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【摘要】 目的：建立尿囊素含量测定的HPLC方法。方法：采用Kromasil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以0.02mol·L-1的磷酸二氢钾溶液（用三乙胺调节pH为5.5）-甲醇（95:5）为流动相，流速0.8mL·min-1，检测波长224nm，柱温30℃，进样量10μL。结果：尿囊素与相邻杂质分离良好，浓度在0.1～0.5mg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9999,n=5），日内和日间精密度RSD均小于0.2%，在80%，100%，120%3个浓度下的平均回收率分别为99.9%（n=3，RSD=0.09%）、99.7%（n=3，RSD=0.11%）、99.8%（n=3，RSD=0.07%）。结论：本方法简单、准确度高、重复性好，可用于尿囊素的含量测定。
【关键词】尿囊素；含量测定；反高效液相色谱法
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）27-0388-02
1.仪器与试药
岛津液相色谱仪，SPD-20A检测器/LC-20AB泵，SIL-20A自动进样器；梅特勒XP105DR电子分析天平；pH-21酸度计。
尿囊素对照品（中国生物制品检定所，批号为111501-200202）。水为重蒸水，甲醇为色谱纯（TEDTA），磷酸二氢钾、无水乙醇、三乙胺及其他试剂均为分析纯。
尿囊素：江苏正大丰海制药有限公司，批号为131202、131206、131207、131208、131209、131210
2.方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为0.02mol·L-1的磷酸二氢钾溶液（用三乙胺调节pH为5.5）-甲醇（95:5）；流速为0.8mL·min-1；检测波长224nm；柱温30℃；进样量10μL；理论板数按尿囊素峰计算不低于2500。
2.2 溶液制备
2.2.1尿囊素对照品溶液 取尿囊素对照品（置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时以上）15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加热水10ml使溶解，放置室温，再用流动相定容至50ml，摇匀，即得。
2.2.2尿囊素供试品溶液 取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时以上的尿囊素供试品15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加热水10ml使溶解，放置室温，再用流动相定容至50ml，摇匀，即得。
2.3 方法学研究
2.3.1专属性和系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件注入液相色谱仪测定，记录色谱图，理论板数按尿囊素峰计算为4844，尿囊素与其相邻的杂质峰分离度为5.5。系统适用性符合规定。见图1。
图1系统适用性色谱图
Fig 1 Chromatogram of the system suitability of the HPLC method
2.3.2线性关系考察 取尿囊素对照品（置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时以上）50mg置50ml量瓶中，加热水适量使溶解，放置室温，用流动相定容至50ml，分别精密移取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成含尿囊素0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg·mL-1的系列对照品溶液。精密量取上述溶液各10ul注入液相色谱仪，每份溶液各进样2针，记录色谱图，以对照品浓度为横坐标，2次进样峰面积平均值为纵坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=7.0×106X+ 4.9×104（r=0.9999,n=5）。试验结果表明在0.1～0.5mg·mL-1浓度范围内线性关系良好，满足含量测定要求。
2.3.3供试品测定 取六批尿囊素样品（131202、131206、131207、131208、131209、131210）分别按照“2.2.2”项下分别平行制备2份供试品溶液，进样测定，计算尿囊素含量。将卫生部标准检测方法与本法测定结果进行比较，结果见表。
表 二种方法测定结果比较
3.讨论
3.1 波长的选择
以本文的流动相作为溶剂，对尿囊素在190nm～400nm波长内进行扫描，结果最大吸收为201nm,为末端吸收，但从峰形和吸收度两方面综合考虑，选择224nm 为检测波长。
3.2 pH的选择
0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液在未调pH的情况下，测得的pH为4.28。本试验比较pH分别调节为4.3、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0情况下对试验结果影响。结果：pH在4.3～5.3时，杂质峰响应值较小，与主峰分离效果差；pH在5.7～6.0时杂质峰响应值大，但与主峰分离效果仍然不好；pH在5.3～5.5时，峰拖尾因子、与杂质分离都符合规定，故pH选择5.5。
3.3 结论
本试验建立了反高效液相色谱法测定尿囊素含量的方法，并按中国药典2010年版二部附录中“药品质量标准分析方法验证指导原则”进行了方法学研究。比较了本法与卫生部标准1994年版方法测定结果，可看出二种方法测定结果的平均值的相对偏差均小于0.2%。HPLC法，简单快速，专属、准确、重现性好，在产品杂质含量高的情况下，对药品含量能更有效的控制。
【参考文献】
[1]卫生部标准1994年版.
[2]国家药典委员会.中国药典2010年版二部附录ⅪⅩ A药品质量标准分析方法验证指导原则.
论文作者:韩叶梅,徐曙东,江岚
论文发表刊物:《医药前沿》2016年9月第27期
论文发表时间:2016/10/9
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