张训海[1]2003年在《鸡马立克氏病监测技术的研究及应用》文中指出通过对商用CVI988疫苗细胞培养上清液浓缩与检测，鉴别出了其分泌性抗原成分，且琼扩滴度可达到1：4，而用该疫苗分别免疫SPF鸡和罗曼鸡后，在免疫后第3～8周内均未检测到特异性羽囊病毒沉淀抗原，但该羽囊浸提液经15～20倍浓缩后再测，则在免疫后第3～4周。SPF鸡和罗曼鸡都呈阳性，其后则迅速减小。在对商品CVI988疫苗和HVT(Fc-126)疫苗免疫及其免疫强毒感染的SPF鸡，分别进行羽囊病毒沉淀抗原和血清病毒沉淀抗体的检测。结果显示，单纯免疫鸡群均呈阴性；CVI988免疫接毒后的第一周即可检出羽囊病毒沉淀抗原，较HVT免疫接毒组早2周；而循环沉淀抗体的出现，却较HVT免疫接毒组迟2周，与同期攻毒对照组沉淀抗体的检出时间相当。此外，接毒后的第7～18d，尤其是9～18d，在接毒对照组的血清中发现有MDV沉淀抗原。我们对上述的检出现象分别进行了初步分析和较合理的解释。应用该MDV抗原和抗体同步琼扩检测法，对以安徽省为主的29个的县市部分饲养鸡群随机进行了MD污染状况的调查。结果表明，在调查的8个品种(系)、日龄幅度为31～434d的93个不同免疫状况饲养群中，呈检测阳性的为76个群，总阳性率为81.7％(76／93)。在有效检测报告为阳性的1386只(总计2071)鸡中，则MDV琼扩抗原和抗体的检出阳性率分别为34.1％(472／1386)和64.7％(866／1386)，剔除其中的抗原和抗体阳性重迭部分(＞115只)，MD污染鸡群琼扩法总检出阳性率达88.3％(1223／1386)。此结果与已报道的MDV分子生物学检测方法在其它地区的调查结果有较好的符合率。 由此并综合我们以往的研究结果，进而得出以下结论：疫苗CVI988和HVT的免疫鸡，虽然都含有不能为常规AGP法直接检测到的阶段性且低水平的羽囊MDV抗原，但并不影响羽囊病毒抗原经典AGP法对鸡群MDV强毒感染的特异性诊断；单纯疫苗CVI988和HVT的免疫抗体可能是低水平的，故亦不能被敏感性较低的经典AGP法所检出；在感染鸡的羽毛囊中所发现的MDV抗体，且其消长与血液中的病毒抗体消长呈正相关；而与羽囊病毒抗原消长呈负相关。MDV琼扩抗体与琼扩抗原一样，都是鸡只MDV强毒感染的特异性指征；该抗原和抗体的同步琼扩检测法对MDV强毒污染的检测，不仅简便、快捷、特异，而且重复性好、准确率高，可作为MDV强毒感染诊断的标准技术与方法。
张颖[2]2006年在《鸡马立克氏病病毒TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用》文中提出马立克氏病(MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病。该病广泛流行是严重危害家禽的传染病之一。致病因子为马立克氏病病毒(MDV),属α-疱疹病毒,包括1、2、3叁种血清型,抗原有血清学交叉反应。MDV常与其它病原混合感染、活苗免疫的干扰以及MD的亚临床感染,加大了该病诊断、鉴别诊断及监测的难度。MD是迄今为止唯一可用疫苗预防的肿瘤性疾病,目前活疫苗免疫仍是预防该病的主要手段,疫苗的质量控制和免疫效果,是成功的预防该病发生的关键。MD疫苗包括单价及多价疫苗,均为活疫苗。不同血清型疫苗毒在鸡体内的复制以及野毒感染的监测是有效控制该病的关键。为解决这一问题,本课题研究建立了鸡MD叁种血清型病毒的TaqMan探针双重实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并将其应用于临床诊断、叁价苗的研制及疫苗免疫监测。据已发表叁种血清型病毒的特异性基因序列:Meq基因、DNA聚合酶基因、SORF1基因,鸡的管家基因卵铁转蛋白基因,设计并合成四对引物,四条TaqMan探针;将PCR扩增的特异片段分别克隆入T载体,并转化入大肠杆菌DH5a中。鉴定后的重组质粒,作为阳性标准品用于双重FQ-PCR的建立。进行FQ-PCR扩增,获得了标准曲线,并进行了该方法的敏感性、特异性、重复性试验研究,初步建立了MDV的双重FQ-PCR检测方法。在国内首次将建立双重FQ-PCR方法应用于临床检测,并与琼脂扩散试验(AGP)和PCR结果相比较。FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP,达100﹪;该方法的灵敏度比常规PCR高10-100倍,在单位细胞内可灵敏地检测到2.01-2.78个拷贝的病毒。第一次将该方法应用于MD叁价苗的研究,确定了制备疫苗时叁种血清型病毒的有效接种范围、最佳接种剂量及单位蚀斑的病毒载量。应用FQ-PCR对单价苗、叁价苗在鸡体内的增殖进行免疫监测。本试验在国内首次建立了MDV双重FQ-PCR检测方法,在量化的标准上对鸡体内的疫苗毒和强毒予以区别,可作为MD特异性诊断标准。具有特异性强、敏感性高、可在1.5-2h内快速完成检测的特点。试验成功地鉴别出叁种血清型病毒,研究叁种血清型病毒的体外增殖规律,为确保疫苗的质量提供良好的依据,也为多价苗生产提供了可靠而快速的产品检测和质量控制手段。可动态定量地监测病毒在鸡体内的增殖情况,为疫苗的免疫效果评估提供了有效的方法,也为深入研究疫苗免疫机制提供了一条可行途径。
李晶梅[3]2008年在《马立克氏病病毒在鸡体内的复制动力学研究》文中研究说明马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒血清1型(Marek’s disease virus serotype 1,MDV1)引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病。该病广泛流行,是一种严重危害家禽的传染病。MDV1的致病机制比较复杂,病毒在体内的复制情况也不是十分清楚。一些研究表明,MDV1在体内复制的各阶段与MD病程存在对应关系;MDV1在体内的复制状况与其致病性及传播能力直接相关;通常,引起鸡MD高发病率、高死亡率的MDV1强毒具有在鸡体内复制率高的特性。本实验选择近年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株/超强毒株、弱毒疫苗814株和国内标准MDV1强毒J-1株,分别人工感染SPF鸡。采用TaqMan探针双重荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase-chain reaction,FQ-PCR)方法,动态检测感染后1～28d病毒在淋巴细胞、羽髓、脾脏、胸腺、肝脏、肾脏和脑的复制状况。意在研究不同致病力MDV1在鸡各组织脏器的复制动力学特性,探索MDV1体内增殖规律与其致病性的关系。同时对近年国内MDV1流行株与80年代分离的国内标准MDV1强毒J-1株进行比较,以期发现流行株在复制动力学方面具有的新特性。研究结果表明:1.接种后7d羽髓中病毒含量开始显着增加,各株病毒在淋巴细胞、胸腺、脾脏、脑、肾脏、肝脏中载量在接种14d左右开始明显小于其在羽髓中的载量。羽髓中病毒14～21d达到高峰,强弱毒株病毒载量达到高峰的时间相近,超强毒株峰值处病毒载量可达到107copies/106 cells,峰值期的病毒载量是感染前期(1～7d)的100～10000倍。2.胸腺和脾脏中病毒载量在感染的第5～7d出现高峰,超强毒株峰值处病毒载量可达到107copies/106cells,7～10d时病毒载量降低,随后稳定缓慢上升。3.强毒株与弱毒株相比,前者在体内的病毒载量更高,复制能力更强。本实验系统的绘制了MDV1疫苗814株和国内标准强毒J-1株在体内各组织脏器的复制动力学曲线,并对近年国内不同地区MDV1现地分离株在体内的复制动力学进行研究。研究表明,MDV1致病性与在其在体内的复制能力显着相关。国内流行株复制动力学特性与多年前的强毒株相比发生显着变化,在鸡体内增殖能力更强,并且能达到更高的载量水平。溶细胞感染期,在胸腺、脾脏中的病毒载量达到最大值,并且显着高于其它组织或脏器。感染14d后羽髓中病毒载量显着高于其余组织脏器。MDV强毒株在羽髓中的载量均能达到106copies/106cells以上,这可作为MD诊断的参考指标。本论文首次准确地定量研究了不同毒力MDV1毒株及MDV1流行毒株在鸡体内不同组织、器官内复制规律,为MDV1的致病机制研究、流行变异、诊断及MD新疫苗的研制新提供了实验及理论依据。
李勇生[4]2006年在《凉州区鸡马立克氏病流行病学调查与病理学研究》文中认为鸡马立克氏病(MAREK`S DISEASE MD)是鸡最严重的传染病之一,可以引起鸡较高的发病率和死亡率,严重影响鸡产业的健康发展。凉州区是我省养鸡业较为集中的地区,近几年出现了鸡马立克氏病新的流行,并有向周边地区扩散的趋势,值得广泛重视和研究。本文通过广泛查阅资料、走访养鸡户、血清学检测和病理学研究等方法,对MD的流行病学、临床症状、病理变化、诊断方法和防治措施等方面进行了详细的调查和研究。结果如下:1.2001年～2005年,MD在凉州区流行的特点和规律是:主要流行皮肤型、神经型和内脏型鸡马立克氏病。2001年～2005年发病率依次为:0.12%、0.14%、0.10%、0.09%、0.07%,病死率依次为88.1%、89.2%、93.1%、90.4%、90.5%;且多发生于肉鸡和饲养密度较大的鸡场;没有明显的季节性,多发于冬春季节;环境卫生较差和饲养管理不善可诱发本病。2.发病后应用疫苗免疫是预防本病的唯一途径,可减轻危害。3.病理学研究结果表明:皮肤型病变主要是肿瘤性滤泡形成;外周神经主要表现为增生性病变和渗出性病变;内脏病变为增生性的,血管周围都有显着的细胞增生,局部组织会发生变性坏死,并被瘤细胞取代。4.目前防制工作中存在的问题是:政府重视程度不够;引种检疫不严;消毒隔离措施不到位;养殖环境较差;从业人员不专业,存在侥幸心理;隐瞒疫情等。结合目前MD流行的实际情况和病理学特点,应该采取的措施是:安全引种、群防群治、全进全出、免疫预防、隔离消毒、加强免疫。
韩烨[5]2005年在《不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究》文中进行了进一步梳理本研究首次定位了马立克氏病毒(MDV)整合在宿主细胞大、中染色体的端粒附近,从而提示马立克氏病(MD)的形成与宿主细胞端粒结构有着密切的关系。两种MDV 强毒株均引起MD 肿瘤病的发生,且鸡的端粒酶活性在没有临床症状和可视病变出现之前就被激活,并与病毒血症的动态呈显着正相关。马立克氏病淋巴瘤细胞系MDCC-MSB1 的高水平的酶活性,再次阐明端粒酶在禽类病毒性肿瘤疾病中的作用;同时对酶活性大小和催化亚基的表达强度做了相关分析。meq 基因是MDV 的主要致瘤基因,MDV 强毒株在潜伏感染阶段,可同时检测到meq 和L-meq 基因,而L-meq 的检出恰好是端粒酶水平较高的阶段。MD的发病进程、特别是MDV 的潜伏感染,在某种程度上与meq 基因的变化和端粒酶活性的动态具有一定关系;MDV 强毒株在CEF 上高次数传代,均未发生meq基因的改变。本文从宿主细胞和病毒本身入手,为阐明MD 的发病机理提供可靠的理论依据,这将有助于阐明人类肿瘤的发生机理,为预防和治疗肿瘤提供理论依据,必将产生较大的经济效益和社会效益。
徐慧[6]2006年在《东营地区鸡马立克氏病流行病学调查与防制方法的改进》文中提出马立克氏病是由疱疹病毒引起的一种淋巴细胞增生性、高度接触性传染病。特点是病鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤等发生淋巴细胞浸润，肿大，形成肿瘤。引起该病的马立克氏病病毒毒株种类较多，毒力的差别很大；传播方式很多，传播迅速；所造成的死亡率很高，对养鸡业的危害极大。目前还没有有效的治疗药物，主要依靠免疫接种来防制该病。然而，由于马立克氏病病毒强毒株的出现，不但一往的免疫方法屡屡失败，马立克氏病的传播、流行更加严重，而且带有明显的地区流行病学特点。为探讨预防和控制该病的有效方法和对策，本论文针对山东省东营地区近3年内马立克氏病的流行情况，对该地区部分鸡群所发生的马立克氏病的流行病学特点进行调查，展开了有关免疫学检测、试验，并提出了适合当地情况的防制改进方法和建议，取得了如下的结果： 1．对山东省东营市及其附近养鸡比较集中、马立克氏病高发的9个县(市)其中包括广饶县、垦利县、利津县、淄博、桓台县、青州市、寿光市、诸城市和滨洲市的部分养鸡场(专业户)进行了马立克病流行情况调查、临床剖检、病料采集，结合实验室血清学、组织病理学和细胞学检测，共确诊了62个鸡群为马立克氏病。对马立克氏病的患鸡和死鸡进行剖检后，共观察到5种临床表现：神经型、内脏型、眼型、皮肤型和混合型，其中以内脏型为主，神经型次之。并对各种类型的组织病理变化分别进行了分析、总结。 2．利用马立克病病毒强毒株(MDV京-1株)进行人工攻毒、感染的方法，对国内外6种质量较好、蚀斑单位(PFU)均在4000单位以上的疫苗的免疫效力进行比较、评价。结果表明，在该攻毒条件之下，进口CVI988／Rispens和进口CVI988-Ⅰ型液氮苗2种马立克病细胞结合疫苗的免疫保护指数最高(96.16-100％)，显着高于其它4种，国产CVI988／Rispens液氮苗次之，但也显着高于其余3种冻干苗。这3种细胞结合疫苗的80日龄马立克病致死率均为0，且进口CVI988／Rispens、国产CVI988／Rispens和进口CVI988-Ⅰ型液氮苗在80日龄马立克病阳性率分别为0、6.90％和3.70％，表明其具有较强的抗病毒能力，对被免疫鸡群有很好的保护作用。相比之下，3种马立克病冻干疫苗(Ⅲ型HVT冻干苗、GA+SB—Ⅰ双价冻干苗、国产HVT+SB—Ⅰ双价冻干苗)在该攻毒条件之下，被免疫鸡群的80日龄马立克病致死率均在36.00％以上、80日龄马立克病阳性率均高达58.62％以上、免疫保护指数均低于25.94％。此证明，鸡群在类似MDV京-1株等马立克病强毒株攻击、侵染的情况下，无力发挥其保护作用。 3．在东营地区部分养鸡场或专业户，应用火鸡疱疹病毒冻干疫苗免疫失败且马
丁婵[7]2017年在《黄芩苷提取工艺优化及其抗马立克氏病病毒的作用研究》文中认为病毒性肿瘤病是一种自然性的常发病,严重的危害畜禽健康的重要疾病。肿瘤性疾病导致了畜禽的生产性能的下降,甚至死亡,对养殖户的经济造成了严重的损失。家禽T细胞的淋巴瘤就是主要由马立克氏病所引起,主要是对家禽体内的病毒提取出的样品进行诊断,做出判断。病毒是不断变异并且发展着的,马立克氏病的毒性也随之增强,疫苗的注射作用也是有局限性,所以,马立克氏病的防控以后还会遇到更多挑战。抗病毒方面,中药有不易出现耐药性、组分多、途径多、靶点也多的独特优势。据药理学研究报道,具有抗微生物、抗病毒、保肝、利胆和镇静等作用的黄芩苷,具有很好的临床应用价值。为了深入探讨黄芩苷的生物学活性,本研究拟探讨黄芩苷的提取工艺,建立黄芩苷的质量标准;以鸡马立克氏病为模型,进行黄芩苷体外、体内抗马立克氏病病毒试验,系统研究黄芩苷的抗病毒活性,并进一步阐明其作用机理,为临床获取能有效控制病毒所致肿瘤性疾病的黄酮类化合物提供依据,试验结果如下:1、黄芩苷含量测定方法建立:采用紫外分光光度法,以黄芩苷的标准品为原料,278nm处测定其吸光度,建立吸光度和浓度的标准曲线。黄芩苷标准曲线为A=0.0625C+0.005,R~2=0.9995。精密性、稳定性、重复性、加样回收均符合要求。2、正交设计法优选黄芩苷的提取工艺:采用热水煎煮提取法,通过叁水平叁因素的正交试验优化其提取因素,方差分析结果显示,提取次数为2次,料液比为1:25,煎煮时间为50 min时,黄芩苷的提取率最高,达到20.36%。3、黄芩苷对鸡胚成纤维细胞(CEF)最大安全浓度的测定:黄芩苷在中、低浓度能够促进CEF细胞的贴壁和生长且对CEF细胞的作用都是具有时效性的,应用了细胞病变的观察法和MTT法,测得了黄芩苷对CEF最大的安全浓度为312.5μg/mL。4、MDV细胞半数感染量(TCID_(50))测定:MDV的半数感染量TCID_(50)为10~(-4.5)/0.1 mL。5、黄芩苷体外抗MDV作用结果:增值抑制、感染阻断和直接杀灭叁种不同给药途径下,黄芩苷浓度在78.13~312.5μg/mL范围时都具有较好的抗病毒感染作用,并且感染阻断途径下黄芩苷浓度为156.25~312.5μg/mL时能够促进细胞的生长、直接灭活途径下,黄芩苷在浓度312.5μg/mL的时候能够促进细胞的生长。6、黄芩苷体内抗MDV作用结果:(1)通过利巴韦林组,黄芩苷高、中、低剂量组,病毒感染对照组的统计,正常对照组的死亡日龄数、肿瘤发生率、试验前后鸡体重变化情况等,明显得出黄芩苷高、中剂量组对病毒延缓发生优于阳性对照组和黄芩苷的低剂量组;(2)通过观察各组器官组织切片,也能直观的说明黄芩苷组能够降低MDV感染的病变程度。综上所述,正交法优化的黄芩苷提取工艺方法更加合理,得到了较高提取率的黄芩苷,用于临床上的延缓马立克氏病病毒的感染,并且通过将马立克氏病作为研究动物肿瘤病的模型进行研究,中药黄芩苷对动物肿瘤病的治疗是有开发前景的。
张洪海[8]2009年在《山东省家禽肿瘤性疾病流行病学调查及GIS预警系统的建立》文中研究表明禽肿瘤性疾病作为世界范围发生的疾病,严重危害养禽业的发展,具有重要的经济意义。其中危害最严重的主要包括马立克氏病(Marek’s disease,MD)、禽白血病(Avian leukaenia,AL)和网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)。这叁种肿瘤性疾病世界各地均有所流行,并且发生免疫失败和出现强毒力致病型毒株的报道不断增多,造成了巨大经济损失。所以有效预防和控制这些疾病将是我们今后研究的重点,也是当今巨大的挑战之一。本课题将结合血清学检测、临床诊断、病理组织学、免疫组织化学、PCR检测以及肿瘤相关的环境因素的调查研究,对山东省境内家禽肿瘤性疾病的流行现状做系统调查,及时掌握疾病感染所波及的范围及影响因素,寻找肿瘤的发生与病毒感染、环境因素之间的相关性,并结合地理信息系统(GIS),建立一套完整、系统的预警机制,从而对我省家禽肿瘤性疾病做到有效预防。血清学检测主要通过琼脂扩散试验、ELISA方法对山东省境内AA种鸡(4周龄以上)的MD、AL、RE进行抗原或抗体检测。此外,我们还通过血凝、血凝抑制试验对NDV进行抗体水平的检测,从而研究肿瘤性疾病与这些常规病之间的关系,以及抗体消长规律对肿瘤发生的影响。结果显示,MD、AL、RE在山东省境内的AA种鸡场普遍存在,MD平均抗原阳性率为3.38%,而AL、RE平均抗体阳性率分别为10.31%、40.36%。血凝、血凝抑制试验检测结果显示病毒性肿瘤疾病高发区域,新城疫抗体普遍较低。这表明感染肿瘤性病毒的鸡群体液免疫被广泛的抑制,对NDV疫苗的抗体生成能力有所下降。对山东省境内57份活鸡进行剖检取样,通过病理组织学观察和免疫组织化学检测结果表明,发病鸡在肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、骨髓等组织内存在MDV、ALV-J或REV抗原的阳性信号。所有被检鸡中有38.6%鸡只组织呈MDV抗原阳性,淋巴细胞增生灶中,可见阳性细胞成团或散在存在;有54.39%在骨髓、肝脏和肾脏等内脏器官中存在ALV-J抗原的表达,呈强阳性染色;28.07%检测病例为REV阳性;其中MDV+ALV-J双重阳性率为12.28%;MDV+REV双重阳性率为5.26%;ALV-J+REV双重阳性率为8.77%;MDV+ALV-J+REV叁重阳性率为3.51%。PCR检测结果表明MDV、ALV-J、REV的阳性率分别为43.86%、64.91%、33.33%,MDV+ALV-J双重阳性率为15.79%,MDV+REV双重阳性率为10.53%,ALV-J+REV双重阳性率为12.28%,MDV+ALV-J+REV叁重阳性率为7.02%。通过病理组织学观察发现肿瘤发生的部位主要在肝脏,其次依次为脾脏、腺胃、肾。免疫组织化学检测和PCR检测结果从病原学的角度表明,MDV、ALV-J和REV在我省的流行。利用PCR敏感性、特异性强的特点可以检测出带毒而未出现临床症状的鸡只,确定早期感染;而免疫组化则通过抗原定位确定病毒在机体内的分布情况以及代谢消长规律。实验显示免疫组化结果与病理组织学符合,肝脏、脾脏抗原阳性信号最多、最强;PCR阳性率明显比免疫组化阳性率高,MDV、ALV-J和REV免疫组化和PCR双阳性率分别为33.33%、52.63%、21.05%,免疫组化符合程度依次为76%、81.08%、63.16%。免疫组化和PCR检测结果表明所检鸡只存在早期感染和混合感染现象。通过对家禽所在环境因素的调查研究,把病毒感染和其它影响因素相结合,鉴定禽肿瘤危险因素之间的相关性,并根据群体暴露与生存环境等因素的相互作用,确定肿瘤危险度,并建立相应的数据库。通过对山东省境内20个种鸡场的饲养环境进行记录、分析、统计发现,鸡场本身环境的管理至关重要,特别要注意疫苗免疫、温度、湿度、通风、密度、等问题,调查发现肿瘤性疾病的发生与疫苗的污染有直接或间接关系,而温度、湿度过高或过低区域肿瘤阳性率均比较高;另外,场址的选择要结合所在区域的地形地貌、气候,并远离可能有污染的地方。本实验最终运用地理信息系统(GIS)技术,以山东省基础地理数据库为基础,结合禽肿瘤性疾病流行病学数据库,以软件工程模式开发建立了“山东省家禽肿瘤性疾病GIS预警系统”。本系统通过禽肿瘤性疾病地理分布研究疾病流行趋势,结合有关环境监测资料,进一步研究疾病发生与传染源、传播途径、易感动物的关系,以及区域性流行特征,并根据历年的疾病流行情况,通过地理信息动态分析,描绘流行趋势图,以掌握地区间的消长趋向,为防制家禽肿瘤性疾病提供科学依据。
张艳萍, 刘长军, 李晶梅, 刘爱玲, 施维松[9]2008年在《9株鸡马立克氏病毒野毒株在鸭胚成纤维细胞上的培育及鉴定》文中指出2006年～2007年我们从现地暴发鸡马立克氏病(MD)鸡场采集发病鸡羽髓,无菌处理后分别接种鸭胚成纤维细胞(DEF),蚀斑克隆纯化后,随机选1个单克隆,再接种DEF增殖,获得9株适应DEF生长的鸡马立克氏病毒(MDVs)野毒株,分别命名为ZY、FY、SY、YC、CZ、MS、CGZ、QQHE和DH株。应用聚合酶链式反应(PCR)技术分别扩增这9株的132bp重复序列,发现这9株MDVs基因组的132bp重复序列的拷贝数均为2个拷贝,符合MDVS强毒株的特点。从分离的9株MDVS中选择5株人工感染5日龄白来航SPF鸡,感染鸡60d后剖杀,发病鸡大多可见内脏肿瘤;其中3株MD阳性率达100%。我们培育并鉴定了9株适应DEF生长的MDVs流行野毒株,为监测我国现地MD毒株的变异和评价现有疫苗对MD保护效果提供有价值的研究材料。
杨洋[10]2016年在《含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究》文中指出鸡马立克氏病(Marek's disease, MD)是以淋巴组织增生、外周神经麻痹和脏器、肌肉、皮肤肿瘤为特征的肿瘤性传染病,严重危害世界养禽业的发展。马立克氏病病毒(MDV)在流行过程中,已经从温和型病毒株演进化为强毒株,并出现了超强毒株。常规疫苗对强毒的免疫保护效果并不理想,对超强毒株免疫保护更是不尽人意。科学家利用各种方法构建MDV候选疫苗,特别是利用基因工程研发重组疫苗成为当前研究的热点及突破点。目前有已经分离到多株自然整合有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒。最近研究表明REV的LTR可能赋予这种重组病毒某种选择性优势,LTR较强的启动子和增强子作用不仅能增强亲本病毒复制,而且不改变亲本病毒毒力,从而提高疫苗免疫力,这一优势为利用LTR改良马立克疫苗提供了保障。前期用MDV (JM/102W株)和REV(CSC株)混合感染鸭成纤维细胞(DEF),随后将细胞悬浮液接种于鸡,在鸡的羽毛囊内分离到一株含有LTR的重组马立克氏病病毒,并将该病毒中的LTR的基因片段连接到含有马立克氏病毒同源臂载体B40中,构建了带有LTR的供体穿梭质粒,并与CVI988/Rispens病毒基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在细胞中进行同源重组,产生整合有LTR的CVI988/Rispens重组马立克氏病病毒(rMDV-LTR)。本研究对rMDV-LTR进行生物安全评价和免疫效力试验,期望得到免疫保护作用好而又安全的重组马立克氏病毒活疫苗,开发一种能作为表达保护性抗原基因的活疫苗载体。1含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒生物学特性及感染与排毒检测将重组MDV分别通过鸡胚成纤维细胞(CEF)和SPF鸡的连续传代增殖,通过PCR法鉴定LTR基因是否插入,以及确定LTR在IRS和TRS的存在,进一步用测序的方法评价重组病毒插入基因的稳定性。在1日龄SPF鸡皮下接种重组MDV,通过非免疫同居鸡的羽囊和血液进行病毒分离、PCR检测等评估重组病毒水平传播能力。对1日龄鸡接种重组MDV后,通过对饲料、饮水、粪便、垫料等的病毒分离、PCR检测评估疫苗毒株在环境中的存活能力,通过对免疫鸡的组织病毒分离、PCR检测等评估重组病毒在免疫鸡体内的分布情况。试验结果表明重组马立克氏病病毒在CEF生长良好,以50.60 PFU/ml的病毒滴度感染CEF细胞,生长曲线结果表明,rMDV-LTR在培养前3 d空斑较少,在4 d空斑开始增加,在第5 d生长速度迅速加快,可持续增长到7 d。相比CVI988/Rispens母本株,在第2 d开始出现空斑,从第3 d开始匀速生长到第6 d生长达到高峰,随着病毒的传代病毒的繁殖能力不会改变。PCR及测序表明,插入片段LTR基因在传代病毒中稳定存在,且没有基因突变和缺失。重组马立克氏病毒经SPF鸡体内传代5代后,剖检没有明显肉眼病变,内脏组织结构清晰,没有明显病理变化。重组MDV接种1日龄SPF鸡,同时以母本株CVI988/Rispens做对照,非免疫同居鸡的组织病毒分离和PCR检测结果表明,重组马立克氏病毒具备向同居非免疫鸡进行水平传播的能力。排毒检测试验未从饲料、粪便、饮水及棉拭子中分离到病毒,因此重组病毒和CVI988/Rispens具有同样的安全性。2含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒免疫效力研究将1日龄SPF鸡分成8组,每组20只,皮下免疫0.2 mL的重组MDV,剂量分别为500 PFU/只、750 PFU/只、1000 PFU/只、2000 PFU/只和3000PFU/只,同时CVI988/Rispens母本株2000 PFU/只和3000 PFU/只(0.2 mL)作为阳性对照,PBS 0.2 mL作为阴性对照。接种10天后,各组分别以500 PFU/只(0.2 mL)的剂量接种vv MDV rMd5.攻毒后的每天跟踪记录各组有无临床症状或死亡情况。饲养60天后,全部扑杀并剖检观察其病变。采集疑似MDV病变的组织、脏器,然后每组随机选取5只分别取其组织、脏器做石蜡切片,HE染色,进行病理组织学观察,最后疫苗免疫效力由保护指数来评价。试验结果表明攻毒对照各组死亡率为85%,其余各组精神、采食和饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。因此,重组MDV与母本毒株具有相同的免疫保护效力。3含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒对靶动物、非靶动物的安全性评价将含REV-LTR基因的重组MDV、母本病毒CVI988/Rispens与PBS作对照,分别通过皮下注射途径对1日龄敏感雏鸡进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量免疫的安全性试验,对1日龄雏鸭和1日龄雏鹅最大剂量免疫试验,通过腿部肌肉注射途径对4周龄小鼠进行最大剂量免疫试验。疫苗免疫后,通过对试验动物的临床观察、生产性能测定、内脏组织器官变化和组织切片检查,评估重组MDV的安全性。试验结果表明,试验鸡、鸭、鹅和小鼠疫苗接种后,各组精神、采食、饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。综上所述,重组MDV对靶动物、非靶动物具有良好的安全性。
参考文献：
[1]. 鸡马立克氏病监测技术的研究及应用[D]. 张训海. 南京农业大学. 2003
[2]. 鸡马立克氏病病毒TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 张颖. 内蒙古农业大学. 2006
[3]. 马立克氏病病毒在鸡体内的复制动力学研究[D]. 李晶梅. 中国农业科学院. 2008
[4]. 凉州区鸡马立克氏病流行病学调查与病理学研究[D]. 李勇生. 甘肃农业大学. 2006
[5]. 不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究[D]. 韩烨. 吉林大学. 2005
[6]. 东营地区鸡马立克氏病流行病学调查与防制方法的改进[D]. 徐慧. 华中农业大学. 2006
[7]. 黄芩苷提取工艺优化及其抗马立克氏病病毒的作用研究[D]. 丁婵. 聊城大学. 2017
[8]. 山东省家禽肿瘤性疾病流行病学调查及GIS预警系统的建立[D]. 张洪海. 山东农业大学. 2009
[9]. 9株鸡马立克氏病毒野毒株在鸭胚成纤维细胞上的培育及鉴定[C]. 张艳萍, 刘长军, 李晶梅, 刘爱玲, 施维松. 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集. 2008
[10]. 含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究[D]. 杨洋. 扬州大学. 2016
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