC，乳糖)；MLT，麦芽糖发酵；MAN，甘露醇；XYL，木糖；RAF，棉糖；SOR，山梨醇；SUC，蔗糖；INO，肌醇；ADO，侧金盏花醇；COU，香豆酸；TLA10%，乳糖。
3. 药敏试验结果 见表2
表2 药敏试验结果
4. PCR检测结果 以煮沸法获得的分离菌DNA为模板，进行PCR，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在646 bp处有一特异性条带（图2）。将PCR产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
图2 PCR扩增的16S rRNA基因片段的琼脂糖凝胶电泳结果
5．基因序列比对 测序结果直接在GenBank中（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）进行序列比对分析，与草螺菌16S rRNA序列（GenBank登录号：AM989096.1）同源性高达99％（图3）。
图3 测序结果比对图谱
三、讨论
草螺菌是一类嗜用有机酸，耐性强，微需氧，有动力的略呈弯曲的革兰阴性非发酵杆菌，可在高糖培养基上生长并固氮，但不利用蔗糖。它广泛存在于各种植物，包括玉米、麦子、米、甘蔗、高梁、香蕉和菠萝[6 ,7 ,8]。草螺菌主要有2种类型:一是织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)，它是一种广宿主的内生固氮菌，固氮能力强，甘蔗生长过程中60%的氮源由其提供，但在土壤中生存能力很差，尚未见引起宿主植物任何不良反应的报道；二是红苍白草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans)，它是一种能引发某些品种产生甘蔗条斑瘤的温和致病菌，在巴西甘蔗的根、茎、叶内大量繁殖，但并不引发症状。迄今为止，人感染草螺菌的报道极为少见。2005年，Michael等人首次报道了草螺菌在人体内导致菌血症[9]。随后，有学者从囊性纤维化病患者体内分离得到了草螺菌[10]。由于通过生化反应鉴定草螺菌难度较大，常采用基因测序的方法进行鉴定。
此次，本研究从我院一48岁女患者血液中分离得到一株细菌，该患者有十余年高血压病史，经骨穿等检查确认为急性淋巴细胞白血病，已通过多个方案进行化疗。患者发热前有食用甘蔗史，我们推测患者血培养中分离出的草螺菌可能来自于甘蔗，因为甘蔗是草螺菌最常见的宿主。大多数情况下，人们食用草螺菌污染的甘蔗并不能发病，但对机体具有潜在的致病作用，一旦机体的免疫力低下时易引起人类的感染。该患者基础疾病严重且经多次化疗，机体免疫功能低下，使得原先只能在植物中生存的该菌通过消化道进入机体，侵入血流，导致菌血症。我们首先应用常规方法再运用微生物自动化鉴定系统进行鉴别，但都无法确定。经16S rRNA遗传基因扩增并测序，将序列与GenBank中细菌序列相比对，发现与草螺菌16S rRNA有99％同源性，可以确定为草螺菌。这是首次从急性淋巴细胞白血病患者体内分离得到草螺菌。
CLSI没有出版草螺菌的药敏敏感性实验实验手册及判断标准，如果采用肠道杆菌的标准进行判断，本次分离菌株体外药敏试验结果对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素、诺氟沙星、氨曲南等5种抗菌药物不敏感外，对其他13种抗菌药物均敏感。
综上所述，本研究首次从急性淋巴细胞白血病患者外周血标本中发现草螺菌，并对该菌的生物学特性进行了初步的探讨，这为进一步研究草螺菌的致病机理及在我国开展流行病学调查提供了有效的科学依据。
参考文献
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[2] Razzera G, Vernal J, Baruh D, et al. Spectroscopic characterization of a truncated hemoglobin from the nitrogen-fixing bacterium Herbaspirillum seropedicae[J]. J Biol Inorg Chem, 2008, 13(7): 1085-1096.
[3] 叶应妩. 全国临床检验操作规程. 东南大学出版社. 2006, 3: 738-788.
[4] Baldani JI, Baldani VLD, Seldin L, et al. Characterizationof Herbaspirillum seropedicae gen nov ,sp nov, a root-associatednitrogen fixing bacterium[J]. Int J Syst Bacteriol, 1986, 36: 86–93.
[5] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 16th Information supplement; M100-S16. Wayne, PA: CLSI; 2006.
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[7] Magalhães Cruz L, de Souza EM, Weber OB, et al. 16S ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from banana (Musa spp.) and pineapple (Ananas comosus (L.)Merril) [J]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(5): 2375–2379.
[8] Olivares FL, Baldani VLD, Reis VM, et al. Occurrence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp in roots, stems, and leaves, predominantly of Gramineae [J]. Biol Fertil Soils, 1996, 21: 197–200.
[9] Michael J,Tan MD, Richard L, et al. Lower extremity cellulitis and bacteremia with Herbaspirillum seropedicae associated with aquatic exposure in a patient with cirrhosis[J]. Infect Dis Clin Pract, 2005, 13: 277–279.
[10] Spilker T, Uluer AZ, Marty FM ,et al. Recovery of Herbaspirillum Species from Persons with Cystic Fibrosis[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(8): 2774–2777.
论文作者:李韵
论文发表刊物:《医药界》2016年4月第4期
论文发表时间:2016/6/27
标签：鉴定论文; 细菌论文; 甘蔗论文; 患者论文; 淋巴细胞论文; 序列论文; 基因论文; 《医药界》2016年4月第4期论文;