黄国强[1]1985年在《抗人Ⅰ型和Ⅱ型胶原抗体在骨肿瘤病理中的初步应用》文中研究表明中国医学科学院 首都医科人学首者P医院博士研究生沱文骨科研究生黄国浅和币王桂生李二瑞王德修’一九，、五年四月一、引言
余世明[2]2012年在《CD147/EMMPRIN与转移性骨肿瘤中破骨细胞活化机制的相关研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的：骨组织是肿瘤晚期常见的转移部位，诸多恶性肿瘤晚期均易发生骨转移，其发生率要明显高于骨原发恶性肿瘤，其原发灶多来自前列腺癌、乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤的晚期。肿瘤骨转移后多以溶骨性骨破坏为主，为患者带来骨质疏松、病理性骨折、进行性骨痛、高钙血症、脊髓压迫综合征等并发症，显著降低患者的5年生存率，严重影响患者的健康及生活质量。肿瘤骨转移是由肿瘤-骨微环境中，一系列细胞因子所参与的恶性循环过程，包括肿瘤细胞、骨细胞及基质之间的相互作用，从而导致肿瘤生长及骨质破坏。破骨细胞（osteoclasts，OCs）作为骨破坏吸收的关键细胞，肿瘤细胞可通过多种途径及多种因素来促进其形成及异常活化来介导溶骨性骨破坏的发生，因此OCs作为研究及防治肿瘤骨破坏的关键点，我们将予以深入研究。CD147又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteaseinducer，EMMPRIN）与多种肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关。近年研究发现CD147能够诱导单核/巨噬细胞活化，并通过调节基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的产生，参与类风湿关节炎关节软骨、骨组织的降解破坏过程及牙周炎牙槽骨破坏过程。在乳腺癌的研究中发现当抑制CD147在乳腺癌细胞的过表达时，乳腺癌骨转移及骨破坏进程均得到有效延缓。因此我们相信在肿瘤骨转移及骨破坏过程中，可能有CD147直接或间接的参与，且经本实验组前期体外细胞研究发现CD147可高表达于OCs表面，并参与OCs的生成及活性调节。鉴于CD147发挥多种生物学活性均与其介导MMPs的产生密切相关，而MMPs又是OC活化过程中一种重要的调节因子，由此我们推测在肿瘤转移后的溶骨性破坏过程中存在着肿瘤细胞通过CD147激活OCs介导骨破坏的发生，其调节机制可能与MMPs的产生相关。因此本研究通过体外建立外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）向OCs分化成熟的模型，研究CD147与OCs分化过程中MMPs合成、分泌及活性调节的相关性，探讨CD147对OCs活化调节的机制和方式；通过检测转移性骨肿瘤临床标本中CD147的表达情况，及CD147与肿瘤骨破坏过程中OCs活化的关系，初步验证前期体外实验的结论，从而完善对CD147参与肿瘤骨破坏过程的认识，并为本课题组的下一步深入研究提供相关实验参考和理论依据。方法：1．Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，贴壁法纯化所分离的外周血单个核细胞；2．引入外源性巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)蛋白和细胞核因子κB受体活化因子配基(receptor or activator of NF-KB ligand，RANKL)蛋白诱导PBMCs向OCs分化，利用TRAP染色和骨吸收实验观察及鉴定诱导生成的细胞，并检测其骨吸收功能；3．实验分别分为第一部分两组[对照组（正常诱导组）和蛋白组]和第二部分两组[对照组（正常诱导组）和抗体组]；4．对诱导培养第12天的细胞，进行形态学观察及抗酒石酸的酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色鉴定，对与细胞共培养第30天的骨薄片，进行甲苯胺蓝染色，观察骨薄片表面骨吸收陷窝情况；5．Real-time PCR检测24h与48h时相点上OCs诱导分化过程中CD147mRNA、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）mRNA及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9） mRNA的表达情况，及分析三者的相关性；6.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测24h与48h时相点上OCs诱导分化过程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的表达情况；7.明胶酶谱法检测OCs在24h与48h分泌的MMP-2、MMP-9酶蛋白活性变化情况；8.免疫组化SP法检测转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白的表达情况；9．RT-PCR检测转移性骨肿瘤中CD147mRNA、MMP-2mRNA及MMP-9mRNA的表达情况；10.苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色及TRAP染色观察及鉴定转移性骨肿瘤标本中OCs的情况；11.免疫组化SP法初步检测CD147在转移性骨肿瘤标本中OCs内的表达情况；12.采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果：1．采用Ficoll密度梯度离心法，分离外周静脉血获得单个核细胞，并通过延长贴壁时间纯化细胞的方法，可以获得数量较多、纯度较好的单个核细胞，能够满足体外细胞实验需求；2．引入外源性RANKL蛋白和M-CSF蛋白能够诱导外周血单个核细胞生成TRAP染色阳性的单核或多核细胞，并具有骨吸收能力；3．TRAP染色结果示：蛋白组第12天TRAP（+）细胞数及体积显著高于对照组，且生成体积巨大的多核破骨细胞；抗体组第12天TRAP（+）细胞数及体积显著低于对照组，且未见多核破骨细胞形成。骨吸收实验结果示：蛋白组及对照组均形成明显的骨吸收陷凹；蛋白组形成大片状骨吸收陷窝，面积显著大于对照组；抗体组却未见骨吸收陷凹形成；4．Real-time PCR结果显示：24、48h时相点上蛋白组细胞CD147、MMP-2及MMP-9mRNA相对表达量均显著高于对照组（P＜0.05）；24h、48h时相点上抗体组细胞CD147、MMP-2及MMP-9mRNA相对表达量均显著低于对照组（P＜0.05）；两次实验中MMP-2、MMP-9mRNA的相对表达量与CD147mRNA的相对表达量均呈正相关关系[（R=0.818和R=0.758，P<0.05）,（R=0.525和R=0.552，P<0.05）]；5. ELISA检测结果显示：在24h与48h时相点上蛋白组细胞MMP-2及MMP-9酶蛋白的分泌量均显著高于相应的对照组（P＜0.05）；6.明胶酶谱法检测结果显示（酶蛋白活性以条带酶解量代表）：抗体组MMP-2、MMP-9酶原及活性酶条带的酶解量与对照组间比较具有显著差异（P＜0.05），且在24h、48h时相点上抗体组MMP-2、MMP-9酶原及活性酶条带的酶解量均显著低于相应的对照组（P＜0.05）；7.免疫组化SP法检测转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2及MMP-9蛋白的表达情况，结果示：CD147、MMP-2、MMP-9蛋白在转移性骨肿瘤中高表达，且显著高于良性骨肿瘤中的表达（P＜0.05）；8. RT-PCR检测转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2及MMP-9mRNA的表达情况，结果示：转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2及MMP-9mRNA的相对表达量均显著高于良性骨肿瘤（P＜0.05），且MMP-2、MMP-9mRNA的相对表达量与CD147mRNA的相对表达量均成正相关关系（R=0.795和R=0.956，P＜0.05）；9. HE染色及TRAP染色观察及鉴定转移性骨肿瘤标本中OCs的形态，结果示：转移性骨肿瘤组织标本中可见到多个多核巨细胞，分布于肿瘤组织与骨组织交界面的位置，经TRAP染色鉴定该多核巨细胞为TRAP染色阳性的破骨细胞；10.免疫组化SP法初步检测CD147在转移性骨肿瘤标本中OCs内的表达情况，结果示：CD147在转移性骨肿瘤标本内的破骨细胞胞浆及胞膜中，均呈现棕黄色的阳性反应。结论：1．使用外源性M-CSF蛋白及RANKL蛋白共同诱导外周血单个核细胞向破骨细胞分化的方法，能够诱导生成TRAP染色阳性，具有骨吸收能力的破骨细胞，此模型建立方法较为可靠，可以满足体外细胞实验的要求；2．外源性CD147蛋白增强破骨前体细胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水平的表达，且能够促进体外OCs分化过程中MMP-2、MMP-9蛋白的分泌，提示外源性CD147可能与破骨细胞分化过程中基质金属蛋白酶的合成及分泌相关；3．CD147单克隆抗体（CD147monoclonal antibodies，CD147mAb）能降低破骨前体细胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水平的表达，且能够降低体外OCs分化过程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的活性，提示内源性CD147可能与破骨细胞分化过程中基质金属蛋白酶的表达及活性调节相关；4．CD147、MMP-2及MMP-9在转移性骨肿瘤中高表达，且CD147与MMP-2、MMP-9的表达均呈正相关关系，提示三者可能与肿瘤骨转移及骨破坏过程密切相关;5．CD147在转移性骨肿瘤中破骨细胞内高表达，初步提示CD147可能与转移性骨肿瘤骨破坏过程中OCs的活化存在相关性。
张惠忠, 丘钜世, 朱全胜[3]1999年在《成骨性肿瘤中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白的表达》文中提出目的：研究成骨性肿瘤组织中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白的表达及与肿瘤分类、分化的关系。方法：用饱和苦味酸天狼星红偏振光镜和免疫组化ＬＳＡＢ 法，检测６９ 例成骨性肿瘤组织中Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ型胶原的表达情况，并用ＥＭＡＬ２００ 真彩图像分析系统进行分析和半定量测定。结果：骨瘤和骨样骨瘤中只有Ⅰ型胶原的表达（ 阳性率均为１００ ％ ，灰度值分别为１３３－１３ ±７－４７ 和１３６－４９ ±１４－２１） ，而骨肉瘤不仅Ⅰ型胶原阳性率和强度均明显低于前二者（ 阳性率８７ ％ ，４０／４６，灰度值１７１－９９ ±１４－７４） ，且出现了Ⅱ型和Ⅲ型胶原，Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型的表达明显高于其它型骨肉瘤（ Ｐ＜ ０－０１） ，而Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达在各型骨肉瘤间无显著差别；在高中低３ 组不同分化程度的骨肉瘤间，Ⅰ型胶原表达差异显著（ Ｐ＜ ０－０１） ，分化越低表达越少；天狼星红与免疫组化染色结果基本一致。结论：Ⅱ型胶原可作为软骨母细胞型和混合型骨肉瘤的分型参考指标，Ⅰ型胶原的表达可作为骨肉瘤分化的参考指标。天狼星红是鉴别Ⅰ、Ⅲ型胶原简便、经济的方法之一。
雷伟[4]1998年在《先天性胫骨假关节病因病理学研究及临床新治疗策略的制定和应用》文中认为先天性胫骨假关节(CPT)是一种少见疾病，发病率约为25万分之一。到目前为止，有关它的发病原因及病理特点仍不完全清楚。过去一直认为它的发病与神经纤维瘤病有关，但多数缺乏病变部位的组织学证据。相关的研究水平也仅限于少量的组织学及小样本的电镜学研究。由于它的病因及病理不清楚，所以给临床治疗也带来很大的困难，本病治疗方法很多，但针对性差，复发率高，是骨科领域一个十分辣手的问题。作者首先对该病进行了较大样本的形态学和免疫组化研究，目的在于探讨其发病原因，病变属性等生物学行为，为更合理的治疗提供理论依据。材料方法采用我科1982年～1997年所治疗的21例先天性胫骨假关节中的63个标本，首次采用大体、显微镜、电镜及免疫组化相结合的方法进行研究。标本取自：①假关节骨膜及周围病变组织。②断端间组织。③断端部位骨质。免疫组化染色选用的抗体分别为抗：①神经丝蛋白(NF-200)，S-100蛋白。②Ⅰ，Ⅲ胶原蛋白。③增殖细胞核抗原(PCNA)。④转化生长因子β_1(TGF-β_1)。⑤雌激素受体(ER)。选用神经纤维瘤病和创伤性假关节为对照组。SABC法染色判定结果。结果发现：①先天性胫骨假关节及其周围有大量范围广泛，边界不清的致密纤维结缔组织增生，并对胫骨形成包裹、压迫和侵蚀。②显微镜下见骨膜及断端间组织有大量高分化纤维母细胞和大量胶原纤维增生，未见异常神经成分。断端骨质萎缩，坏死，细胞成分少，未见其它
吴江[5]2005年在《钛颗粒负荷对假体松动过程中主要细胞功能的影响及其机理研究》文中提出研究背景 假体周围骨溶解和无菌性松动是人工关节置换术后最为常见的一种并发症。在正常磨损条件下产生的磨损碎屑颗粒被认为是造成假体无菌性松动的主要原因。大多数假体头部是由金属材料(主要成分是钛)做成,而金属磨屑(钛颗粒)在人工关节松动中起着重要作用。新近假体翻修术的回顾性研究发现,局部的大量磨屑颗粒通过骨与假体界面膜所提供进入假体周围间隙,被局部细胞吞噬后能激发细胞释放细胞间介质因子及产生组织细胞代谢副产物,继而募集和激活局部破骨细胞,促进假体周围骨吸收,造成骨质丢失。而磨屑颗粒所诱发的骨溶解须有周围骨组织中成骨细胞分泌足够的骨基质以弥补丢失的骨量,而成骨细胞正常的数量和质量要靠其来源骨髓祖细胞—骨髓间充质干细胞的正常增殖分化能力来维持。那么骨髓间充质干细胞(Marrow msenchymal stem cells,MSCs)在假体周围骨溶解过程中起什么作用? 另外,值得我们关注的是,正常骨转换涉及到骨形成和骨吸收之间的动态平衡,因而在无菌性松动时假体周围骨质的净丢失可能是骨形成减少或有骨质吸收增加的结果,成骨细胞的骨形成减少或破骨细胞的骨吸收活动增强都可能干扰假体周围骨代谢活动。而且假体翻修术中发现,骨—假体界面膜存在的磨屑颗粒大小一般在亚微米(小于1μm)与百微米之间,不同大小的颗粒所引起的生物学反应机制应该有所不同。因此,我们通过分析不同直径大小钛颗粒负荷(Titanium particles loading,TP)影响成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞等参与假体松动过程主要细胞功能的机理,为进一步阐明磨屑颗粒所激活的一系列生物学反应机理提供实验依据,同时,通过分析比较不同颗粒所引起的不同细胞分子机制,为寻找假体松动防治药物的新作用靶点提供新的理论依据。 方法
朱中蛟[6]2017年在《退变性腰椎间盘髓核内MicroRNA-216的表达对破骨细胞RANK信号的调控机制研究》文中研究表明研究背景及意义退变性腰椎间盘突出症(Lumber disc herniation,LDH)是经常伴有严重的腰腿痛一种综合征,是脊柱外科常见病、多发病,常影响患者生活和工作,严重者生活不能自理。目前临床治疗方案包括保守治疗和手术治疗,但国内外尚未有统一的治疗方案。因此有必要对LDH发生过程中的多种致病因素进行科学分析,以期对疾病的形成机制有更深入全面的了解,为临床治疗提供更多的有效选择。研究证实,腰椎间盘的退变过程与多方面有关,有化学性机制方面的,也有传统生物力学机制方面的,传统生物力学的改变可加速化学性机制方面的改变。退变性LDH所导致的疼痛症状与神经根受压无相关性,而与炎症性反应密切相关,动物实验亦证实,髓核具有较强致炎作用。局部炎性环境下,骨髓腔内的血窦发生血管芽,导致进入软骨终板的血液减少,切断了椎间盘获得营养成分的主要途径,引起椎间盘退变。炎症环境的持续存在,破骨细胞数量的增多和功能的亢进,使骨重塑过程的动态平衡被打破,骨质流失严重,引起一系列的临床病症,包括骨质疏松、矿物质和骨代谢紊乱等等。同时由于破骨细胞活化,骨量丢失,骨小梁变细,强度降低;由于单个骨小梁因受力过大而形成微骨折,从而影响椎体松质骨、纤维环和无血管的髓核之间的液体互换状态,进一步破坏髓核营养供养的通路,加速了椎间盘的退变。在临床上,退变性腰椎间盘突出患者影像学检查我们常常会发现有椎体或终板的破坏,这改变了临近节段脊柱的生物力学结构,导致各种各样的问题,最常见的是反复下腰痛。但退变性腰椎间盘突出和椎体或终板破坏是否具有相关性,目前还没有相关研究。为了在椎体或终板破坏发病机制与治疗方面寻求突破,本实验对破骨细胞进行了重点研究。但是破骨细胞在退变性LDH中如何被激活,如何发挥其病理作用的机制目前还不明确。在炎症性环境影响下,破骨细胞的数量及活性都有不断增加。破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞,在体内必须通过基因调控分化发育为多核的成熟破骨细胞。活化的信号通路主要由免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、核因子KB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)介导,也包括由一些细胞因子、生长因子等组成的非经典通路。目前认为最直接活化破骨细胞的内源性分子是激活RANKL(核因子NF-κ B受体的配体)。RANKL通过和存在于破骨细胞膜上的膜蛋白受体RANK结合,募集形成一种复合体(TRAF6和c.Src复合体),从而激活下游信号通路,如:NF-κB、J3、MAPK和Ca2+通路,通过胞内信号传导途径转而激活NF-κB、激活蛋白1等,激活破骨细胞相关基因(抗酒石酸碱性磷酸酶,金属基质蛋白酶9,整合素和组织蛋白酶K)的表达,促进破骨细胞分化、增强破骨细胞的骨吸收活性,抑制细胞凋亡,最终导致破骨细胞数量增多且功能亢进。细胞内的microRNA(miRNA)是一类自然出现的,包含20-22个氨基酸的非编码的内源性RNA。在真核生物内其通过对靶基因mRNA的3'端非翻译区(3'untranslated regions,3'UTR)进行识别和结合,在转录后水平影响相关基因的表达。随着越来越多的miRNA被发现,其生物学效应越来越受到重视。miRNA在众多骨性疾病中发挥着重要的调节作用,例如骨肿瘤,骨性关节炎,股骨头坏死等骨代谢相关疾病等。但microRNA-216(miR-216)的生物学功能较少得到关注,它首次发现于2007年,主要研究集中在胰腺癌中的病理表达变化。目前虽然一系列研究表明破骨细胞在退变性腰椎间盘突出症中扮演重要角色,但是miR-216在破骨细胞分化过程中的表达与功能改变情况知之甚少。本实验通过对临床手术后退变性腰椎间盘突出症患者突出程度进行分类,分析临床特点,发现椎间盘突出程度与疼痛症状持续时间及工作性质有关,同时发现退变性间盘突出程度越重,出现椎体或终板破坏的几率越高。通过检测术后髓核内miR-216表达水平,发现有椎体或终板破坏的髓核内,miR-216表达水平降低。通过体外实验诱导单核细胞分化为破骨细胞,发现在破骨细胞分化过程中miR-216表达下降;miR-216通过靶向RANKL-RNAK-NF-κb信号通路调控破骨细胞的分化。本实验通过miR-216为中心环节,发现在退变性椎间盘在突出过程中,通过miR-216表达下降,解除了对破骨细胞的抑制,是造成椎体或终板破坏的原因之一。同时,随着椎体或终板破坏,椎间盘与椎体之间的物质交换通道进一步被破坏,并且随着损伤时间延长(疼痛持续时间)以及劳动强度的增加,患者积累性损伤也增加,即在生物力学及化学性方面的相互作用下,椎间盘的退变进一步加重,从而形成了恶性循环。所以研究miR-216的靶基因和它的生物功能方面的机制对于退变性腰椎间盘突出症的患者来说有着临床价值,对退变性腰椎间盘突山症的治疗和预防具有巨大潜力;我们希望,随着研究的深入,我们能够有更多的发现,为临床治疗的新突破提供更有效的靶点。第一部分研究目的:探讨退变性腰椎间盘突出症患者退变性椎间盘突出程度与临床特点之间的关系、退变性椎间盘突出程度与髓核内的miR-216表达水平之间的相互关系,阐明椎间盘退变程度与临床特点之间的关系,同时检测miR-216在退变性腰椎间盘突出患者髓核内的表达情况。研究方法:本研究入选192例手术患者,依据AAOS&ISSLS分类及Pfirrmann分级,结合CT和MRI分组:腰椎间盘膨出组,腰椎间盘突出组,腰椎间盘脱出组,记录各病例的临床特点,如性别、年龄、职业、疼痛程度、病程进展情况、血糖情况等,依据患者影像学结果观察患者椎体或终板破坏情况,同时观察不同组间患者临床特点的改变情况;对照正常组29例,均为年轻,急性暴力外伤,MRI检查无间盘退变;保留切下有椎体或终板破坏的所有患者的髓核,利用qRT-PCR、Western blot、荧光素酶实验等技术,检测miR-216在正常与退变性LDH患者髓核内的表达改变情况;研究结果:依据AAOS&ISSLS分类及Pfirrmann分级,结合CT和MRI等影像特点:椎间盘突出程度,椎间盘压迫征象如硬膜囊、神经根受压、硬膜外脂肪变形、移位或消失等,还有间盘的信号改变,间盘结构的改变,间盘髓核与纤维环边界清晰与否,椎间隙的高度的改变情况,将患者分为腰椎间盘膨出组36例,腰椎突出组117例,腰椎脱出组39例,对照组27例。患者疼痛症状出现到手术的持续时间,膨出组与突出组和脱出组相比具有显著统计学差异(p<0.05);与椎间盘膨出组相比,从事体力劳动患者的比例在椎间盘突出组与椎间盘脱出组中更高(p<0.001)。观察患者CT及MRI影像,发现患者间盘膨出组椎体或终板破坏占2.8%,突出组占84%,脱出型占95%,各组间P<0.01,具有统计学意义。通过qRT-PCR实验检测有椎体或终板破坏的退变性腰椎间盘突出症患者髓核以及其他外伤性患者髓核标本中,miR-216表达量的变化情况。实验结果显示,相较正常对照组,退变性腰椎间盘突出症患者髓核中,miR-216表达水平低。研究结论:1.疼痛症状持续时间与退变性椎间盘突出程度呈正相关;2.劳动强度高者,椎间盘退变程度重;3.退变性椎间盘突出程度重者,椎体或终板的破坏几率增高;4.有椎体或终板破坏的椎间盘突出患者髓核组织中miR-216表达下调。第二部分研究目的:体外诱导单核细胞分化为破骨细胞的过程中,观察miR-216与破骨细胞内关键蛋白之间的相关性,明确miR-216在破骨细胞生成过程中的调节作用及其分子生物学机制,以期为临床治疗提供新的治疗方案。研究方法:测定正常健康供体,采用密度梯度离心法从外周静脉血分离出单核细胞,经诱导分化为破骨细胞并做细胞鉴定;分别取0,3,6,9,12天培养分化的破骨细胞,经Western-blotting检测破骨细胞内CALCR、CTSK、TRAP等蛋白的表达;分别取0,3,6,9,12天培养分化的破骨细胞应用Mir VanaTM miRNA Isolation提取试剂盒提取细胞MiRNA,去掉大分子RNA,经反转录反应合成cDNA,经实时荧光定量PCR扩增目的基因,并做相对量检测;分别取0,3,6,9,12天培养分化的破骨细胞,经细胞转染,经Western-blotting检测破骨细胞内RANK的表达及荧光素酶报告系统进行验证;将外周血单核细胞放入不同的培养基中进行破骨细胞诱导分化与加入MiR-216的培养基对比,并做破骨细胞鉴定;各培养组提纯小分子MiRNA,经反转录反应合成cDNA,经实时荧光定量PCR扩增目的基因,并做相对量检测;各培养组培养分化的破骨细胞,应用Western-blotting检测加入MiR-216与没有加入MiR216分化后的破骨细胞内CALCR、CTSK、TRAP等蛋白的表达。研究结果:1.体外诱导外周血单个核细胞分化为破骨细胞,通过Western blot检测CALCR、CTSK、TRAP等蛋白表达增高,TRAP染色亦证实破骨细胞分化形成;2.qRT-PCR检测显示miR-2J6表达在破骨细胞分化过程中表达下降,提示miR-216可能在破骨细胞的分化中发挥作用。3.体外诱导破骨细胞分化过程中,转染miR-216,Western blot及qRT-PCR验证了 CALCR、CTSK、TRAP等蛋白及核酸表达水平降低,TRAP染色亦证实破骨细胞分化被抑制4.细胞转染miR-216,Western blot及荧光素酶报告系统验证了miR-216可直接靶向RANK。5.Western blot检测显示p-NF-kB p65表达降低,提示miR-216通过调控RANKL-RNAK-NF-κ b信号通路下调破骨细胞的分化。研究结论:1.在破骨细胞分化过程中miR-216表达下降;2.miR-216通过靶向RANKL-RNAK-NF-κ b信号通路调控破骨细胞的分化。
唐四元[7]2006年在《BMP-2对肺癌A549细胞基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的影响》文中进行了进一步梳理第一章 肺癌A549细胞骨形成蛋白-2及骨形成蛋白受体的表达 目的：观察肺癌A549细胞骨形成蛋白-2(Bone MorphogeneticProtein-2；BMP-2)及骨形成蛋白受体(Bone Morphogenetic ProteinReceptor；BMPR)的表达。 方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测BMP-2、BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-II基因的表达。采用Western blot检测BMP-2、BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-II蛋白的表达。 结果：(1) RT-PCR表明肺癌A549细胞表达BMP-2、BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-II基因。(2) Western blot检测到肺癌A549细胞中BMP-2、BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-II蛋白的表达。 结论：肺癌A549细胞表达BMP-2、BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-II。
成功[8]2015年在《内脏脂肪素对U2OS细胞株迁移与侵袭的影响及其机制的实验研究》文中提出研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是最常见的骨肿瘤,约占所有原发性骨肿瘤的15%。在原发性恶性骨肿瘤中,骨肉瘤发病率紧随在多发性骨髓瘤后排名第二。每年骨肉瘤在人群中的发病率约为3例/百万人口,约占所有恶性肿瘤的0.2%。15至25岁的骨肉瘤患者约占所有患者的75%,男性比女性发病率更高,约为1.5：1。骨肉瘤主要发生于6岁到60岁的人群。一般来说,80%到90%的骨肉瘤发生在长管骨。股骨、胫骨、肱骨占肢端肿瘤的85%左右,而手和脚部骨骼占不到1%。长骨骨肉瘤通常起源于干骺端。尽管包括病毒起源说、电离辐射等学说可以解释部分骨肉瘤的发病与进展,但骨肉瘤的病因及发生发展机制至今仍不清楚。近几十年以来,随着对骨肉瘤研究的深入及新药的开发,新的放、化疗方法及新的手术方式不断出现,骨肉瘤的治疗理念已经涵盖了多个学科的治疗方法。新近研究发现了多个骨肉瘤相关的关键基因包括P53、FAS、NOTCH等,基于这些肿瘤相关信号通路的基因靶向治疗为骨肉瘤的预防和治疗提供新的策略和途径。在骨肉瘤的诊断治疗领域,尽管每年都有新的成果的出现,但衡量骨肉瘤患者治疗效果的5年生存率仍然只能维持在60-70%。因此,发现一个能准确预测骨肉瘤发生、发展、转移和对化疗反应性,并可有效调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的新型标志物对于理解骨肉瘤的发病机制,并寻找有效防控靶点具有极其重要的意义。内脏脂肪素(Visfatin)最早也称为前B细胞集落增强因子(PBEF)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt),是由人类外周血淋巴细胞分泌的,参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的代谢。拥有三种不同生物学名字及三个不同功能,使该蛋白质非常特别。内脏脂肪素分子量为52kDa,二聚体时具有活性,每个单体含有491个氨基酸。已证实,在人类,内脏脂肪素/PBEF/Nampt该基因位于7染色体的长臂77q22.1和7q31.33之间。Visfatin基因在进化中高度保守。Visfatin在骨髓、肝脏和肌肉等组织中表达最多,其次是大脑、肾、脾、睾丸、肺,但在内脏脂肪中多于皮下脂肪。Visfatin被认为是一个新的促炎脂肪细胞因子,它可剂量依赖性上调包括单核巨噬细胞、脂肪细胞及肿瘤细胞中多种细胞因子如IL-1、IL-1Rα、IL-6、IL-10和TNF-a等表达,而这些细胞因子在炎症性疾病及肿瘤中均发挥了实质性作用。最近的研究发现,细胞内NAD+的增加、烟酰胺表达水平的减少及去乙酰酶sirtuin蛋白家族的水平改变对于细胞的生存非常重要,而内脏脂肪素则通过激活sirtuins途径及烟酰胺途径,延长细胞寿命并促进细胞的成熟,因此,内脏脂肪素可间接有助于细胞寿命的长寿。然而,Visfatin是否能够在骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程中发挥作用,至今尚未报道。上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)作为人体组织上皮细胞向间充质转化的一种特殊生物学过程,在包括胚胎发育、伤口愈合及恶性肿瘤在内的多个生理病理状态进展过程中发挥极其重要的作用。在上皮间充质转化的过程中,有极性的上皮表型细胞在各种生理病理刺激下逐渐转变为具有高度运动特性的间叶性表型细胞。在这一过程中,细胞上皮表型标志物如E-cadherin的表达逐渐减少,而间充质表型的标志物如N-cadherin的表达却逐渐增加。此前多项体外及体内研究均表明,上皮间充质转化在恶性肿瘤的增殖、迁移及侵袭等过程中发挥了重要作用。在肿瘤侵袭和转移过程中,肿瘤细胞隐藏其已分化的上皮特性包括细胞间粘附和极性,而获得间充质细胞特性如运动性、侵袭性以及更为重要的干细胞属性。上皮间充质转化过程是可逆的,间充质上皮可以分化为上皮表型,而上皮表型同样可以分化为间充质表型。异常微环境条件如缺氧、低pH值或营养不足可引起肿瘤细胞内的一系列反应,包括代谢适应、表观遗传改变以及EMT相关的去分化。这最终将导致肿瘤细胞转移到远处的组织和器官,从而可提供必要的营养支持来维持快速增长。以上对上皮间充质转化过程的研究可为癌症的预防及治疗提供一个方法。然而其在骨肉瘤发生发展过程中的作用至今研究尚处于起步阶段。综上所述,侵袭和迁移是骨肉瘤进展过程中的一个重要环节,是导致骨肉瘤预后不良的一个重要因素,因此对侵袭和迁移机制的研究对防治骨肉瘤具有重要意义。多种癌症的发病伴随着Visfatin表达水平的升高,迄今为止还没有直接证据表明Visfatin参与了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。因此,鉴于上述实验研究,我们旨在评估Visfatin是否影响骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,并探寻其潜在的分子机制。研究目的1.探讨Visfatin对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响；2.探讨Visfatin在骨肉瘤细胞中对上皮-间充质转化的影响；3.探讨Visfatin影响骨肉瘤细胞迁移和侵袭的相关信号转导通路。研究方法：1.细胞培养U20S细胞所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基,于含5% CO2的37℃孵箱中孵育。为确定Visfatin对EMT标志物表达的影响,U20S细胞在含1%胎牛血清的DMEM中维持培养12h,随后添加Visfatin或其他试剂继续培养。2.细胞迁移实验伤口愈合试验被用来测定细胞的迁移。U20S细胞以1×106/孔的密度接种于6孔板,生长融合为单层细胞。用吸管以相同宽度的直线在U20S单层细胞产生划痕。加入试剂后孵化一定时间,在显微镜下测量伤口愈合。3.细胞侵袭实验基质胶覆盖的Transwell实验被用来测定细胞的侵袭。改良的Boyden小室插有8μm孔隙的过滤器,并在表面覆以基质胶(50μg.孔)。U20S细胞培养在24孔板中,上层小室内的细胞用含1%胎牛血清的DMEM培养,而下层小室内的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养。上室内悬浮的细胞(1×105/孔)培养在含5% CO2的37℃孵箱中。孵育24h后,已经侵袭到基质膜下面的细胞经由甲醇固定30min,并以结晶紫染色,仍停留在上表面的细胞被拭去。4. Western blot实验用Visfatin和其他试剂刺激后,收集U20S细胞,蛋白质用含1 mM PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解30min。提取的蛋白用BCA蛋白试剂盒测定浓度。细胞蛋白置于10% SDS聚丙烯酰胺凝胶,加入蛋白提取物,在90v条件下进行电泳60-90min后,将10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白转移至NC膜上。5%脱脂牛奶封闭抗原位点后,加入一定浓度的适量的一抗,在4℃条件下孵育过夜。然后取出条带,TBST清洗三次后,配制一定浓度的二抗,在室温条件下孵育条带约2h。最后,将这些含有蛋白印迹的条带通过电化学发光显示,检测条带亮度并进行分析。5.实时定量PCR(qPCR)分析分离细胞中的总RNA,并使用Trizol试剂提取。总RNA浓度用分光光度法测定。用M-MLV使RNA样本逆转录为cDNA,以18s作为内参。实时PCR基因的引物序列如下：E-钙粘蛋白正向序列5'-ACCAGAATAAAGACCAAGTGACCA-3',反向序列5'-AGCAAGAGCAGCAGAATCAGAAT-3'; N-钙粘蛋白正向序列5'-CACTGCTCAGGACCCAGAT-3',反向序列5'-TA AGCCG AGTGATGGTCC-3'; Snail正向序列5'-TTGGATACAGCTGCTTTGAG-3',反向序列5'-ATTGCATAGTTAGTCACACCTC-3'; 18s内参正向序列5'-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3',反向序列5'-GCTGAACGCCACTTGTCC-3'.6.统计学分析本研究数据均应用SPSS18.0软件处理。数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。符合正态分布及方差齐性的数据采用两独立样本t检验或单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异检验；若数据不符合正态性和(或)方差齐性,两组比较采用Wilcoxon秩和检验,多组则采用Kruscal-Wallis秩和检验,多重比较时检验水准采用Bonfferoni校正(α'=α/k,k为多重比较次数)。检验水准α=0.05,P<α或α'则认为具有统计学差异。研究结果1. Visfatin对骨肉瘤细胞迁移的影响U20S骨肉瘤细胞经过培养后,将其随机分为Control组和Visfatin组,对这两组细胞分别进行伤口愈合实验(划痕实验),其中Visfatin组细胞给予500ng/ml的重组Visfatin,而对照组则给予等体积的生理盐水。经过24小时后,对划痕部位拍照、记录,得到以下数据：Control组与Visfatin组细胞相对迁移距离百分比分别是(100±7)%,(255.67±43.50)%；经统计学分析,得出二者差异有统计学意义(t=-6.12,P<0.01)。2. Visfatin对骨肉瘤细胞侵袭的影响同样对培养的U20S骨肉瘤细胞随机分为Control组和Visfatin组进行Transwell实验,其中Visfatin组细胞给予500ng/ml的重组Visfatin,而对照组则给予等体积的生理盐水。分别经过12小时和24小时刺激后,对小室底面的细胞行龙胆紫染色,并在显微镜下进行计数。12小时,Control组与Visfatin组相对侵袭细胞数目百分比分别是(100±7)%,(121.33±16.56)%,经统计学分析,得出二者差异无统计学意义(t=2.01,P=0.11)。24小时,Control组与Visfatin组相对侵袭细胞数目百分比分别是(100±7)%,(214±24.27)%,经统计学分析,得出二者差有统计学意义(t=7.82,P<0.01)。3. Visfatin对骨肉瘤细胞EMT标记物表达的影响我们用Western blot和实时PCR分别来检测Visfatin对EMT标记物及其mRNA表达的影响。不同浓度的Visfatin(5、50和500ng/ml)分别刺激骨肉瘤细胞并培养24h,之后检测到对照组及不同浓度的Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的E-cadherin蛋白倍数、N-cadherin蛋白倍数、E-cadherin mRNA倍数和N-cadherin mRNA倍数分别是：0.99±0.11,0.88±0.09,0.58±0.10,0.38±0.08；0.99±0.07,1.51±0.13,2.60±0.29,3.28±0.59；0.99±0.11,0.82±0.07,0.48±0.10,0.39±0.09；0.99±0.07,1.48±0.12,4.20±0.64,5.45±0.90。经统计分析发现随着Visfatin浓度的增加,E-cadherin表达逐渐降低,差异有统计学意义(F=27.07, P<0.01)。N-cadherin表达逐渐增加,差异有统计学意义(X2=20.57, P<0.01)。E-cadherin mRNA表达逐渐降低,差异有统计学意义(F=27.51, P<0.01), N-cadherin mRNA表达逐渐增加(χ2=20.75,P<0.01),差异有统计学意义。再将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞,分别培养6h、12h、24h、48h,之后检测到对照组及不同时间长度的Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的E-cadherin蛋白倍数、N-cadherin蛋白倍数分别是：0.99±0.11,0.95±0.06,0.72±0.07,0.51±0.05,0.38±0.08：0.99±0.07,1.05±0.09,1.80±0.12,3.01±0.31,3.51±0.43。再将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞,分别培养3h、6h、12h、18h、24h,之后检测到对照组及不同时间长度的Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的E-cadherin mRNA倍数和N-cadherin mRNA倍数分别是：0.99±0.11,0.95±0.06,0.75±0.13,0.52±0.07,0.33±0.06,0.31±0.09；0.99±0.11,1.03±0.09,2.38±0.38,4.62±0.64,6.94±0.43,6.72±0.47。经统计分析发现随着随着时间延长,E-cadherin蛋白表达水平逐渐下降(F=38.17, P<0.01); N-cadherin蛋白变化趋势呈上升趋势(F=126.53, P<0.01), E-cadherinmRNA表达逐渐降低(F=35.37,P<0.01),N-cadherinmRNA表达逐渐升高(F=134.35,P<0.01),有统计学意义。4. Visfatin对Snail表达的影响及Snail siRNA对EMT标记物表达的影响我们将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞中,分别培养3h、6h、9h和12h,之后检测到对照组及不同时间长度Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的Snail蛋白倍数和Snail mRNA倍数分别是：0.99±0.11,1.02±0.16,2.25±0.44,2.36±0.46,2.38±0.58；0.99±0.11,1.16±0.19,4.18±0.67,4.06±0.60,4.37±0.82。经统计分析发现随着随着时间延长,Snail蛋白表达水平明显上升(F=10.32,P<0.01),SnailmRNA表达也明显升高(F=29.06,P<0.01),差异有统计学意义。之后,为确定Snail在促进EMT中的作用,骨肉瘤细胞随机分为三组：Control组、Visfatin组、Visfatin+Snail siRNA组。24小时后,测得三组E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白表达量分别是：1±0.08,0.37±0.09,0.69±0.08; 1±0.07,2.74± 0.16,1.64±0.15。E-cadherin蛋白表达量三组间差异明显(F=44.33,P<0.01),有统计学意义,N-cadherin蛋白表达量三组间差异明显(F=134.54,P<0.01),也有统计学意义。5.Visfatin对骨肉瘤细胞NF-κB核转位的影响将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞中,分别培养3h、6h、9h和12 h,检测到对照组不同时间点Visfatin刺激骨肉瘤细胞后核内NF-K B的p65多肽表达倍数和核外胞浆中NF-κB的p65多肽表达倍数分别是：0.99±0.11,1.87±0.29,2.25±0.57,5.36±0.06,5.52±0.64；0.99±0.11,0.67±0.09,0.45±0.09,0.40±0.06,0.30±0.11。经统计分析发现随着时间延长,核内p65表达水平显著增加(F=55.02,P<0.01),核外p65表达水平显著降低(F=26.79,P<0.01)。6.Bayll-7082对骨肉瘤细胞EMT标记物及Snail表达的影响为了进一步明确Visfatin诱导的促进和抑制EMT标记物表达的分子机制,将骨肉瘤细胞随机分为三组：Control组、Visfatin组、Visfatin+Bay11-7082组。24小时后,三组E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白表达量分别是：1.00±0.07,0.27±0.08, 0.72±0.17; 0.99±0.05,4.45±0.48,2.36±0.34。E-cadherin蛋白表达量三组间差异明显,有统计学意义(F=29.70, P<0.01), N-cadherin蛋白表达量三组间差异明显,也有统计学意义(F=157.14,P<0.01)。相同处理后,三组Snail的蛋白表达情况分别是Control组0.99±0.05, Visfatin组5.09±0.85, Visfatin+Bay11-7082组2.22±0.41,三组间表达差异有统计学意义(χ2=15.16,P<0.01)。7.Visfatin/Bay11-7082/Snail siRNA对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的影响骨肉瘤细胞分别用不同浓度的Visfatin(5、50和500ng/ml)刺激24h后分别进行伤口愈合实验和Transwell实验,对照组及不同浓度的Visfatin刺激后骨肉瘤细胞相对迁移距离百分比和骨肉瘤细胞相对侵袭细胞数目百分比分别是：(100±7)%,(103.67±7.57)%,(176±22.11)%,(255.67±43.50)%；(100.50±4.63)%,(103.67±5.05)%,(167.17±5.85)%,(213.83±15.51)%。经统计分析发现随着Visfatin浓度的增加,骨肉瘤细胞相对迁移距离百分比增大,差异有统计学意义(F=26.01,P<0.01)；骨肉瘤相对侵袭细胞数目百分比增多,差异有统计学意义(F=221.61,P<0.01)。将骨肉瘤细胞随机分成4组,Control组、Visfatin组、Visfatin+Bay11-7082组及Visfatin+Snail SiRAN组。对四组骨肉瘤细胞进行伤口愈合实验和Transwel实验,它们的细胞相对迁移距离百分比和相对侵袭细胞数目百分比分别是：(100±7)%,(263.67±36.69)%,(152.67±10.02)%,(146.67±16.80)%；(100.50±4.64)%,(206.00±15.63)%,(136.33±10.19)%,(127.67±11.20)%。4组细胞相对迁移距离百分比Visfatin组最高,Visfatin+Bay11-7082组及Visfatin+Snail组相似,但均高于Control组,差异有统计学意义(F=32.50,P<0.01)；4组的相对侵袭细胞数目百分比Visfatin组最高, Visfatin+Bay11-7082组及Visfatin+Snail组相似,均高于Control组(F=97.80,P<0.01)。结论1.Visfatin可呈浓度和时间依赖性地促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭；2.Visfatin可呈浓度和时间依赖性地诱导上皮-间充质转化；3. Visfatin通过NF-κB/Snail/EMT信号通路促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。
陈烁[9]2012年在《Notch信号通路在脊索瘤增殖和侵袭中的作用》文中研究表明目的Notch信号通路在不同类型的肿瘤中分别表现为癌基因和抑癌基因，从而在肿瘤的发生和转移中起到重要的调控作用,但它在脊索瘤的增殖和侵袭中的作用尚不清楚。本研究旨在明确Notch信号通路在脊索瘤中的表达情况，以及在脊索瘤增殖和侵袭中的作用，进而探讨它在脊索瘤中异常表达的意义，以及与临床预后的关系。方法应用RT-PCR和Western Blot方法对Notch信号通路相关分子在人脊索瘤细胞系CM-319及脊索瘤患者标本中的表达进行测定。然后通过人为阻断Notch信号通路，应用细胞增殖实验、细胞周期实验和侵袭实验研究Notch信号通路在脊索瘤细胞的生长、增殖和侵袭中的作用。通过免疫组化研究脊索瘤患者标本中Notch1的表达特点，并结合随访资料进行回顾性分析，探讨它与脊索瘤预后之间的关系。结果Notch通路基因，包括Notch配体DLL1、DLL3、Notch1-4和Notch下游靶基因HES1，在脊索瘤细胞中均有表达，并且在人脊索瘤细胞系CM-319及原发脊索瘤患者标本中的表达显著上调。而阻断Notch信号通路，通过抑制细胞的分裂周期能够明显抑制脊索瘤细胞的增殖和侵袭。Notch1的表达与脊索瘤的发生和脊索瘤患者的无瘤生存时间存在相关性。结论本研究提示了一条可能存在的调控脊索瘤增殖和侵袭的途径。Notch通路基因在脊索瘤细胞中的表达显著上调，而阻断Notch信号通路能够明显抑制脊索瘤细胞的增殖和侵袭。通过调节Notch信号通路的表达，可能实现对脊索瘤细胞增殖和侵袭的调控。研究资料表明Notch信号通路在脊索瘤中存在异常表达，在脊索瘤的增殖和侵袭中具有重要的促进作用，且与脊索瘤的发生和预后有密切关系。抑制Notch信号通路可能成为针对脊索瘤及其它间叶组织恶性肿瘤的治疗途径。
杜红延[10]2005年在《骨唾液酸蛋白在乳腺癌骨转移中作用的研究》文中进行了进一步梳理乳腺癌是目前严重威胁女性健康的一类恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤发病率的第一位。然而许多乳腺癌患者并不是直接死于原发乳腺肿瘤，而是死于肿瘤其他部位的扩散转移。其中骨是乳腺癌转移最常见的靶器官之一。深入研究肿瘤骨转移的分子和细胞学机制，可以更好的指导乳腺癌骨转移相关疾病的临床诊断和治疗。 骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，简称BSP)是细胞外基质中的一种高度糖基化和磷酸化的酸性糖蛋白，富含唾液酸。其组织分布具有局限性，分布在矿化组织，包括骨、牙齿和钙化的软骨等，主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌，参与组织矿化，与多种骨代谢性疾病有关，而近年来的研究又发现BSP与乳腺癌的骨转移密切相关。因而深入研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用，揭示其作用机制，有可能为乳腺癌骨转移的预防和治疗提供新的药物靶点。 构建hBSP稳定高表达系统是研究hBSP在乳腺癌骨转移中作用的关键，本文通过构建hBSP的真核表达载体，并转染乳腺癌细胞，进行BSP促进乳腺癌骨转移的体内外试验研究。 首先构建hBSP与绿色荧光蛋白(GFP)非融合表达的分泌型真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP和膜靶向定位真核表达载体pID-hBSP-EGFP。从pB-hBSP中PCR亚克隆扩增带有分泌信号肽的hbsp基因片段，插入非融合表达的真核表达载体pIRES2-EGFP中，获得重组表达载体pIRES2-hBSP-EGFP，该载体插入hbsp基因片段带有分泌信号肽可以将表达的蛋白分泌至细胞外。同时将不带信号肽的hbsp基因片段插入膜靶向表达载体pDisplay中，构建真核表达载体pDisplay-hBSP，再以该载体为模板PCR扩增膜靶向定位信号肽、hBSP以及膜靶向定位蛋白基因片段，并插入pIRES2-EGFP中，获得重组表达载体pID-hBSP-EGFP，该载体可将hBSP蛋白表达定位于细胞膜。 将pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP利用脂质体介导分别转染发生特异性骨转移和脑转移的乳腺癌细胞。经过转染条件的优化，最终确定96孔培养板中细胞融合度达到90％，用1μg脂质体介导280ng重组质粒转染10h可获得较满意的转染效率，最高可达19.70±1.10％。由G418对乳腺癌细胞杀伤曲线试验确定稳定转染细胞G418的筛选浓度为400μg／ml，G418抗性筛选和流式细胞仪荧光分选获得稳定转染pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP重组表达载体的特异性骨转移乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)。 细胞免疫组化结果表明乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和
参考文献：
[1]. 抗人Ⅰ型和Ⅱ型胶原抗体在骨肿瘤病理中的初步应用[D]. 黄国强. 中国协和医科大学. 1985
[2]. CD147/EMMPRIN与转移性骨肿瘤中破骨细胞活化机制的相关研究[D]. 余世明. 第三军医大学. 2012
[3]. 成骨性肿瘤中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白的表达[J]. 张惠忠, 丘钜世, 朱全胜. 癌症. 1999
[4]. 先天性胫骨假关节病因病理学研究及临床新治疗策略的制定和应用[D]. 雷伟. 第四军医大学. 1998
[5]. 钛颗粒负荷对假体松动过程中主要细胞功能的影响及其机理研究[D]. 吴江. 四川大学. 2005
[6]. 退变性腰椎间盘髓核内MicroRNA-216的表达对破骨细胞RANK信号的调控机制研究[D]. 朱中蛟. 山东大学. 2017
[7]. BMP-2对肺癌A549细胞基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的影响[D]. 唐四元. 中南大学. 2006
[8]. 内脏脂肪素对U2OS细胞株迁移与侵袭的影响及其机制的实验研究[D]. 成功. 南方医科大学. 2015
[9]. Notch信号通路在脊索瘤增殖和侵袭中的作用[D]. 陈烁. 第四军医大学. 2012
[10]. 骨唾液酸蛋白在乳腺癌骨转移中作用的研究[D]. 杜红延. 华南理工大学. 2005
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