李颖 邸红莲*
保定市第一中心医院071000
摘要：目的 探讨补肾活血中药血清对体外缺氧条件下纯化培养的视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用及其机制。方法 选取出生1d的新生乳鼠30只，采用“两步筛选法”纯化培养SD新生乳鼠视网膜神经节细胞（RGCs）,选取出生7d的SD大鼠6只，采用“改进的酶消化法”纯化培养新生SD大鼠视网膜Muller细胞，然后按照1:25的比例将RGCs接种于被视网膜Muller细胞包被的培养基中建立共同培养模型，在体外培养基中分别加入葡萄糖（50mmol?L-1）和连二亚硫酸钠（1.0mmol?L-1）(高糖缺氧组)；仅加入葡萄糖（50mmol?L-1）（高糖组）；加入连二亚硫酸钠（1.0mmol?L-1）（缺氧组）；在上述基础分别加入制定好的20%体积分数的补肾活血中药血清进行干预，分别测定24、48、72h培养模型外液中的乳酸脱氢酶（LDH）漏出量和谷氨酰胺合成酶（GS）活性。结果 补肾活血中药可以明显降低高糖、缺氧条件下RGCs细胞LDH漏出量及提高视网膜Muller细胞GS活性 结论 高糖或缺氧条件下可以造成RGCs、视网膜Muller细胞的细胞膜稳定性变差，通透性增加，补肾活血中药可以改善细胞膜的稳定性，提高GS的活性，从而达到保护RGCs细胞的目的。
关键词：补肾活血中药；缺氧；视网膜神经节细胞；视网膜Muller细胞
【中图分类号】R285 【文献标识码】A
1 材料与方法
1.1实验动物
视网膜Muller细胞实验动物：选取健康标准出生7d试验SD大鼠6只，不限雌雄，双眼未睁，符合国家医用动物一级试验标准，清洁级。由湖北中医药大学动物实验室提供（动物许可证号：HB2004013），饲养环境安静，12h光照，环境温度20～25℃，湿度：55%～75%。
RGCs细胞实验动物：选取出生1d的SD新生乳鼠30只，不限雌雄，符合国家医用动物一级试验标准，清洁级。由湖北中医药大学动物实验室提供（动物许可证号：HB2004027）。
补肾活血中药血清实验动物：标准实验用SD大鼠8～12只，体重150～180g，不限雌雄，符合国家医用动物一级试验标准，清洁级，采用全价鼠颗粒饲料。由湖北中医药大学动物实验室提供（动物许可证号：HB2004027）。
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1.2实验仪器与药品
胎牛血清（北京基尼亚生物技术有限公司），胰蛋白酶（上海甄准生物科技有限公司），DF12培养基（南京奥多福尼生物科技有限公司），PBS（上海博谷生物科技有限公司），青霉素钠盐（上海远慕生物科技有限公司），硫酸链霉素（上海远慕生物科技有限公司），碳酸氢钠（分析纯）(上海榕柏生物技术有限公司)，醋酸（分析纯）(上海榕柏生物技术有限公司厂)，D-葡萄糖（上海远慕生物科技有限公司），连二亚硫酸钠（分析纯）（上海远慕生物科技有限公司），小鼠抗大鼠SIRP—α单克隆抗体(ab34011，美国），小鼠抗大鼠Thy-1.1（克隆号：OX-7） Chemicon（美国），乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），K2045型台式多功能离心机（上海赛弗生物科技有限公司），美国精骐CO2恒温培养箱PYC-16（美国精骐有限公司），96孔细胞培养板(上海凌初环保仪器有限公司),低温冰箱(-20℃)（海尔），奥林巴斯光学相差显微镜CKX41（日本OLYMPUS公司），AB265-S电子天平（十万分之一,美国梅特勒公司），DGG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海巴玖实业有限公司），S433D 全自动氨基酸分析仪（德国Sykam公司）
1.3实验方法
对补肾活血中药血清实验动物组的SD大鼠使用中药或生理盐水灌胃7d后，采用体外两步法纯化培养SD乳鼠的视网膜神经节细胞，用免疫荧光染色法对培养的视网膜神经节细胞进行鉴定及补肾活血中药血清制备具体步骤参考文献，将视网膜神经节细胞置于培养板中培养72 h后分为正常对照组、缺氧组、正常中药干预组、缺氧中药干预组，分别于培养后24、48、72h测定各组细胞外液中Glu及Gly的浓度和各组细胞培养上清液LDH的漏出量。
1.4实验分组方法
将按照1:25比例培养好的细胞置于37℃5%CO2培养基中24h后，去掉含有20%胎牛血清的改良伊格尔培养基和Ham’s F12细胞培养基按照1:1 比例混合（DF12），换用无血清的DF12培养液培养24h，去掉无血清培养液，按照下列分组情况进行分组，并分别将每组细胞分为24h、48h、72h培养组。测定三个时点的相关指标。
正常对照组： 含20%正常SD 大鼠血清的DF12 液。
中药干预正常组：含20%中药SD 大鼠血清的DF12液。
高糖组：含20%正常SD 大鼠血清的DF12液+终浓度为50mmol?L-1 的葡萄糖。
中药干预高糖组：含20%中药SD 大鼠血清的DF12液+终浓度为50mmol?L-1的葡萄糖。
缺氧组：含20%正常SD 大鼠血清的DF12 +终浓度1.0mmol?L-1 的连二亚硫酸钠。
中药干预缺氧组：含20%中药SD 大鼠血清的DF12液+终浓度1.0mmol?L-1的连二亚硫酸钠。
高糖缺氧组：含20%正常SD 大鼠血清的DF12液+终浓度为50mmol?L-1 的
葡萄糖+终浓度1.0mmol?L-1 的连二亚硫酸钠。
中药干预高糖缺氧组：含20%中药SD 大鼠血清的DF12液+终浓度1.0mmol?L-1 的连二亚硫酸钠+终浓度为50mmol?L-1 的葡萄糖
1.5指标测定方法
分别收集各组分别收集各组培养基的上清液，用LDH试剂盒按照说明书步骤测定LDH的漏出量，置于20℃条件下3min后加样于细胞培养板中，以450nm波长处酶标仪检测后根据说明书公式计算结果。
1.6统计学分析
本研究采集的数据录入Excel2007版，统计分析在SPSS17.0中进行。计量资料以（ ±s）表示，两组间比较采用两独立样本的t检验，组内比较采用配对t检验， p<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1补肾活血中药血清对RGCs、视网膜Muller细胞LDH漏出情况的影响
在第48h、72h正常对照组、高糖组、缺氧组三组的LDH漏出量较第24h均有显著的增高趋势（p<0.05），正常对照组、高糖组、缺氧组、高糖缺氧组在同一时刻与各自对应的中药干预组比较，可以发现LDH漏出量均显著的高于各中药干预组（p<0.05）。
2.2补肾活血中药血清对RGCs、视网膜Muller细胞GS活性的影响
在第48h、72h正常对照组、高糖组、缺氧组、高糖缺氧组及其中药干预组的GS活性较第24h均有显著的增高趋势（p<0.05），正常对照组、高糖组、缺氧组、高糖缺氧组随着时间的延长其GS活性均显著的低于中药干预组。
3讨论
通过测定细胞培养液中LDH漏出量，可确定细胞膜的通透性和细胞活力。有研究显示，甘氨酸可通过降低细胞膜的通透性防止细胞内大分子物质流失，从而减少细胞损伤。本实验结果显示：随着时间延长，四组的LDH漏出量均呈逐渐增高趋势（p<0.05），而中药干预缺氧组和高糖缺氧组在72h时的漏出量均较48h时有所减少，但对高糖组LDH漏出量增加影响较小；同时正常对照组、高糖组、缺氧组、高糖缺氧组LDH漏出量均显著的高于在同一时刻各中药干预组（p<0.05），说明补肾活血中药含药血清对缺氧条件不良影响的改善程度较高糖条件更加明显。
综上所述，补肾活血中药可以明显降低高糖、缺氧条件下RGCs细胞LDH漏出量及提高视网膜Muller细胞GS活性，从而能够反映出其对RGC是细胞具有保护作用。
参考文献
1.马殿伟.补肾活血法对高糖/缺氧状态下视网膜神经节细胞保护作用及其机理研究[D].成都中医药大学:2011.
论文作者:李颖 邸红莲*
论文发表刊物:《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年6月第6期供稿
论文发表时间:2015/8/5
标签：血清论文; 中药论文; 细胞论文; 视网膜论文; 亚硫酸钠论文; 上海论文; 大鼠论文; 《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年6月第6期供稿论文;