广西壮族自治区人民医院 南宁市 530021
【摘 要】目的 探讨结核性胸腔积液患者胸腔积液中及外周血CD69+ T淋巴细胞表达水平的差异及临床意义。方法 募集结核性胸腔积液患者23例，采集外周血及胸腔积液，健康对照者20例，采集外周血，用流式细胞术分析CD69+ T淋巴细胞占T淋巴细胞总数的比例。结果 结核性胸腔积液患者胸腔积液中CD69+ T淋巴细胞占T淋巴细胞总数的比例（5.37% ± 0.34%）高于相应外周血（0.97% ± 0.08%）（P = 0.001）；而外周血中CD69+ T淋巴细胞水平则结核性胸腔积液患者与健康对照组（0.89% ± 0.11%）差异无统计学意义（P = 0.202）。结论 结核性胸腔积液患者胸腔积液中T淋巴细胞活化增强，T淋巴细胞活化可能参与结核性胸腔积液的发生发展。
【关键词】结核性胸腔积液；CD69；T淋巴细胞；流式细胞术
分化抗原簇69（cluster of differentiation 69，CD69）既往又称为早期活化抗原-1（early activation antigen-1，EA-1），活化诱导分子（activation inducer molecule，AIM），MRL-3，Leu-23等，于1981年被发现。T淋巴细胞一般通过一些酶或者某些受体复合物等信号的刺激以后，一些糖蛋白分子生成并表达于该细胞表面，包括CD69，CD25，CD71等，其中CD69最早表达的，是T淋巴细胞活化的标志[1，2]。结核性胸腔积液是由于胸膜下结核杆菌感染导致强烈的迟发型超敏反应所引起，主要表现为淋巴细胞性渗出性胸腔积液。既往对结核性胸腔积液的研究多为对淋巴细胞亚群进行分析，鲜见探讨淋巴细胞活化状态。我们的前期研究发现结核性胸腔CD4+CD25+ 抑制性T细胞的数量增高，且胸膜腔中的CD4+CD25+ T细胞可以强烈抑制CD4+CD25－ T细胞的增殖[3]。本研究检测结核性胸腔积液中T淋巴细胞细胞表面CD69分子的表达情况，评估患者胸腔积液中T淋巴细胞的活化状态，进一步探讨T细胞免疫功能对结核性胸腔积液发生发展的影响。
1.资料与方法
1.1 研究对象 收集2014年3月1日至2015年2月1日在广西壮族自治区人民医院呼吸内科住院的结核性胸腔积液患者23例，男17例，女6例，年龄15 ～84 岁，中位年龄54岁。同期从体检中心募集健康对照者20例，男17例，女6例，年龄24 ～83 岁，中位年龄59岁。两组患者的年龄、性别比较无统计学差异，具有可比性。结核性胸腔积液诊断依据：⑴、胸水培养或者涂片发现抗酸杆菌；⑵、胸膜活检组织找见抗酸杆菌；⑶、胸膜活检组织中可见肉芽肿样改变，并除外其他病因所致肉芽肿性胸膜炎，且胸水腺苷脱氨酶>45U/L。符合以上任何一项即可。纳入标准：符合结核胸腔积液诊断；年龄≥14岁；未用过激素；抗痨治疗时间少于2周。排除标准：合并自身免疫性疾病；入院前3个月内接受过胸腔侵袭性操作或胸部损伤的患者；合并其它原因引起胸腔积液。
1.2 标本采集 结核性胸腔积液患者于入院后24小时内进行标准胸腔穿刺术收集胸腔积液100ml，同步采集外周静脉血3ml；健康对照者采集外周静脉血3ml。所有标本用肝素抗凝，4小时内完成标本检测。
1.3 CD69检测方法 胸腔积液细胞沉淀用Percoll液（Pharmacia，Uppsala，Sweden）进行密度梯度离心分离单个核细胞后用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）重悬，外周血则直接用全血进行流式细胞分析。所用的单克隆抗体为APC标记的鼠抗人CD69抗体。每次实验都设置相应的阴性同型对照。按说明书加样后室温避光孵育30min，每管加入按说明书配制好的红细胞裂解液1000ul裂解红细胞10min，加入PBS洗一遍，离心2000 r/min，共10min；去除上清液，加2％多聚甲醛300ul固定，上机检测。单克隆抗体、同型对照及红细胞裂解液均购自BD公司（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）。利用BD FACSCalibur流式细胞仪及CellQuest软件获取10000个细胞分析淋巴细胞群的CD69表达，并计算CD69+ T细胞所占百分比。
1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 19.0 统计学软件进统计学分析，各组性别差异比较用卡方检验，各组年龄差异比较用秩和检验。计量资料采用均数±标准差（ ）表示，结果采用t检验方法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
结核性胸腔积液患者外周血CD69+ T淋巴细胞占T淋巴细胞总数比例与健康对照者无显著性差异，而胸腔积液中CD69+ T淋巴细胞占T淋巴细胞总数比例则显著高于患者同步采集的外周血，见表1；
3 讨论
一般来说，静止状态下的T淋巴细胞是不表达CD69的，即活化后的T淋巴细胞才可能表达CD69，CD69是T淋巴细胞早期活化的一个标志。循环中也可发现极少T淋巴细胞膜上有CD69分子的表达，很大可能是T淋巴细胞在体内存在活化的情况。Mardiney[4]报道，CD69的表达程度可以反映抗原和T淋巴细胞作用的反应强度。CD69分子表达后，可引起T淋巴细胞内Ca2+浓度的升高，白细胞介素2受体（IL-2R）CD25表达升高以及IL-2、干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子合成增多，并作为共刺激信号促进T淋巴细胞进一步活化和增值[5，6]。CD69可以通过上调IL-2R的p-55链，传递活化信号，然后促使Th1型细胞因子的分泌。因此，检测CD69的水平能客观反映T淋巴细胞活化的程度。研究证实，CD69在自身免疫性疾病患者外周血中处于高表达状态，经有效治疗后，CD69表达水平明显回降。Avgustin[7]通过体外研究发现，结核菌素刺激后CD4+ T淋巴细胞可高表达CD69分子。我们的前期研究发现结核性胸腔积液患者胸腔积液中CD4+CD25+ 调节性T淋巴细胞的数量增高，且胸膜腔中的CD4+CD25+ T细胞可以强烈抑制CD4+CD25－ T细胞的增殖，提示结核性胸腔积液患者胸膜腔内细胞免疫抑制功能增强 [3]。本研究结果显示结核性胸腔积液患者外周血CD69+ T淋巴细胞水平与健康对照者无显著性差异，而胸腔积液中CD69+ T淋巴细胞水平则显著高于外周血，提示结核性胸腔积液患者胸腔积液中T淋巴细胞被激活，外周血T淋巴细胞并未出现明显活化，表明结核性胸腔积液的产生与胸膜腔内局部免疫功能受累有关。结合我们的前期研究结果，考虑结核性胸腔积液患者胸膜腔内细胞免疫功能出现紊乱，局部虽然有高浓度的调节活性增强的CD4+CD25+ 调节性T淋巴细胞，但不足以阻止胸腔积液患者的胸膜免疫病理发展，T淋巴细胞仍被激活而使其表面CD69分子表达增高。结核性胸腔积液是由于胸膜下结核杆菌感染导致强烈的迟发型超敏反应所引起，Lourenco等[8]对哮喘的研究发现患者诱导痰含有高水平CD69+ T淋巴细胞，过敏性疾病中CD69+ T淋巴细胞与组织损伤有关，推测本研究中结核性胸腔积液患者CD69+ T淋巴细胞增高可能参与胸膜免疫损伤而促进胸腔积液形成。
综上所述，结核性胸腔积液患者胸膜腔内CD69+ T淋巴细胞增高，淋巴细胞活化，且胸膜腔内免疫抑制与淋巴细胞活化功能平衡失调可能是结核性胸腔积液的形成机制之一，CD69可能成为结核性胸腔积液治疗的潜在靶点。
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▲ 广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题 编号：Z2015676。
▲基金项目：国家自然科学基金项目（30972700）；广西自然科学基金项目（2012GXNSFAA053128）。
论文作者:覃雪军,韦碧妙,李凤献,银维谋,韦彩周（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2015年9期供稿
论文发表时间:2015/12/18
标签：淋巴细胞论文; 胸腔论文; 积液论文; 胸膜论文; 结核性论文; 患者论文; 细胞论文; 《航空军医》2015年9期供稿论文;