1.河北工程大学附属医院 普外一科 河北邯郸 056002；
2.河北工程大学附属医院 产科 河北邯郸 056002；
3.河北工程大学附属医院 泌尿外科 河北邯郸 056002
【摘 要】目的：观察携带人端粒酶逆转录酶基因( human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的慢病毒表达载体转染SW626细胞（人卵巢腺癌细胞株）后hTERT基因在靶细胞中的表达。方法：将携带目的基因hTERT的重组慢病毒表达载体及包装系统共转染293T细胞（人胚肾上皮细胞株），通过超速离心沉淀法浓缩病毒上清后转染SW626细胞。转染前将靶细胞分为转染组、空转组及对照组，完成转染后于显微镜下观察靶细胞中绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）显色，并应用PCR检测SW626细胞中hTERT mRNA的表达。结果：293T细胞经重组慢病毒与包装质粒共转染后能产生重组病毒并且能够成果的将目的基因hTERT高效地转导入靶细胞SW626细胞中并稳定表达，荧光显微镜下可直接观察到GFP；转染后的SW626细胞经检测，其内hTERT基因 mRNA表达明显增强。结论：重组慢病毒表达载体LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT能够高效稳定地将外源 hTERT 基因导入SW626细胞并使其长久表达，为卵巢肿瘤生物治疗研究奠定了科研基础。
【关键词】慢病毒；转染；hTERT；端粒酶
【中图分类号】R737.31 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0273-02
DETECTION OF HUMAN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE GENE EXPRESSION IN SW626 AFTER LENTIVIRAL TRANSFECTION
Zhao Guo dong1 Hui Li mei2 Zhao Jian jun3*
(Hebei engineering university affiliated hospital, General subject1, obstetric2, urology3,HeBei,HanDan 056002)
* corresponding author: Zhao Jian jun
【Abstract】Objective: To observe hTERT gene expression after lentiviral expression vector which carrying human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) was transfected into SW626 cells(human ovarian adenocarcinoma cell line).Methods: The recombinant lentivial vectors were harvested from 293T cells and were concentrated by ultracentrifugation .The target cells were divided into three groups, the transfection group(LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT recombinant lentiviral vector), idling group (LV4-pGLV-EF1a-EGFP recombinant lentiviral expression vector) and the control group SW626 cells(equivalent medium) .The number of cells which contained green fluorescent protein (GFP) were observed under fluorescence microscope. Expression of hTERT mRNA in cells were detected by PCR . Results: The recombinant lentivial vector LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT could generated lentivirus in 293T cells after co-transfection with packaging plasmids. mRNA expression in SW626 cells which transfected with LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT was significantly increased.Compared with the control groups, LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT resulted in increased expression of hTERT in the transfection group. Conclusion: The recombinant lentiviral vector LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT carrying hTERT gene could effectively transfect SW626 cells and express hTERT protein stably and permanently, which provides a scientific basis for immortalization research.
【Key words】Lentiviral vector; Transfection;hTERT；Human telomerase
端粒酶是一种核糖核酸蛋白复合体，能够延长端粒末端并保持端粒长度，主要有3个亚单位组成，即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白及其催化亚单位端粒酶逆转录酶基因(Human Telomerase Reverse Transcriptase, hTERT)。正常真核细胞的端粒可被称作“生命之钟”[1]。伴随端粒酶活性的增加，hTERT mRNA表达水平也相对应成一定比例增加，hTERT是调控人类端粒酶活性的主要亚单位，只要hTERT表达其他亚单位就会与其共同构成高活性的端粒酶全酶[2]。慢病毒载体具有感染宿主广、基因整合率高且稳定、性质较稳定等诸多优点[3]，通过构建携带人端粒酶逆转录酶基因的慢病毒表达载体，并观察转染后靶细胞内hTERT基因表达，从而为卵巢肿瘤生物治疗提供一种有效的科研手段。
1 材料与方法
1.1材料
携带目的基因hTERT的慢病毒表达载体（pGLV-EF1a-EGFP-hTERT）；不携带任何外源基因的表达载体pGLV-EF1a-EGFP；感受态DH5α、人胚肾上皮细胞株293T细胞、人卵巢癌细胞株SW626。
1.2 主要仪器与试剂
超净台，CO2细胞培养箱，DEME高糖细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、24孔及96孔培养板，光学显微镜，5180R高速低温离心机，垂直电泳仪 无内毒素质粒小提试剂盒，Lipofectamine2000，PCR试剂。
1.3引物设计
所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。根据hTERT mRNA 序列用Primer Premier 5. 0 软件设计hTERT引物。GAPDH作为内参。
hTERT:
上游引物：5′-3′GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG
下游引物：5′-3′CGACGTAGTCCATGTTCACAA 拟扩增长度：254bp
GAPDH:
上游引物：5′-3′GAAGGTGAAGGTCGGAGT
下游引物：5′-3′GAAGATGGTGATGGGATTTC 拟扩增长度：226bp
1.4 方法
1.4.1 慢病毒包装
将处于对数生长期的293T细胞接种于六孔板中，每孔约3×106个细胞，使其生长到转染当天达到70%左右的融合度，加入含10%FBS的高糖DMEM培养基，放于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养。根据质粒质量换算出所需的体积，取6个1.5mL灭菌的EP管，分别加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒及无血清的高糖DMEM培养基，使总体积为250μL。轻轻混匀后于室温静置5min；取6个1.5mL灭菌EP管，分别取10μL脂质体2000溶于240μL无血清DMEM培养基中。轻轻混匀后于室温静置5min；将DNA溶液和脂质体溶液轻轻混匀。室温静置20min；PBS轻轻冲洗六孔板中的293T细胞2-3次，各孔分别加入DNA溶液与脂质体的混合液500μL，置于37℃ 5%CO2培养箱中；6-8h后观察细胞，形态基本不改变说明细胞耐受，移去DNA溶液与脂质体的混合液，加2mL含10%FBS含双抗的新鲜高糖DMEM培养基，可于镜下观察绿色荧光；72h后收取病毒上清，超速离心沉淀（4℃,30000rpm,2h），浓缩纯化病毒；每管50μL分装，-80℃保存。
1.4.2重组慢病毒感染SW626细胞
接种3-5×103个SW626细胞于96孔培养板的每孔中，加100μL RPMI1640培养基，使病毒感染时细胞的融合度为50%左右；感染前为细胞换液，吸去细胞上清，将靶细胞分为转染组、空转组和对照组加入所需的培养基90μL,每组重复三个孔；预先从-80℃冰箱中取出病毒液，冰上融化备用。转染组加入pGLV-EF1a-EGFP-hTERT慢病毒、空转组加入pGLV-EF1a-EGFP慢病毒、对照组加入等量的培养基；感染3-5d后，观察荧光表达情况；
1.4.3 RT-PCR检测靶细胞中hTERT基因mRNA的表达
分别提取三组细胞转染后3天的总RNA，逆转录cDNA作为模板，同时扩增目的基因hTERT(254bp)及内参GAPDH (226bp)。PCR 反应体系 20μL。循环参数为：94℃ 预变性 5 min；94℃变性 30s，55℃退火 45s，72℃延伸 1 min，34个循环；72℃继续延伸 10min。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。实验结果的计量数据以均数±标准差( ±s)表示，数据之间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1包装细胞293T转导pGLV-EF1a-EGFP-hTERT后GFP的表达
图1A为pGLV-EF1a-EGFP-hTERT质粒转导入293T细胞72h后，在荧光显微镜下可以看到GFP的表达呈阳性，其表达率达90%以上。图1B为重组慢病毒感染SW626细胞3d后可见GFP的表达，第5天时最强，表明包装出的慢病毒可以成功感染目的细胞SW626。
附图1
Fig.1 Fluorescence expression of 293T cells Lentiviral pGLV-EF1a-EGFP-hTERT transfected after72h and SKOV3 cells Infected with lentivirus after 5d
3 讨论
人的端粒是由6个碱基重复序列（TTAGGG）和结合蛋白组成。端粒有重要的生物学功能，可稳定染色体的功能，防止染色体DNA降解、末端融合，保护染色体结构基因DNA，调节正常细胞生长。正常细胞由于线性DNA复制5'末端消失，随体细胞不断增殖，端粒逐渐缩短，当细胞端粒缩至一定程度后细胞停止分裂从而处于静止状态。故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(Mistosis clock)，端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。细胞中有种酵素负责端粒的延长，即端粒酶。端粒酶是核糖核酸蛋白复合体，主要有3个亚单位组成，即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白(TPI)及其催化亚单位端粒酶逆转录酶基因(hTERT)。hTERT表达与端粒酶活性密切相关，在端粒酶表达中起决定性作用[4-5]。它能以自身RNA组分为模板，合成端粒DNA序列，维持端粒保持一定长度，因而避免因端粒丢失而引起的细胞凋亡，这与多种肿瘤的发生有关，同时使得细胞维持永生性[6]。
1989年Morin在永生化细胞Hela-S细胞中发现了端粒酶的活性[7]。随后端粒酶活性在肿瘤细胞和永生化细胞被测出呈阳性，端粒酶可能是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标记物。端粒酶活性、其翻译后调控机制及建立永生化细胞系成为研究热点。研究细胞永生化最常用的方法就是通过构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的表达载体, 通过各种方式转染目的细胞使其端粒酶活性增强。研究表明单纯的导入hTERT不会对细胞正常的生物学特性产生不良影响[8-9]。这就说明将外源hTERT基因导入人类细胞可提高端粒酶活性，从而延长细胞体外培养寿命，甚至可能发展为永生化的细胞。目前，将目的基因导入靶细胞的方法主要有真核表达质粒转染和病毒载体介导的基因转移方法。其中转染真核表达质粒存在表达时间短、靶向困难、转染效率低等问题。与真核表达质粒相比，病毒载体介导的基因转移可以整合宿主的染色体中，有更好的稳定性。Gerolami 等[10]将带有HSV-TK/GFP融合基因的慢病毒载体在体外转染肝癌细胞与正常肝细胞并且转染大鼠体内的肝癌细胞, 结果表明, 慢病毒载体在体内外均能有效地转染肝癌细胞, 而不对正常肝细胞起作用。
慢病毒感染机制是在宿主细胞内以病毒RNA为模板，在自身反转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板合成双链DNA，经环化后整合在宿主细染色体上并长期表达。本研究应用慢病毒感染SW626细胞，使得靶细胞能够长期稳定的表达目的基因，可以得到长期稳定表达hTERT目的基因的细胞株，从而能够达到研究目的基因对细胞功能的影响，以及进行进一步实验的目的，为进一步的实验进展提供充足的细胞来源。
参考文献：
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通讯作者:
赵建军
论文作者:赵国栋1,回丽妹2,赵建军3通讯作者
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/9
标签：细胞论文; 转染论文; 端粒论文; 基因论文; 目的论文; 病毒论文; 质粒论文; 《中医学报》2015年8月论文;