朱姝[1]2004年在《天冬氨酸转氨酶分离纯化及其性质研究》文中认为天冬氨酸转氨酶可以催化芳香族氨基酸的合成和降解反应。本论文对大肠杆菌中的天冬氨酸转氨酶进行分离纯化,并对其酶学、动力学性质进行研究。首先通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析、离子交换层析等方法对天冬氨酸转氨酶进行分离纯化,比活提高84.164倍,得率为11.24%。同时通过SDS-PAGE电泳测得其亚基分子量约为43000Da左右。利用纯化后的天冬氨酸转氨酶进行酶学性质研究,确定该酶的最适反应温度为50。C,最适pH为8.5。然后对其动力学性质进行研究,因为该转化反应属于双底物、双产物转化反应,只能近似使用米氏方程,确定其表观米氏常数Km为16.705mmolL-1,表观最大反应速度Vmax为0.46639mmol·L-1·min-1。转氨酶的转氨反应机制都属于乒乓反应机制,因此采用乒乓反应机制对两步转氨反应进行研究,得出第一步转氨反应的米氏常数为8.28mmol·L-1,第二步转氨反应的米氏常数为14.677mmol·L-1 。由此可知在两步转氨反应中第二步转氨反应为限速反应。即辅酶由胺型转为醛型为关键反应步骤。因此推断在反应初始阶段,纯酶液中添加磷酸吡哆胺比添加磷酸吡哆醛能更快的促进产物的生成。由实验验证,反应10分钟后,添加磷酸吡哆胺的AspAT比添加磷酸吡哆醛的AspAT产物生成率提高了6.667%,120分钟后,提高率只有3.397%。本文采用聚丙烯酰胺作为包埋材料,在细胞固定化中存在五种影响因素:凝胶浓度、交联度、过硫酸铵浓度、TEMED浓度、含菌量。因此采取五因素,四水平的正交实验,确定细胞固定化的最适条件。由正交实验确定大肠杆菌固定化的最适条件为:凝胶浓度为15%、交联度为5%、过硫酸铵加入量为400 μ L、TEMED加入量为60 μL、5%菌悬液加入量为2mL。同时测得固定化细胞表观米氏常数为10.90109mmol·L-1,最大反应速度为0.06181 1mmol·min-1。对游离细胞进行动力学常数测定,得出表观米氏常数为8.7848mmol·L-1,最大反应速度为0.352mmol·min-1。将游离酶,游离细胞,固定化细胞的米氏常数和最大反应速度进行比较,游离酶的最大反应速度高于游离细胞的最大反应速度:且游离细胞的最大反应速度高于固定化细胞的最大反应速度。由于细胞的固定化,影响传质效应,同时内扩散阻力会影响底物分子进入细胞进行反应,因此固定化细胞4
陈琪[2]2003年在《双水相萃取天冬氨酸转氨酶及其酶学性质初步研究》文中研究指明天冬氨酸转氨酶是苯丙酮酸转氨酶法制备L-苯丙氨酸路线的关键酶，本实验室所开发的该工艺路线已经初步实现了规模化生产，但由于采用游离细胞转化，酶转化的产物与副产物的积累仍无法满足低成本生产的要求，有必要通过酶的纯化获得较纯的酶液进行系统研究，为促进该路线的工业化进程提供基础数据。本文以产天冬氨酸转氨酶的大肠杆菌为研究对象，考察并选择了细胞破碎的最优方法，对破碎离心所得到的粗酶液采用双水相萃取技术进行分离纯化确定最佳体系与最佳参数，详细考察了天冬氨酸转氨酶的酶学性质以及影响转化性能的各因素，为更好的利用该酶进行产业化生产打下了良好的基础。本实验分别考察了化学破碎法、高压匀浆法和超声波破碎法对E.coli的破碎效果，综合考虑破碎后菌悬液光密度、酶活以及批次处理量，选定超声波破碎法为最佳破碎方法。对影响超声波破碎的各因素进行考察，得到超声波破碎的最佳条件是：批次处理量为100mL，破碎时间为20min，破碎功率为700W。实验研究了不同的双水相体系对天冬氨酸转氨酶的萃取分离效果，对聚乙二醇/无机盐成相系统的进行了系统的研究，初步确定PEG1000/ Na2HPO4为研究体系，并考察体系pH值、无机盐对双水相体系分配系数和纯化系数的影响。当PEG1000的质量分数为18％、Na2HPO4的质量分数为20％时，双水相体系对天冬氨酸转氨酶的分离系数和纯化系数分别为2.36和2.94，单批次酶活收率为88.6％。通过对双水相萃取所得的酶液进行系统的酶学性质考察，得到该酶的最适反应温度为45℃，最佳反应pH范围在8.5～9.0之间，Mg2＋、Mn2＋为天冬氨酸转氨酶的激活剂，Cu2＋是抑制剂。通过实验证明，转化体系内含有的少量苯丙酮酸类似物对产物L-苯丙氨酸的生成无明显影响；粗酶液中所含杂酶对苯丙酮酸的有一定的降解作用；粗酶液中所含杂酶对体系中生成的L-苯丙氨酸、丙酮酸均有较大程度的降解作用，从而影响了产物及副产物的积累；无机盐对天冬氨酸转氨酶有抑制作用，应尽量降低反应液中的盐浓度。
余进海[3]2018年在《天冬氨酸转氨酶催化合成ACEI关键手性中间体的研究》文中研究说明非天然氨基酸3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸(3,4-Dimethoxy-L-phenylalanine)和L-高苯丙氨酸(L-Homophenylalanine,L-HPA)是合成多种药物尤其是血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)的关键中间体。目前化学法制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸和L-高苯丙氨酸的路线中需要大量金属催化物,有毒反应物,反应步骤繁琐,成本较高。而酶法合成过程中需要加入NADH等辅酶或者需要使用两种酶进行级联催化反应,过程较复杂,酶催化效率不高,催化底物浓度较低。本实验围绕如何经济,高效,绿色制备重要医药中间体3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸和L-高苯丙氨酸展开,合成了一系列酮酸底物,利用易错PCR的方法对野生型AspAT进行改造,得到对底物3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化活性明显提高的突变体10b,75c,261b,478c,369c。将筛选得到的5个突变体分别催化5个酮酸底物,发现突变体对其他酮酸底物的催化活性普遍高于野生型AspAT。挑选出活性提高最明显的突变体75c,以3,4-二甲氧基苯丙酮酸为底物,进一步研究其相关的酶学性质。结果表明,对比野生型AspAT,突变体75c对底物的亲和力以及催化效率均显着提高。通过对突变体的氨基酸序列对比,得出316位的精氨酸被组氨酸取代时活性最高,推测芳香族残基可以促进酶与底物之间的π-π相互作用从而提高酶的转化活性。同时采用柱前衍生的方法,分析酶催化产物的光学纯度,得出突变体75c中的突变位点不影响产物的构型,所有苯丙氨酸衍生物的ee%>99%。同样,利用易错PCR的方法定向进化野生型AspAT,以2-氧代-4苯基丁酸为底物筛选突变体,得到催化活性提高1.73倍的突变体22。动力学研究表明,突变体22的Km值下降了 10.2倍,kcat提高2.4倍,kcat/Km提高了 24倍,表明突变体22对底物的亲和力以及催化效率均显着提高,且突变体22中的突变位点不影响产物的手性中心,产物ee%值>99%。优化了突变体75c和22的全细胞催化反应条件,进行中试放大实验,并成功制备了重要中间体L-3,4-二甲氧基苯丙氨酸和L-高苯丙氨酸。成功建立了酶法-化学法偶联合成莫西普利和喹那普利重要中间体的工艺路线。
陈琪, 周华, 孙广海, 韦萍[4]2004年在《双水相体系萃取天冬氨酸转氨酶》文中认为研究了不同的双水相体系对天冬氨酸转氨酶的萃取分离效果,对聚乙二醇/无机盐成相系统进行了系统的研究,初步确定PEG1000 Na2HPO4为研究体系,并考察体系pH值、无机盐对双水相体系分配系数和纯化系数的影响。当PEG1000的质量分数为18%、Na2HPO4的质量分数为20%时,双水相体系对天冬氨酸转氨酶的分离系数和纯化系数分别为2 36和2 94。
王佳[5]2016年在《人线粒体天冬氨酸转氨酶结晶及晶体结构研究》文中认为人线粒体型天冬氨酸氨基转移酶(Human mitochondrial aspartate aminotransferase, hmAspAT)是一种兼职功能蛋白,也就是具有两种以上不同的蛋白质功能。该酶参与人体内谷氨酸、犬尿喹啉酸和长链脂肪酸等的代谢途径。研究发现,线粒体中的谷氨酸代谢异常与肿瘤细胞的异常增长相关；中枢神经系统中的犬尿喹啉酸代谢异常与阿尔兹海默氏症和帕金森氏症等疾病相关；长链脂肪酸的代谢异常与糖尿病等代谢疾病相关。可见,该酶与很多疾病相关联,其结构与功能的研究具有十分重要的意义。利用X射线晶体学解析该酶结构的前提是获得hmAspAT的结晶体。为此,本论文对于hmAspAT的结晶条件以及晶体结构进行了研究,为后续的应用做铺垫。从hmAspAT的重组制备到该酶结晶条件的筛选和优化,及最后的晶体结构分析,这一系列的研究内容和结果如下：(一) hmAspAT的重组制备和性质表征从菌保中提取含有hmAspAT基因的载体pET22b-hmAspAT。将载体转化到大肠杆菌重组表达菌株E. coli BL21(DE3)中,经过PCR检菌筛选出阳性菌株E. coli BL21(DE3)/pET22b-hmAspAT。经过IPTG诱导表达目标蛋白,由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可知目标蛋白存在于菌体破碎离心后得到的上清液中。通过镍离子金属螯合亲和层析分离菌体破碎后的上清液,用100 mM咪唑浓度洗脱杂质后,直接用300 mM咪唑浓度洗脱得到目的蛋白,然后选用阳离子交换层析,经SDS-PAGE电泳和Western Blot验证得到电泳纯的目的蛋白。该酶的最适温度为47.5℃,最适pH值为8.5。最后得到的浓缩后样品蛋白浓度是6mg/ml,比活为36.3 U/mg,纯化倍数是26.8倍,活力回收率为19.4%。(二) hmAspAT结晶条件的筛选和优化利用Hampton Research公司的5种晶体试剂盒进行了hmAspAT的晶体生长条件的筛选工作。首先确定该酶适于结晶的浓度为5 mg/mL,蛋白质的缓冲液为20 mM Tris pH 7.0,20mM NaCl。随后从试剂盒中初步筛选出能够使该酶晶体生长的条件,即IndexTMkit试剂盒中第39号结晶条件,0.1 M HEPES pH 7.0,30%(v/v) Jeffamine(?) ED-2001 pH7.0。进一步优化该结晶条件,调整pH值及浓度,最终确定适于人线粒体天冬氨酸氨基转移酶晶体的生长条件为0.1 M HEPES pH 6.8,25%(v/v) Jeffamine(?) ED-2001 pH 6.8。并获得了该酶的晶体,捞取后放入甘油和结晶缓冲液配制的保存剂,在液氮中保存,用于后续X射线衍射研究。(叁) hmAspAT晶体结构的分析hmAspAT晶体经过X射线衍射后得到衍射图谱,并收集到衍射数据。通过数据分析处理,获得该酶的晶体结构。晶体衍射分辨率达到2.99 A,空间群为P1,晶胞参数为a=56.7 A,b=76.1 A,c=94.2 A,α=78.0°,β=85.6°,γ=78.4°。获得的酶晶体结构已经上传至PDB数据库中,标识符为5AX8。经研究,人线粒体型天冬氨酸氨基转移酶获得了电泳纯度的可溶性表达,并筛选出了适合该酶晶体生长的结晶条件,X射线衍射解析出的晶体结构收录在PDB数据库中。
张宏娟[6]2013年在《生物催化合成α-氨基酸和手性胺医药中间体研究》文中进行了进一步梳理生物催化是高效的温和催化体系,具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。尤其近年来,基因组学、蛋白质组学等生物技术的飞速发展,大大推动了生物催化的基础和应用研究。目前,利用生物体系(如各种细胞和酶)作为催化剂催化合成手性化合物己成为有机合成化学的研究热点以及生物有机化学和生物技术研究的新生长点。本论文采用生物催化方法制备一些重要生理活性的手性化合物,以谷氨酰转移酶、天冬氨酸转氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶为研究对象,结合酶的特性,在天然底物研究的基础上,选择一些非正常底物进行酶催化研究,并通过这些研究揭示酶-底物的催化机制。本论文为高效高选择性合成这些手性化合物提供了新方法,并为它们的进一步研究奠定了基础。为了能够使γ-谷氨酰转移酶催化合成重要的γ-谷氨酰化合物,对酶催化机制进行了研究。制备了十个γ-谷氨酰苯胺类似物,以它们为γ-谷氨酰基供体,乙胺为Y-谷氨酰基受体,经酶催化合成茶氨酸,通过HPLC测定茶氨酸生成量来评价酶活性。以L-γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物,对酶转化条件如pH、温度、底物摩尔比等进行优化。在最优转化条件下,分别酶催化十个γ-谷氨酰苯胺类似物形成茶氨酸,测定这些酶转化反应动力学常数,并转换成Hammett方程,结合Hammett曲线表明,γ-谷氨酰转移酶限速酰化反应步骤的反应速度能被吸电子或供电子取代基取代的Y-谷氨酰苯胺类似物加速,此步酰化反应受到动力学酸催化,通过autodock计算模拟,Asp-433羧基或者Tyr-444酚羟基可能是此酸质子来源,此酸质子的进一步确定还需通过实施定点突变。采用γ-谷氨酰转移酶催化合成β-N-(γ-L(+)-谷氨酰)苯肼以及β-N-(γ-L(+)-谷氨酰)对羧基苯肼。合成谷氨酰苯肼最佳反应条件为：配制pH9的转化液,底物浓度为60mM L-谷氨酰胺,300mM苯肼,加入40Uγ,-谷氨酰转移酶/ml,37℃反应6h,底物转化率高达93%；蘑菇氨酸的合成前体,谷氨酰对羧基苯肼最佳反应条件为：50mM L-谷氨酰胺,500mM对羧基苯肼,40U γ-谷氨酰转移酶/ml,pH8、37℃反应24h,产物转化率达90%。虽然苯肼曾被报道为泪腺过氧化酶的自杀性抑制剂,但是苯肼只有在高于300mM浓度时才会可逆性抑制谷氨酰转移酶,而对羧基苯肼即使在1000mM也不会出现抑制现象。这种新的谷氨酰转移酶催化合成方法将有助于合成蘑菇氨酸等重要的谷氨酰化合物,并进一步促进它们的深入研究。光学纯手性胺是一类有重要价值的医药及精细化工中间体,对手性胺类化合物的不对称合成进行更深层次研究具有较大的经济效益和应用价值。目前手性胺的主要制备方法有化学合成、化学及酶法拆分以及酶催化合成,其中酶催化合成更具有优势。本论文以天冬氨酸转氨酶、联用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化合成手性胺及氨基酸。为了更好地了解这些酶的特性,化学合成了8个α-酮酸,天冬氨酸转氨酶对苯丙酮酸钠和邻甲氧基苯丙酮酸钠的转化率较高,邻羟基苯丙酮酸钠和对二甲氨基苯丙酮酸钠的活性则较差；而对于烷基取代α-酮酸,5-甲基-2-酮基已酸钠和4-甲基-2-酮基戊酸钠的转化活性比另外两个烷基取代酮酸好,其最高转化率约为苯丙酮酸钠的60%。另外,本论文还采用天冬氨酸转氨酶催化间羟基苯乙酮合成卡巴拉汀的手性胺中间体3-(1-氨基乙基)苯酚,但天冬氨酸转氨酶催化合成此化合物的能力有限,在加入10%DMSO情况下,其最高转化率不超过40%。联用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶可制备手性胺化合物。本论文构建了亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶大肠杆菌基因工程菌,将这两种酶联合运用,以上述α-酮酸为底物,考察了反应条件pH、温度、辅酶NAD用量对酶活性影响,在pH9、30℃、1mM NAD的优化条件下,烷基取代α-酮酸反应良好,24h的转化率均在90%左右。除苯丙酮酸钠外,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶对苯环取代α-酮酸的催化活性都很低。本论文立足于酶催化合成手性化合物,结合基因工程手段重组表达生物酶,为手性化合物的合成拓宽了思路,具有重要的理论意义和应用潜力。
徐凡, 吴媚[7]2013年在《烟草谷草转氨酶纯化及部分酶学性质分析》文中指出采用硫酸铵沉淀,Sephadex G-100层析和DEAE-Sepharose纯化烟草中的谷草转氨酶(GOT),并对酶的最适温度、最适pH值和金属离子对酶活力的影响等进行了研究。结果表明,该酶最适反应温度为37℃,最适pH范围为8.5~9.0,Mn2+、Zn2+,Fe2+对GOT起激活作用,最佳氨基供体为L-天冬氨酸,酶促反应的Vmax为0.575μmol/L.min,L-天冬氨酸和a-酮戊二酸的米氏常数分别为0.929μmol/L和0.105μmol/L;研究还表明,GOT不能催化吡哆胺转变为吡哆醛,证明在植物体内有另外一种转氨酶催化该反应,为植物体内VB6代谢途径的进一步研究提供了依据。
邵楠, 王虹, 李荣贵[8]2009年在《荧光假单胞菌天冬氨酸转氨酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达》文中研究说明采用克隆基因测序技术,从荧光假单胞菌GcM5-1A基因组文库中筛选到了天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因,插入pET-15b构建重组表达质粒pET-15bAAT,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中高效表达,利用亲和层析法初步分离纯化了重组蛋白。生物活性分析表明,纯化的重组天门冬氨酸转氨酶具有氨基转移活性。
朱芳莹[9]2015年在《生物催化法合成西他列汀手性中间体的研究》文中进行了进一步梳理西他列汀是第一个用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM或Ⅱ型)的二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制剂类新型降糖药物,由FDA批准在2005年上市。临床试验数据显示,西他列汀在单一治疗和与其他降糖药物配合治疗中都表现出良好的安全性和稳定性。药用形式为其水合磷酸盐,作为治疗Ⅱ型糖尿病的新型药物,西他列汀具有重要的市场前景。西他列汀的合成关键在于手性胺的构筑,从西他列汀前体酮合成西他列汀手性胺的方法主要分为以金属铑化物和配体不对称氢化烯胺为关键步骤、多步合成的化学法和生物酶法。其中生物酶法合成工艺具有反应条件温和、环境友好、选择性高及反应步骤短等优点,符合“绿色化学”的要求,因此受到广泛关注。本论文围绕生物酶法催化合成西他列汀手性胺的工艺路线展开研究,包括生物催化剂的筛选、制备、催化应用及产物西他列汀的分离提取等。ω-转氨酶在手性胺的不对称合成中具有重要的应用价值,本论文从实验室菌种保藏库中筛选出8个R-ω-转氨酶工程菌,对8种R-转氨酶逐一验证发现转氨酶ATA-1对底物西他列汀前体酮具有催化活力,经LB培养基摇瓶发酵,酶活达到2592.17 U/L,比酶活为308.59U/g。接着对转氨酶的酶学性质进行研究,转氨酶经Ni柱亲和层析分离纯化后,SDS-PAGE结果显示达到了电泳纯,其最适宜的转化pH值范围在8.0~9.0,在pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0半衰期分别为144 h、173 h、119 h,说明转氨酶的pH稳定性较好。该酶的最适反应温度为45℃(由酶活力、酶的稳定性和底物稳定性叁者共同决定),在40℃和45℃半衰期分别为42.18 h和34.68 h。重组转氨酶对金属离子和EDTA无明显的依赖作用,但高浓度的Zn~(2+)、Cu~(2+)和Ni~(2+)会严重抑制酶活。第叁章对工程菌ZJB ATA-1的产酶条件进行了研究。通过单因素优化法和响应面优化法得出菌株最佳的培养基组分:甘油11.94 g/L、酵母粉6.92 g/L、蛋白胨6.15 g/L、NaCl 10 g/L、K_2HPO_4 4 g/L。对培养条件进一步优化得出:接种量1%~2%,37℃摇床培养,培养至菌体浓度OD_(600)00 0.6~0.8(约2 h)时,添加IPTG诱导转氨酶表达,IPTG终浓度为1 mM,28℃诱导培养16 h,产菌体量达到1.04%,酶活为3834.23 U/L,比酶活为368.67 U/g。在5 L发酵罐中对重组ZJB ATA-1进行了放大培养。论文研究了酶法催化西他列汀前体酮合成西他列汀手性胺的过程。首先确定了底物添加方式和反应过程中的控制参数:将底物溶解在助溶剂二甲基亚砜(DMSO)中,在2~3 h内通过蠕动泵管路缓慢流加进入反应釜,反应温度45℃,流加4 M异丙胺控制反应pH恒定于8.5。对底物浓度、转氨酶用量和辅酶(磷酸吡哆醛)用量进行了优化,其最佳条件为:底物西他列汀前体酮浓度50 g/L,湿菌体的用量为100wt%底物(即50 g/L),辅酶浓度1 mM,搅拌转速600 rpm,在此条件下,产物西他列汀的产率可达99%以上,产物e.e.值均大于99%。建立从反应液中分离提取产物的工艺路线。选择12 M HCl终止反应,离心去除细胞沉淀。反应液pH调节至11,选择乙酸异丙酯作为萃取剂用于产物西他列汀的提取。为了提高产物的收率,叁次萃取碱化后的反应液。萃取液减压蒸馏至粘稠状棕色液体,室温干燥获得白色粉末状沉淀,即为产物西他列汀。乙醇溶解,加入磷酸,60℃反应10 min,冷却结晶获得磷酸西他列汀。利用上述条件,对1 L反应液中的西他列汀进行提取,最终得到46.1 g西他列汀,反应总收率为92.2%。
王怡倩[10]2009年在《深海热液区嗜热菌噬菌体D6E的分子特征及GVE2与宿主的蛋白质互作研究》文中进行了进一步梳理海洋占整个地球表面积的71％，多样性的生态环境蕴藏着丰富的生物资源。深海热液口是地球上一个极其恶劣的生存环境-高温、高压、缺氧、含有大量有毒的化学物质，但是其中及其周围却存在着一个完整的生态系统。噬菌体被认为是地球上最丰富的生命体，几乎可以在地球上的每个生态环境中找到，同样也暗示着它们在微生物多样性和生态平衡上发挥着重要作用。嗜热菌作为深海热液口生态群落的初级生产者，是推动营养和能量循环的主要动力。噬菌体是一类特殊群体，它们寄生在细菌体内，根据环境变化发生溶原或者裂解，从而引起宿主菌在整个生态群落中的分布。由于深海热液口在地理分布上具有一定的独立性，所以噬菌体与宿主的关系直接影响着整个热液口生态群落的存在和结构。随着基因组测序技术的发展，越来越多的噬菌体基因组信息添加到基因组数据库中，这为噬菌体生物信息学研究提供了大量的数据，不仅包括噬菌体序列之间的分析，还有利于研究噬菌体群体之间的结构组成。噬菌体的基因组虽然很小，但是却编码了自身复制所需的蛋白，如DNA包装蛋白、头尾结构蛋白、DNA复制相关蛋白、转录调控蛋白、裂解相关蛋白等。通过比较基因组学，可以得到大量的基因多样性数据，同时发现基因组之间存在着非常明显的序列相似性。这些序列可以通过同源或者点特异性重组促进噬菌体基因模块发生互换；或者，通过非定向的遍及整个基因组发生非同源重组。在本论文中，通过各种筛选培养基对深海热液区样品中的嗜热菌和高温噬菌体进行了分离、纯化，并得到了4株高温噬菌体，对其中的高温噬菌体D6E进行了进一步研究。结果表明，高温噬菌体D6E为肌尾科病毒，有二十面体的头部，长长的尾巴和尾丝。经测序，D6E基因组有49335 bp，为双链环状DNA，可以编码49个预测有功能的蛋白。和其它噬菌体一样，D6E的基因排列也是成簇分布的，按功能可以分为四个部分：DNA包装和头部装配、尾部组成、溶原与裂解、DNA复制和转录。通过在NCBI数据库中进行比对分析发现，D6E的大部分结构相关蛋白与已知噬菌体蛋白的同源性非常低，但是溶原和裂解相关基因以及DNA复制和转录相关基因的核苷酸序列与本实验室另外一株已测序的高温噬菌体GVE2不管在基因排列、还是这些基因编码的氨基酸序列上都具有非常高的相似性。采用蛋白质组学技术，对D6E病毒粒子的蛋白质组进行了分析，结果得到了10个与结构相关的蛋白，包括核衣壳蛋白、入口蛋白、支架蛋白等，其中质谱匹配率非常高的两个未知蛋白ORF3(第3条带)和ORF16(第9条带)的功能有待进一步研究。根据本实验室分离获得的深海嗜热菌噬菌体GVE2基因组测序结果和预测阅读框分析，重组表达并纯化了20个GVE2蛋白，制备相应的多克隆抗体，采用Western Blot对噬菌体的基因表达进行了分析。通过免疫共沉淀(Co-IP)和GST下拉(GST pull-down)试验寻找在感染过程中GVE2与宿主可能发生相互作用的蛋白。通过实验，得到了两种蛋白复合体：与GVE2 ORF5(核衣壳蛋白，VP371蛋白)相互作用的分子伴侣蛋白；与GV2 ORF36相互作用的未知蛋白。本实验室前期工作中发现宿主的天冬氨酸转氨酶和分子伴侣蛋白参与了噬菌体的感染过程，因此，本试验进一步研究噬菌体GVE2 VP371蛋白与宿主天冬氨酸转氨酶和分子伴侣形成的蛋白复合体在噬菌体感染中的作用。Western blot和细菌双杂交试验结果显示，VP371蛋白和分子伴侣蛋白之间、分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶之间存在相互作用，而VP371蛋白和天冬氨酸转氨酶之间没有相互作用，复合体中3个蛋白呈串联结构结合在一起。在噬菌体感染实验中我们发现，随着感染时间的增加，VP371的转录表达量逐渐增大，同时分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶都比未感染时有了明显上调表达。因此，在噬菌体感染过程中，GVE2核衣壳蛋白VP371和宿主的分子伴侣蛋白发生相互作用，并依次递进促进了分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶的上调表达，从而进一步调控了宿主细胞的代谢活动。本论文对对高温噬菌体GVE2的ORF3(入口蛋白)和ORF56(胸腺嘧啶合成酶)进行了功能鉴定。ORF3预测为噬菌体入口蛋白，虽然在氨基酸序列上它与其他噬菌体具有很低的同源性，但与SPP1、HK97的入口蛋白都具有相似的螺旋／折迭排列结构，属于HK97入口蛋白家族，在DNA包装过程中发挥着相同的功能。预测二级结构分析发现，GVE2同SPP1和Phi29都具有非常保守的α-Helices，可能是在基因组包装过程中保留下来的一种古老结构域。通过免疫电镜定位，结果表明入口蛋白位于头尾的连接处。Orf56编码原核型的胸腺嘧啶合成酶，与已知的不同物种的胸腺嘧啶合成酶有很高的相似性。ORF56中可以找到符合胸腺嘧啶合成酶的活性中心的保守序列，还具有五个非常保守的motif，包括叶酸结合位点、催化活性中心、dUMP-结合位点、质子转运位点和功能待定区域。通过体外结合试验，结果发现ORF56编码的蛋白可以与其自身mRNA结合。
参考文献：
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