1武警四川省总队医院 四川 乐山614000；2乐山市人民医院 四川 乐山614000
作者简介：吴琳琳，女，39岁，副主任药师，硕士研究生，主要从事麻醉药物机制研究；叶伟，男，34岁，主治医师；黄伟，男，35岁，主治医师；庞波，男，39岁，副主任医师，本科，主要从事临床研究。
【摘要】目的 明确右美托咪定对大鼠体感皮层神经元延迟整流钾离子通道电流峰值和激活过程的影响。方法 通过大鼠脑片全细胞膜片钳记录技术，测定不同浓度右美托咪定（0.1~10μM）对体感皮层神经元的延迟整流钾离子电流以及通道激活过程的影响。结果 右美托咪定呈浓度依赖性的抑制大鼠体感皮层神经元延迟整流钾离子通道电流，IC50为7.2μM，但对延迟整流钾离子通道的稳态激活曲线无明显影响。结论 右美托咪定对大鼠体感皮层神经元延迟整流钾离子通道的抑制作用是其中枢作用机制之一。
【关键词】右美托咪定；钾离子通道；膜片钳；体感皮层
【中图分类号】R971.3【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0349-02
Effects of dexmedetomidine on the neural delayed rectify potassium channel in somatosensory cortex of rats
[Abstract] Objective To study the effects of dexmedetomidine on the current amplitude and activation process of neural delayed rectify potassium channel in somatosensory cortex of rats. Methods Whole cell patch clamp recording technique was used to record the current amplitude and activation process of neural delayed rectify potassium channel under different concentration of dexmedetomidine (0.1~10μM, six neurons were tested in each concentration). Results Dexmedetomidine inhibited the neural delayed rectify potassium channel in a concentration dependent manner, the IC50 was 7.2μM, but showed no obvious effect on the steady-state activation curve of the neural delayed rectify potassium channel. Conclusion The inhibitory effect of dexmedetomidine on the neural delayed rectify potassium channel may contribute to the central mechanism of dexmedetomidine.
[Keywords] Dexmedetomidine; potassium channel; patch clamp; somatosensory cortex
右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）是选择性α2-肾上腺素受体激动剂，具有抗交感、镇静和镇痛等作用[1-3]。右美托咪定的镇静作用主要是因为该药解除了脑干蓝斑核团对下丘脑腹外侧视前核的抑制[4]。研究发现，右美托咪定能够调控嗜络细胞瘤细胞上的L型钙离子通道[5]。此外，右美托咪定还具有抑制下丘脑室旁核神经元或胶质细胞上的延迟整流钾离子通道的作用[6]。这些研究提示右美托咪定对神经元离子通道的影响可能是其重要的作用机制。
电压门控钾离子通道（Voltage-gated K+，KV）是调控神经元兴奋性的关键离子通道[7]。延迟整流钾离子通道（delayed rectifier K+，KDR）是电压门控钾离子通道家族中的一员，只在神经元膜上表达，是影响神经元动作电位时程和传递的关键离子通道[8]。在快发放神经元（Fast-spiking neurones）, 延迟整流钾离子通道的慢失活特性使得神经元动作电位能保持高频率发放[9]。更为重要的是，神经元突触末端的延迟整流钾离子通道还参与调控钙离子内流和相应的神经递质在突触间的传递过程[10, 11]。
然而至今还未有研究发现右美托咪定是否能够改变神经元上电压门控钾离子通道的通道特性，从而影响神经元膜电位、动作电位以及相应的神经递质的突触传递。本研究为了明确上述问题，采用可保持神经元活体环境的脑片膜片钳技术，探讨右美托咪定对大鼠体感皮层神经元延迟整流钾离子通道特性的影响，并分析相关中枢作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要溶液与试剂 人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid, ACSF）成分（mmol/L）：NaCl 126、KCl 25、MgSO4?7H2O 1.5、CaCl2 2、NaH2PO4?2H2O 1.5、NaHCO3 25和Glucose?H2O 10，pH 7.35-7.45；电极内液的成分（mmol/L）：KCl 120、CaCl2 1、HEPES 10、EGTA 10、Na2ATP 3、MgCl2 2、Tetrodotoxin 0.001，pH7.2。其中Tetrodotoxin购买自Sigma公司，用于阻断电压门控钠离子通道，其余试剂为国产分析纯。
1.2 脑片制备 7~14天鼠龄SD大鼠，迅速断头取脑并置于置于氧混合气（95% O2+5% CO2）饱和的ACSF中冷却约5min。于低温环境下快速修切脑片，得到含有初级感觉皮层（根据大鼠脑立体定位图谱，Bregma 后2mm，中线旁5.5mm，深度为0.8-1.5mm）的脑组织块。使用震荡切片机（Thermo，HM 650V，美国）将脑组织块切作厚度为300μm 的脑片，并转移氧饱和ACSF 孵育槽中， 25℃下孵育1 h。
1.3全细胞记录模式下记录延迟整流钾离子电流 孵育好的脑片移入脑片记录浴槽中，将体感皮层区域移至视野中央，在红外摄像头监视器（Dage，IR-1000，美国）下寻找定位锥形神经元。玻璃记录电极内充灌电极内液，显微镜下利用微操控器（Sutter，MP225，美国）使电极尖端缓慢靠近神经元，过程中保持玻璃电极内正压，使其内电极内液不断外喷，“冲洗”神经元表面。释放玻璃电极内正压时，神经元膜将回弹并包裹电极尖端，当电极尖端与神经元膜之间形成高阻抗封接（大于1 GΩ）后，负压破膜，使电极内液与细胞内液相通，形成全细胞记录模式。电信号由膜片钳放大器（Axon, 700B, 美国）记录，低通滤波频率为3 kHz，采样频率分别为2 kHz。延迟整流性钾电流检测参数：钳制电位-40mV~+90mV，脉冲宽度160ms，步幅+10mV的去极化脉冲刺激。右美托咪定溶解于ACSF 分别形成0.1μM、1μM、5μM和10μM的终浓度，在实验过程中以2~3 ml/min 速度进行灌流给药。
1.4 浓度依赖曲线和稳态失活曲线的计算 药物浓度依赖曲线的计算过程为：钳制电位由-50mV去极化至+50mV，分别记录在上述设定的6个浓度右美托咪定灌流下，去极化刺激引出的延迟整流钾离子电流幅度并代入Hill方程： ，其中y是延迟整流钾离子电流的标准化幅度，[DEX]是右美托咪定浓度，n是Hill系数，IC50 是半数抑制浓度，α是标准化后的电流幅度。稳态失活曲线的计算过程为：设计-60mV~+60mV，步幅为+20mV的去极化脉冲，记录每条去极化刺激引出的延迟整流钾离子电流幅度并标准化，将脉冲电压值和标准化后的电流值代入Bolezmann方程： ，其中Imax代表延迟整流钾离子电流的最大值，V是脉冲电压，a是通道半数失活时的膜电位，b是失活曲线的斜率因子。
1.5 统计分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计处理，计量数据以±s表示。组间电流幅度比较采用独立样本t检验，失活曲线率的比较用χ2检验。P < 0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1不同浓度右美托咪定对延迟整流钾离子流峰值的影响
图1A是延迟整流钾离子流的原始轨迹图，由从-40 mV至+90 mV，持续160ms的去极化跃阶脉冲诱出。随着右美托咪定的浓度加大，延迟整流钾离子流峰值逐渐降低。图1B是根据不同浓度右美托咪定对延迟整流钾离子流峰值的抑制作用拟合得到的浓度依赖曲线，根据曲线得到IC50为7.2μM。
Fig.1 Effects of different concentrations of dexmedetomidine on the current amplitude of delayed rectifier potassium channel. A, the depolarizational step pulse (-40 mV to +90 mV) that elicit the current amplitude of delayed rectifier potassium channel; B, concentration dependent curve of dexmedetomidine on the current amplitude (n=6)
图1不同浓度右美托咪定对延迟整流钾离子流峰值的影响。A，由-40 mV至+90 mV去极化跃阶脉冲诱出的延迟整流钾离子流峰值；B，右美托咪定对延迟整流钾离子流峰值抑制作用的浓度依赖曲线（n=10）
2.2右美托咪定对延迟整流钾离子通道激活过程的影响
图2是由Blotzmann方程拟合得到的延迟整流钾离子通道激活曲线。右美托咪定7.2μM（IC50）作用下，延迟整流钾离子通道激活曲线未出现明显的偏移 （n=10）。此外，从表1可以看出，当右美托咪定浓度增加到10μM以上后，延迟整流钾离子通道激活曲线的半数激活电压和斜率分别有减少和升高的趋势，但均无统计学意义。
3 讨论
本实验结果显示在大鼠脑片体感皮层神经元，右美托咪定可呈浓度依赖性的抑制延迟整流钾离子电流峰值，但不影响延迟整流钾离子通道的激活过程。提示延迟整流钾离子通道参与了右美托咪定对神经元的抑制作用。
大鼠脑皮层神经元电压门控钾离子电流由瞬间外向和延迟整流两种外向电流成分组成[12]：（1）瞬间外向钾离子通道，它在快速去极化过程中迅速激活，通道开放表现为瞬间外向电流，随之快速关闭，形成一个电流峰，在约20 ms后融入延迟整流钾电流中，对通道阻断剂 4-氨基吡啶敏感；（2）延迟整流钾通道，这是一种外向整流钾通道，膜去极化时经过延迟才激活，基本上不失活，对TEA、Cs+等比较敏感。延迟整流钾离子通道激活电压较高，开放速度较慢，且没有时间依赖性，只能随电压的降低而关闭，主要参与动作电位的复极化过程，是影响动作电位时程的主要因素[13]。抑制钾离子通道，可以改变动作电位形态，使动作电位增宽，延长相对不应期，从而使动作电位发放频率减慢，导致信号传导抑制。可见，右美托咪定对延迟整流钾离子通道的抑制作用将会干扰神经元产生和传递动作电位，最终阻碍中枢神经系统电信号的有效整合。
本实验发现，在脑片模型中，右美托咪定对皮层神经元延迟整流钾通道的半数抑制浓度是7.2μM。这一浓度要高于其他研究在培养神经元模型下测得的数值[14]。推测原因是脑片模型保留了神经元周边正常的组织结构，右美托咪定需要更高的浓度才能渗透到被组织包埋的神经元而发挥作用。但值得注意的是，本实验测得的半数抑制浓度要远远高于右美托咪定产生镇静作用时的平均血浆浓度（4-10 nM）[15, 16]，这就提示右美托咪定对皮层神经元延迟整流钾通道的抑制作用可能不是右美托咪定镇静作用的主要原因。
由于右美托咪定是选择性α2-肾上腺素受体激动剂，所以多数研究右美托咪定中枢作用机制的报道都将α2-肾上腺素受体作为研究对象，而本研究发现，右美托咪定能够直接抑制皮层神经元上的延迟整流钾离子通道电流。但相关机制还有待近一步研究。不过根据现有的研究来看，右美托咪定对延迟整流钾离子通道的抑制作用可能与右美托咪定化学结构上的咪唑啉部分有关[17]。细胞实验证明，其它含有咪唑啉结构的药物都具有抑制延迟整流钾离子通道的作用[18]。此外，右美托咪定还被证明能够通过与咪唑啉Ⅱ型受体结合，从而激活细胞外磷酸化激酶[19]。这些研究结果都提示咪唑啉受体可能也是右美托咪定中枢作用的靶点。
总之，本实验证明了右美托咪定对脑片状态下皮层神经元的抑制延迟整流钾离子通道具有抑制作用。鉴于延迟整流钾离子通道参与构建神经元的兴奋性和自动节律性，右美托咪定对延迟整流钾离子通道的抑制作用可能是其干扰中枢神经系统信号传递的机制之一。
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论文作者:吴琳琳1,叶伟2, 黄伟2, 庞波2通讯作者
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/11/2
标签：离子论文; 神经元论文; 通道论文; 浓度论文; 皮层论文; 电流论文; 抑制论文; 《中国医院药学杂志》2016年9月论文;