安广宇[1]2001年在《抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究》文中指出血小板血栓形成是血管闭塞性疾病的主要成因。其表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集最终共同途径的关键要素。阻断GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合，能高效地抑制血小板的聚集，进而使血小板血栓不能形成。SZ-21是我室制备的一株针对GPⅢa的单克隆抗体，经家兔颈动—静脉血栓模型证实能显着降低血栓形成，显示了在抗血栓治疗中的潜在价值。为降低鼠源性单抗免疫原性（HAMA）及全抗体Fc段对血小板的破坏，本研究将SZ-21制备成小分子抗体，并对这一抗体片段进行了纯化、复性和体外性质的研究。一 SZ-21单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析 采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从分泌抗血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ-21杂交瘤细胞中克隆了该抗体的重、轻链可变区（V区）基因，并测序分析。SZ-21重链（V_H）基因全长为342 bp，轻链（V_L）基因全长为306 bp，分别编码114和102个氨基酸。基因序列登录号为VH：AF354053，VL：AF354054。二 SZ-21单链抗体（SZ-21ScFv）基因的筛选和表达 为最大限度地保留单链抗体的血小板结合活性，利用噬菌体展示技术进行了高亲和力筛选。将SZ-21 V_H和V_L基因分别与含有（Gly_4Ser）_3多肽接头的载体pSW1-ScFv连接，构建成单链抗体基因pSW1-SZ21ScFv，克隆到噬菌体分泌型表达载体pHEN1中。同时亲和层析纯化血小板膜糖蛋白Ⅲa，用糖蛋白Ⅲa作为抗原进行高亲和力筛选。经过四轮“吸附—洗脱—扩增”的富集过程，phage-ELISA得到一个具有与血小板高亲和力的克隆，转化E.coli HB2151，表达了可溶性ScFv融合蛋白。ELISA和Western blot证实该融合蛋白保留了亲本抗体的血小板结合特性。叁 SZ-21单链抗体高效表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达 将上述筛选得到的单链抗体基因亚克隆到大肠杆菌融合型表达载体pET20b中，得到pET20b-21ScFv。通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究 摘 要 BLZI（DE3）PlysS中表达了功能分子。SDS－PAGE和 Western blot显 示表达产物的分子量为27000。该融合蛋白除少量为分泌型表达外， 主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的 21％，约 20 m叭。同 时探索了该抗体片段的最佳复性条件。把包涵体形式表达的 SZ上 单 链抗体片段用尿素溶解，经过蛋白质的体外重折迭复性过程，成功地 得到具有活性的单链抗体片段。ELISA和Western印迹检测证实，该 鱼链抗体保留了与血小板特异结合的能力。 四SZ毛 的纯化和体外性质研究 通过NINTA树脂亲和吸附纯化，获得具有活性的高纯度单链抗 体片段，纯度达95％以上。流式细胞仪检测证实该单链抗体能与人脐 静脉内皮细胞和血小板反应。体外实验表明，SZ2 单链抗体能够抑 制 ADP诱导的血小板聚集，其抑制能力呈剂量依赖性，其 IC刃为 12 ug／mL，在浓度为20 ug／mL时达到最大抑制率。对花生四稀酸诱导的 血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ上 单链抗体同样能够抑 制纤维蛋白原与血小板的结合，显示了其抗血栓作用。 以上结果表明，制备的基因工程抗体具有原鼠单克隆抗体的抗 血栓形成能力，减少了全抗体的人抗鼠抗体反应（HAMAh 同时该小 分子抗体片段去除了抗体的FC段，避免鼠源性单克隆抗体引起血小 板严重下降的副作用。该单链抗体有望用于抗血栓治疗。 五抗血小板膜糟蛋白单抗SZ毛 嵌合Fab片段基因构建和表达研究 利用基因克隆技术，从杂交瘤细胞系 SZ上 中克隆出轻、重链可 变区基因，然后亚克隆到含有人恒区基因C＊和C。的质粒pSWIFab 中，构建成人一鼠嵌合Fab抗体片段质粒pSZ2，在大肠杆菌中表 达了可溶性＊b抗体片段。SDS－PAGE显示在分子量（Mr）45 000处 有一诱导条带，与该嵌合抗体的理论计算值相符。表达量约为 800 fig／L， ELISA和Western检测证实表达产物具有与血小板结合的活性。
戴克胜[2]2002年在《血栓性疾病及抗栓基因工程抗体的分子生物学研究》文中研究表明血栓性疾病的发生是由多种遗传和环境因素共同作用的结果。vWF是由血管内皮细胞和巨核细胞合成的多聚体糖蛋白，既可在高切状态下启动血小板粘附、聚集，又是携带凝血因子Ⅷ的载体，最近的许多体外实验证据显示，vWF在血栓形成中起着关键性作用。研究表明，vWF是一般人群中经常发生的心肌梗死的危险因素，vWF基因启动子区域的-1051G／A、-1792C／G等多态性可通过调节血浆vWF水平而与缺血性心脏病的发生密切相关，vWF多肽序列中Thr789Ala多态性也是Ⅰ型糖尿病病人中冠心病发生的一个危险因素。因而有理由将其作为血栓形成的候选因子进行研究。基因芯片技术已在基因测序，基因突变及多态性分析，基因表达及功能分析，文库筛查，新药开发以及病原体检测等方面进行了应用和探讨，呈现出广阔的应用前景。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是遗传变异中最常见的一种变异方式，在人类基因组中其发生频率为每1000bp中0.5-10个。由于多基因与环境间具有十分复杂的相互作用，必须对人群中大量出现的SNP进行确定，才能对它们在疾病发生发展中的作用进行解释。本研究拟探讨vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多态性与血栓性疾病的发生有无相关关系；并对基因芯片技术在SNP检测上的应用进行探讨。 研究中，我们首先建立vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多态性寡核苷酸阵列检测方法。设计、合成两组寡核苷酸探针，使用3甲氧基氨基丙基硅烷、戊二醛等化学物质，实现探针与固相支持物玻片的连接。应用不对称PCR方法扩增RsaⅠ、SmaⅠ多态性片段，在扩增体系中掺入荧光标记dUTP，获得被测片段的单链标记产物。对核酸杂交反应的温度、动力学和离子浓度变化进行研究，获得最佳的杂交鉴别条件，随机抽取20名正常人，酶切法确定多态性基因型，再用寡核苷酸阵列法检测，以验证该方法的准确性。使用该方法对50例血栓病人进行检测，探讨血栓性疾病的发生与vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多态性的关系。结果表明，寡核苷酸阵列法和酶切法对20例标本检测的符合率为100％；血栓病人与正常人之间两位 苏州大学傅士学位论文 中文摘要 点多态性的基因型和等位基因频率的差异均无显着意义（P＞0．05）。因而本研究 成功建立 vWF基因 Rsa、Sma多态性寡核苦酸阵列检测方法，为基因芯片技 术在SNP检测上的应用提供依据；同时也对遗传性疾病的高效诊断途径进行了成 功探索；未获明确证据表明Rsa、Sma多态性与血栓的发生有关。 上述研究中，虽然50例血栓病人与正常人之间Sma多态性在基因频率与 基因型分布的差异上无显着统计学意义，然而 Sma阳性纯合子在血栓病人中的 出现频率为正常人的2．7倍。为弄清这一多态性对血栓发生的确切影响，我们扩 大样本例数，并使用价格低廉的聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析 （PCR－RFLP）技术代替寡核苦酸阵列检测方法，对107例急性脑梗死（脑梗）、 49例急性心肌梗死（心梗）病人和 113例正常对照，检测 vWF基因 Sma多态 性，并对其中来自同一医院的53例脑梗、22例心梗病人和47例正常对照进行 血浆 vWFkg测定。结果，vAF基因 Sma多态位点各基因型和等位基因分布， 在脑梗病人与正常对照组间差异有显着意义①．OD户0．om；O．05＞户0．02人其 中 S。al阳性纯合子（CC）使患脑梗的危险度提高了 3．29倍（0R＝＝3．29 95％CI：，1．5个7．01，0．m坝0．001人心梗病人与正常对照组间各基因型和等位基因分布 差异无显着意义（0．50＞p）0．30；0．30＞p＞0．20）。血浆 vWFhg测定结果为，正常 人及脑梗、心梗病人血浆 VWFkg水平分别为 0．468、0．584和 0．783U砌l。脑梗 病人与正常对照间无显着性差异（peo．195人而心梗病人与正常对照间有显着性 差异（p＝0．00人 v呷基因 Sma多态位点各基因型分布在脑梗、心梗病人和正 常人各组中与血浆VWF Ag水平均无相互关系（P＝0．323，P＝0．315，peo．96人表 明，vWF基因Sma多态性与脑梗发病相关，可能是脑梗发病的危险因素之一； 未发现与急性心肌梗死发病相关；该多态位点与血浆 vWFkg水平无关。 血小板在血栓形成尤其是动脉血栓形成中起着十分重要的作用，选择适当 抗体、蛇毒、合成肽等物质，有效抑制血小板的功能，己成为研制新型抗血栓药 物的有效途径。其中以抗 GP 11b／Illa单克隆抗体 7E3为亲本制备的人－鼠嵌合抗 体hab片段C7E3，能显着降低急性冠脉综合症PTCA术后再梗塞和缺血并发症的。发生率，已获FDA批准，广泛应用于缺血性心脏病患者的治疗。SZ《是我室制 备的一株针对 GPIb a的单克隆抗体，其抗原表位位于 GPIb a Try276－Gin282，不 仅具有抑制瑞斯托霉素、博托?
王菲菲[3]2012年在《抗VWF-A3区特异性单抗SZ-123单链抗体的制备和生物学特性研究》文中研究说明研究背景：血栓性疾病严重威胁着人类的健康,血栓形成机制的研究是医学科学领域重大课题之一。动脉血栓是造成90%以上的心肌梗死、80%脑卒中的主要原因,动脉栓塞性心血管疾病一直是发达国家首位的死亡原因。血小板在血栓形成特别是动脉血栓形成中起着重要作用。因此抗血小板治疗是预防和治疗血栓性疾病的重要措施。临床广泛使用的经典抗栓药物如第一代的阿司匹林,噻氯吡啶等,可相应地抑制血小板活化过程中,由血栓烷A2(TXA2)和二磷酸腺苷(ADP)介导的单一步骤,具有预防血栓形成的作用,第二代血栓性药物是以阻断血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP) Ⅱb/Ⅲ a与纤维蛋白原(Fg)结合为主要机制。近年来针对动脉血栓形成早期阶段的研究,其中胶原-血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)-GP Ⅰ b轴各分子间相互作用的分子机制及抗血栓治疗新靶点的研究已成为血栓与止血领域中的热点和前沿科学问题之一。由于针对胶原-vWF-GP Ⅰ b轴来阻止血小板的早期粘附和活化,具有更早、更好的抗栓活性,并减少出血危险性,形成新一代的抗栓药物,因此具有更为广阔的应用前景。赵益明等之前报道了一株特异性针对vWF-A3区的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb) SZ-123,该单抗不仅能抑制vWF与胶原的结合,还能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(血小板膜糖蛋白GPIb结合于vWF-A1区),这一结果提示vWF-A3区胶原结合部位可能动态调节vWF-A1区的功能。此外,SZ-123抗体已经证实在猴体内具有抗栓活性。抗vWF-A3区特异性单抗SZ-123不但能够抑制vWF-A3区与胶原结合,而且抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。现已排除了SZ-123与vWF-A1区的作用,有假设提出是由于mAb SZ-123与vWF-A3作用的同时影响了vWF-A1区的空间构像,改变了其空间结构,进而影响了vWF-A1区与血小板的结合,从而产生抗栓的作用。因此,制备分子量较小的单链抗体,更有利于从蛋白质空间结构上解释SZ-123的作用机制,这也是制备SZ-123单链抗体的重要意义所在。目的：本研究旨在利用基因工程手段制备相对于抗vWF-A3区特异性单抗SZ-123分子量较小的单链抗体,通过原核和真核表达以及体外生物学功能实验验证其是否具有与SZ-123相似的功能活性,从而从蛋白质空间结构上解释单抗SZ-123与vWF不同功能结构域相互作用的独特机制,为下一步鼠源单抗SZ-123的人源化和更深一步探讨单抗SZ-123的抗栓机制提供理论依据,同时也为将来开发基于单抗SZ-123的抗栓药物奠定基础。方法：(1)首先用RT-PCR方法扩增单抗SZ-123重链和轻链可变区基因,并用Over-lap PCR方法将重链和轻链与linker序列拼接成单链抗体(SZ-123ScFv),构建SZ-123ScFv原核表达载体并转化到大肠杆菌,完成SZ-123ScFv的原核表达,对其浓缩,然后用ELISA, Western blot等方法验证SZ-123ScFv的免疫原性。(2)首先用RT-PCR方法扩增单抗SZ-123重链和轻链可变区基因,并用Over-lapPCR方法将重链和轻链与linker序列拼接成单链抗体(SZ-123ScFv),构建单抗SZ-123ScFv基因真核表达载体pSectag/SZ-123ScFv,经转染和筛选后,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达,完成SZ-123ScFv的真核表达,对其浓缩,然后用SDS-PAGE, Western Blot等方法验证SZ-123ScFv的免疫原性。(3)通过胶原结合抑制试验验证SZ-123单链抗体的功能活性：以人胎盘Ⅲ型胶原包板,加入vWF纯品后,再加入原核与真核表达的浓缩纯化后的蛋白孵育,最后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的兔抗人vWF多克隆抗体,四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)显色后,酶标仪读取吸光度值(OD)。(4)通过瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验验证SZ-123单链抗体的功能活性：抽取健康人柠檬酸钠抗凝的静脉血,分离得到富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。加入瑞斯托霉素诱导,在血小板聚集仪上检测其抑制血小板聚集功能。结果：SZ-123ScFv的原核表达：VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-123ScFV基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的20%。经过变性和复性后,获得具有生物活性的单链抗体片段。其有一定的抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能(P<0.05),差异具有统计学意义。SZ-123ScFv的真核表达：将780bp拼接后的ScFv插入真核表达载体pSectag-123ScFv,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag/SZ-123ScFv,将pSectag/SZ-123ScFv转染到中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary, CHO)后获得目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot检测表明目的蛋白分子量约为45kD。生物学功能试验结果显示SZ-123ScFv能够剂量依赖性抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合,且能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。与单抗SZ-123相比,其抑制作用有所降低。结论：(1)成功地构建了SZ-123单链抗体基因原核表达载体PET20b(+)-123ScFv,导入大肠杆菌中,经诱导表达完成了其原核的表达。该小分子抗体具有特异结合vWF-A3区的能力。(2)成功地构建了SZ-123单链抗体基因真核表达载体pSectagSZ-123ScFv,并转染到CHO细胞后,筛选出转染成功的单克隆细胞,完成了其真核的表达。(3)原核表达的单链抗体有较弱的抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。真核表达的单链抗体具有抑制胶原与vWF结合和抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的功能,但与单抗SZ-123相比,其活性有所下降。(4)SZ-123单链抗体的制备和生物学功能研究有助于从蛋白质空间结构上解释单抗SZ-123的独特作用,同时也为进一步开发基于单抗SZ-123的抗栓药物以及为更加深入的研究血栓形成的机制和开发新的抗血栓药物奠定了基础。
初晓霞, 侯明, 朱媛媛, 彭军, 冀学斌[4]2005年在《人血小板功能抗体及其片段的识别》文中认为目的研究特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血小板膜糖蛋白(GP)特异性IgG抗体及其片段的免疫活性及对血小板聚集功能的影响。方法用改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原技术(MAIPA)检测84例慢性ITP患者血浆中抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ及GPⅥ自身抗体,比浊法血小板聚集试验筛选出自身抗体阳性并能抑制血小板聚集的患者,用蛋白A柱纯化其血浆IgG抗体并用胃蛋白酶制备F(ab′)2片段。检测纯化的IgG抗体及其酶切片段与血小板GP的结合活性及对正常人血小板聚集功能的影响。结果(1)84例ITP患者血浆中,48例(57.1%)抗GPⅡb/Ⅲa和/或GPⅠb/Ⅸ和/或GPⅥ自身抗体阳性,其中7例(14.6%)明显抑制了二磷酸腺苷、瑞斯托霉素或胶原诱导的血小板聚集;(2)纯化的IgG及F(ab′)2片段具有与相应血小板GP的结合活性;(3)4例患者纯化IgG及F(ab′)2片段具有抑制血小板聚集的功能。结论F(ab′)2片段是IgG自身抗体的功能片段,它不但保留了良好的抗原结合活性且可部分抑制血小板聚集功能,为人源化血小板糖蛋白特异性抗体的制备奠定了基础。
江淼[5]2003年在《抗活化血小板表面受体全套单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选》文中认为本研究从活化血小板免疫小鼠的脾淋巴细胞中分别克隆出小鼠免疫球蛋白的重、轻链可变区(V_H和V_L)基因，将V_H和V_L在体外拼接成单链抗体(ScFv)基因后转入噬菌体载体，使单链抗体分子展示在噬菌体表面，从而成功构建了抗血小板表面受体全套单链抗体噬菌体展示文库。以血小板膜表面数种受体糖蛋白(GP)Ⅱb、Ⅲa、Ⅱb／Ⅲa复合物及重组凝血酶受体PAR-1(rPAR1)为靶抗原从该文库中筛选各自的特异性单链抗体。靶抗原GPⅡb、GPⅢa、GPⅡb／Ⅲa以亲合层析方法从血小板裂解液中提取，rPAR1以重组蛋白的形式在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然PAR-1分子相似的活性和功能。 从文库中筛选出的单链抗体克隆经测序证实符合抗体可变区结构特点，对其中抗rPAR1的单链抗体克隆APAR31进行了表达，得到了有抗原结合能力的单链抗体分子，同时也证实了所建噬菌体文库的有效性。上述工作为噬菌体展示技术在血栓与止血领域的应用奠定了基础。
安广宇, 董宁征, 白霞, 阮长耿[6]2001年在《抗血小板膜糖蛋白单抗SZ-21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究》文中研究指明目的为降低抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21的免疫原性,克隆了SZ-21可变区基因,构建并表达人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。方法利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系SZ-21克隆出轻、重链可变区基因,然后亚克隆到质粒pSW1中,构建成人-鼠嵌合Fab片段基因质粒pSZ-21,在大肠杆菌中表达。结果pSZ-21基因构建正确,在大肠杆菌中表达出可溶性抗体片段,表达产物具有与血小板结合的活性。结论成功地克隆了SZ-21可变区基因,并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。
戴克胜, 安广宇, 阮长耿[7]2002年在《抗血小板膜糖蛋白Ⅰbα/Ⅲa双特异单链抗体的构建及其功能研究》文中提出目的 构建、表达抗血小板膜糖蛋白 (GP)Ⅰbα GPⅢa双特异单链抗体 ,为其进一步研究、应用奠定基础。方法 应用PCR技术 ,扩增出接头片段和SZ 2 1单链抗体基因 ,克隆入pUCm T载体 ,测序分析。应用基因重组技术将接头片段、SZ 2 1单链抗体基因和SZ 2单链抗体基因重组拼接 ,构建SZ 2 SZ 2 1双特异单链抗体表达载体pET2 2 2 1 L 2scFv,并测序验证。导入大肠杆菌BL2 1 (DE3)Plys,诱导表达。流式细胞术、ELISA、Western印迹检测SZ 2 SZ 2 1双特异单链抗体与血小板结合能力 ,瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究。结果 表达载体pET2 2 2 1 L 2scFv构建拼接正确 ;表达产物以包涵体形式为主 ,表达量占菌体总蛋白的 1 4 % ;表达产物具有与血小板以及血小板GPⅠbα和Ⅲa结合的活性 ,可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集 ,此作用呈剂量依赖性。结论 成功表达了SZ 2 SZ 2 1双特异单链抗体 ,该抗体具有与相应 2个靶抗原结合的活性 ,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集
胡思怡[8]2006年在《重组基因工程抗体和蛇毒C型凝集素类似蛋白在毕赤酵母中表达及结构功能研究》文中指出巴斯德毕赤甲醇营养型酵母(Pichia Pastoris)属于低等的真核表达系统，与其他表达系统相比，具有遗传操作简单、蛋白折迭和二硫键加工能力较强、易于高密度发酵、蛋白表达量较高等优点，已经成为重组蛋白研究和商业化生产的重要表达系统之一。本论文讨论了抗ErbB2基因工程抗体和重组蛇毒毒素蛋白在毕赤酵母中表达，以及结构和功能关系研究中，主要包括以下叁部分内容： 1．密码子优化的抗ErbB2单链抗体在Pichia中表达、纯化和活性鉴定。ErbB2／HER2／P185属于具有酪氨酸激酶的表皮生长因子受体家族，在细胞生长发育和组织分化中起到了重要作用，ErbB2过表达经常在细胞癌化和肿瘤发生中起关键的作用，因此成为肿瘤诊断和治疗的一个重要靶分子。本实验室研制了一株具有肿瘤生长抑制活性的抗ErbB2单克隆抗体mA21，并且构建和表达了工程化的单链嵌和抗体chA21。本研究就是在前期工作基础上合成了密码子优化的单链抗体scFv全基因，并且在Pichia酵母中获得了高效表达，进一步优化表达条件后单链抗体表达量达到了10mg/L。单链抗体经Ni2+亲和柱一步纯化后，即可用于晶体生长、亲和力测定等结构和功能研究。 2．抗ErbB2胞外区抗体A21的表位鉴定、晶体结构分析和抗肿瘤机理的初步研究。我们联合使用噬菌体随机肽库表面展示技术、抗原在原核系统中分段表达、抗原点突变扫描等实验精细测定了A21抗体识别的抗原表位和关键性残基。在蛋白质结构晶体实验室的帮组下解析了A21单链抗体2.1A分辨率的晶体结构。并且利用大分子对接软件，基于实验结果预测并验证了A21抗体与ErbB2抗原可能的相互作用模型。结果显示A21抗体主要识别ErbB2胞外区靠近N端I区的空间表位。我们还测定了A21抗体对肿瘤细胞株的增殖抑制活性、抗体的内吞作用、抗体对ErbB2磷酸化的影响、以及抗体诱导的ErbB2受体下调作用，进一步解释了A21抗体表位和抗体功能之间的联系。 3．重组蛇毒C型凝集素类似蛋白ACFI在Pichia酵母中表达、纯化和结构功能关系研究。蛇毒C型凝集素类似蛋白具有非常相似的二硫键连接的异二聚体结构，但是具有多种不同的生物学功能。ACFI是从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离到的一种可以与凝血因子结合的具有抗凝活性的C型凝集素类似蛋白。我们设计了一种新的共转化策略，使用两个不同抗生素选择标记的载体用于筛选ACFI两个亚基共表达的重组菌株。结果显示，重组ACFI亚基在Pichia酵母中单独表达时形成同二聚体，共表达时则可以形成异二聚体。重组ACFI具有与天然蛋白类似的凝血因子结合活性和抗凝活性，但是重组亚基却没有这些功能，说明ACFI两个亚基对维持其正常的生物学功能具有非常重要和不可替代的作用。我们的结果提示Pichia系统在蛇毒C型凝集素类似蛋白结构和功能关系的研究中具有重要的应用价值。
阮长耿[9]2004年在《单克隆抗体药物在抗血栓治疗中的应用》文中进行了进一步梳理正常人体拥有完善的生理性止血机制。在血管受损部位血小板发生粘附、聚集,凝血系统被活化,最终在损伤局部形成止血栓。血小板作为血栓的主要组成成份,在血栓形成中起着关键作用。
杨永昌[10]2003年在《抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 人—鼠嵌合抗体的研制》文中研究表明本课题的目的是从本室已经制备的抗人血小板GPⅡb／Ⅲa单克隆抗体中筛选出与血小板特异性结合最强且抑制血小板聚集最显着的一种抗体P140，进行人源化改构，在保留鼠源可变区的同时，引入人源恒定区，制备抗人血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的人-鼠嵌合抗体。以期成为用于临床治疗心脑血管疾病以及预防PCI术后“再狭窄”的有效药物。 通过间接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验，选取单克隆抗体P140，并从该抗体的杂交瘤细胞株(P140)中提取总RNA，通过反转录PCR得到抗体轻链基因和重链Fd段基因，以特定位点分别插入噬菌体抗体表达载体p3MH上，构建原核表达重组质粒p3MH／P140 κ-Fd，并在XLI-Blue菌中进行了原核表达。ELISA鉴定结果表明，表达上清中含有可溶性Fab抗体，并且能特异性地识别人血小板。进而对表达产物进行了亲合层析纯化。SDS-PAGE蛋白电泳、ELISA和Western blot的检测结果证明，P140Fab抗体的分子量约47kD，是鼠源性的Fab抗体，与人血小板能特异性结合，体外ADP诱导的血小板聚集试验证明，P140Fab抗体能明显抑制血小板的聚集，并且具有剂量抑制效应。 用RACE(cDNA末端的快速扩增)的方法，获得了完整的P140抗体重、轻链可变区基因，分别连接于带有前导序列的真核表达载体VH、Vκ上，分别构建了重、轻链嵌合抗体的真核表达载体VH／CP140和Vκ／CP140，共转染到CHO细胞中，进行瞬时表达。RT-PCR和ELISA检测证明，转染后宿主细胞有人-鼠嵌合抗体基因的转录，表达上清中含有人-鼠嵌合抗体CP140。随后将包括前导序列在内的鼠单抗P140可变区基因分别连接于不含前导序列真核表达载体PWS3上，构建真核重组表达载体PWS3-P140，转染CHO细胞，ELISA检测结果证明，表达上清中含有能与血小板特异性结合的人-鼠嵌和抗体，而且表达量明显提高。 结论：成功研制了一种新的功能性抗人血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的Fab抗体(P140Fab)；成功构建了抗人血小板嵌合抗体的真核表达载体并在CHO细胞中表达了一种新的特异性抗人血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的人-鼠嵌合抗体(CP140)。
参考文献：
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