承德医学院附属医院胸外科，河北 承德 067000
【摘要】目的:探讨食管癌TIP60的表达及其与临床病例特征相关性。方法:选择本院2017-01-01至2019-01-01行手术治疗的食管癌患者48例，采用免疫组化及蛋白质印记法检测TIP60在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，并分析TIP60表达量及其与临床病例特征的相关性。结果:TIP60在食管癌组织中的阳性表达（77.08%）高于癌旁正常组织中的阳性表达（22.92%），差异有统计学意义（p＜0.05），且TIP60与食管癌的临床病例特征存在一定的相关性。结论:TIP60在食管癌组织中呈高表达，与食管癌的发生、发展具有一定的相关性。
【关键词】食管癌 TIP60
Preliminary study on the expression of esophageal cancer Tip60 and its correlation with clinical case characteristics
Abstract Objective：To investigate the expression and clinical features of esophageal cancer TIP60.Methods: forty-eight patients with esophageal cancer who underwent surgical treatment from 2017-01-01 to 2019-01-01 in our hospital were selected. The expression of TIP60 in esophageal cancer tissues and adjacent normal tissues was detected by immunohistochemistry and protein imination, and the correlation between the expression level of TIP60 and clinical characteristics was analyzed.Results: the positive expression of TIP60 in esophageal cancer tissue (77.08%) was higher than that in normal tissue adjacent to cancer (22.92%), the difference was statistically significant (p < 0.05), and TIP60 was correlated with the clinical characteristics of esophageal cancer.Conclusion :TIP60 was highly expressed in esophageal cancer tissue, which was correlated with the occurrence and development of esophageal cancer.
Key Words：Esophageal cancer
食管癌是一种常见的恶性肿瘤，常见于40岁以上的男性群体，我国作为食管癌的高发区，每年约有15万人死于此疾病。由于食管癌的早期症状轻微，确诊时大部分患者为中晚期，已错过最佳手术时机。目前对于食管癌的治疗主要以手术切除、放化疗结合的方案，但远期治愈率和存活率仍不容乐观。因而寻求一种早期诊断和治疗的新方法并使之发展成熟，有助于解决上述问题。TIP60是一种具有乙酰转移酶活性的蛋白，在细胞内参与了 DNA的损伤与修复、转录调控等过程，因此 TIP60与肿瘤细胞的发生发展必定存在着某些联系。因此本课题通过免疫组化法及蛋白印记法测定 TIP60在食管癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，并对 TIP60与食管癌临床病例特征做初步研究。
1.1标本来源
收集本院2017-01-01至2019-01-01行手术治疗的食管癌患者48例作为研究对象。食管癌组织及其相应的癌旁正常组织（距离癌旁＞3cm）均为食管癌根治术切除标本，均经病理科检查确诊。48例食管癌患者中， 32例为男性，女性为16例；60岁以上患者34例，60岁以下患者14例；26例有饮酒史，22例无饮酒史；分化程度 高分化24例，中分化20例，低分化4例；TNM分期 I期18例，Ⅱ期24例，Ⅲ期6例；无淋巴结转移者为36例；有淋巴结转移者为12例。
1.2主要仪器与试剂
TIP60多克隆兔抗体购买于GeneTex公司；β-Actin抗体购自Abclonal公司；蛋白marker购自thermo公司；免疫组化试剂盒、DAB显色液购自中彬公司；ECL发光液、快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳液、转膜液购自zomanbio公司；粘附载玻片购自世泰公司。仪器选取自承德医学院中心实验室。
1.3免疫组织化学检测
选取所需标本，标本经过10％的中性二甲苯固定，石蜡包埋，应用切片机切成4um厚石蜡切片，应用二甲苯每次15min，脱蜡3次，应用100%酒精每次15min，脱水3次，应用免疫组化试剂盒（购于中彬公司），按照SP法和说明书进行试验。采用TIP60多克隆抗体（购于GeneTex公司），阴性对照为癌旁正常组织。按照染色强度（无染色，浅黄色、棕黄色、棕褐色）分为03分；每张切片在光学显微镜下取5个高倍视野（×400），观察后取平均分，阳性率为：＜5％、5％-25％、26％-50％,51％-75％，＞75％，计分为04分。把两项相乘后记为最后评分，即：0-2分阴性（-），3-4分弱阳性（+），5-8分中度阳性（++），9-12分强阳性（+++）。并由两位有经验的病理科医师进行阅片。
1.4蛋白质印记法
将冰冻组织标本先裂解然后超声匀浆，进行离心，并通过BCA蛋白定量法测蛋白浓度，吸取45ug总蛋白，行8％SDSPAGE电泳，转膜（150毫安，2小时）印迹于PVDF膜上，应用5％脱脂奶粉FIBS液封闭4℃过夜，将PVDF膜37℃放置半小时后加入TIP60抗体（1:2000多克隆抗体）抗体孵育2小时，TBST液洗膜3次，每次10分钟，二抗孵育：加入1:2000抗TIP60二抗和β-actin， 37℃孵育2小时，应用TBST洗3次，每次5分钟，应用ECL法检测。暗室曝光，应用（Tanon-6100）全自动化学发光仪 ，并且应用imageJ软件分析条带的灰度值，以TIP60/β-actin代表TIP60蛋白的相对表达量。
1.5统计学方法
选取实验结果，应用SPSS20.0统计学软件对实验结果进行统计分析。
2.结果判定
2.1 TIP60在食管癌与癌旁正常组织中的表达
TIP60经染色后成棕褐色，主要定位于食管癌细胞胞质中，经统计分析后得知TIP60在食管癌组织中阳性表达率为77.08%（图A1 A2），在癌旁正常组中的表达率为22.92%(图B1 B2)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
图A1、A2为TIP60在食管癌组织中的表达情况；图B1、B2为TIP60在癌旁正常组织中的表达情况（×400）
2.2 TIP60与食管癌临床病例特征的相关性
实验结果显示，TIP60与食管癌TNM分期、组织分化程度及淋巴结转移与否存在一定相关性，差异有统计学意义（P<0.05）；与患者性别、年龄、饮酒与否无相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。见图C ；表1-2。
3.讨论
食管癌是危害人类健康的重要疾病之一，而我国食管癌的发病率和死亡率均居于世界首位， 5年生存率极低 [1]。研究表明食管癌从发生到发展是一个多阶段、多基因参与的复杂过程。Tip60（ Tat interaction protein60 KD）最初被发现是在 HIV病毒蛋白 Tat相互作用时，作为细胞内的一种乙酰转移酶蛋白被发现 [2]，测量其分子质量为60 kDa，所以命名为 Tip60。Tip60是一种属于 MYST家族的蛋白，通过既往的研究表明其具有乙酰转移酶活性，可以通过其乙酰转移酶活性，将乙酰辅酶 A的乙酰基团直接转移到组蛋白的赖氨酸残基上，直接改变染色质结构，同时一些特定蛋白的与染色质之间的相互联系、作用也需要通过 Tip60的调整。当 Tip60这种乙酰转移酶活性同时与其他转录修饰的方式同时作用时，就创造了一种多点修饰模式，使许多包括转录因子在内的不同蛋白易于识别，发生结合，这种方式促进了基因表达的调控、 DNA的损伤修复以及细胞周期进程等过程的顺利进行[3]。相关资料显示， TIP60对细胞损伤反应的主要作用机制有参与细胞内的信号传导、 DNA的损伤修复、转录调控同时还参与感受 DNA损伤和启动凋亡。而对 Tip60在转录调控过程中作用的研究发现， Tip60存在两重作用，其可以通过乙酰转移酶活性激活目的基因的转录，也可以过集合组蛋白的去乙酰化酶将其转移到目的基因的启动子上抑制基因的转录[4-5]。因此，TIP60作为一种多功能蛋白，在细胞内参与了多种生物进程，在肿瘤的发生、发展过程中充当了重要角色。
通过相关文献得知，很多学者对 TIP60在癌组织中的表达情况及其与临床病例特征之间的相关性做了一定研究。王绍华等人研究证实了 TIP60在膀胱尿路上皮癌组织中的表达阳性率明显高于癌旁正常组织，在不同分化、浸润深度的患者癌组织中表达有显著性差异，伴随着肿瘤向外浸润深度的加深， TIP60染色阳性率也随着逐步增高，而与肿瘤分化程度成负相关，同时发现 TIP60在有淋巴结转移的患者中表达高于无淋巴结转移患者[6]。刘晓兰等人研究证实了 TIP60在宫颈癌癌组织中的表达情况明显高于癌旁正常组织，同时推断 TIP60与 P53及 PDCD5之间的相互作用促进了肿瘤的发生[7]。有国外学者认为，在雄激素受体（AR）持续活化导致的难治性前列腺癌( CRPC)中，Tip60过表达可使 AR在无雄激素的情况下发生核定位，促进前列腺癌细胞的增殖。因此，抑制Tip60可能是CRPC治疗的另一种方法[8]。同时还有学者研究了TIP60在其他不同肿瘤组织中的表达情况，结果证实TIP60的表达情况与肿瘤的发生发展存在一定的相关性[9-11]。
本次研究证实了 TIP60在食管癌组织中呈高表达状态，通过分析得知 TIP60与食管癌的临床病例特征存在一定的相关性，因此，TIP60在食管癌的发生发展中发挥了重要作用，TIP60日后可能会成为推断食管癌发展结果的一个新指标及治疗食管癌的一个新靶点。
4.参考文献
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论文作者:白宇航 梁宗英 辛国华 侯继申 张乐 张志民 赵宝山
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第11期
论文发表时间:2019/8/15
标签：食管癌论文; 组织论文; 蛋白论文; 乙酰论文; 相关性论文; 转录论文; 病例论文; 《医师在线（学术版）》2019年第11期论文;