徐路生[1]2002年在《一个新的生长抑制基因p28的克隆与功能研究》文中研究指明国家人类基因组南方研究中心在大规模cDNA测序的研究过程中获得数百个新基因全长cDNA。其中的一个基因(暂定名p28)与人类候选抑癌基因ING1具有同源性，蛋白水平氨基酸的一致性为37％，在C端存在PHD结构域，PHD上游还有一核定位信号(NLS)。ING1能够抑制细胞的生长、促进细胞的凋亡和老化，我们推测p28可能与候选抑癌基因ING1一样在细胞内具有重要的功能。本研究用RT-PCR的方法克隆到p28基因，构建了一系列p28的真核或原核表达载体，对此基因进行了功能研究。 p28基因全长cDNA长1377bp，其中编码区747bp，编码249个氨基酸，预测分子量为28.5KD。将p28的全长cDNA与基因组DNA序列进行比较，发现p28含有8个外显子，并将p28基因定位于12p13。Northern blot显示p28在多种组织和培养的细胞中表达，其中胎盘、骨骼肌、肾脏和心脏组织中表达较高，结肠和外周血淋巴组织表达较低。间接免疫荧光法显示p28定位于细胞核。 为了深入研究p28的功能，构建了GST-p28融合基因，进行了原核表达，纯化了GST-p28融合蛋白并免疫家兔，制备了抗p28的多克隆抗体，此抗体敏感性高，特异性强。另外，还建立了p28高表达的HepG2稳定细胞株，以这些细胞株为细胞模型研究发现p28高表达可以抑制细胞的生长，使细胞阻滞在G1期，并能促进细胞的凋亡。 ING1抑制细胞的生长是通过与p53相互作用来实现的。GST pull-down证实，p28与p53在体外也能发生相互作用，而且p28与p53的共定位分析表明p28与p53在核内的分布有重迭，提示p28与p53在细胞内也有相互作用的可能性。但这种相互作用在细胞内还不能被免疫共沉淀证实。为了研究p28与p53功能上的关系，我们有分析了p28对p53下游基因表达的影响，发现p28高表达能上调p53下游基因(如p21、Bax)的表达。p28高表达还能促进p21启动子调控的荧光素酶报告基因的表达。这些实验表明p28能够通过一个未知的机理促进p53的转录活性。哺乳细胞单杂交实验也表明p28可能是一个转录因子，并具有转录激活作用。 ING1基因在一些肿瘤组织中表达下调或发生突变，提示ING1基因具有抑癌基
王志民[2]2004年在《对虾白斑病毒（WSSV）囊膜蛋白蛋黄抗体及凋亡抑制基因ORF390R的研究》文中研究说明对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是一种具有囊膜的双链DNA病毒,是造成自1993年以来中国、东南亚及美洲等世界范围内大面积暴发对虾病毒性疾病的主要病原。该病传播速度快,感染虾群在3～7d内死亡率高达90～100%,对我国及世界的对虾养殖造成了严重的危害,而目前尚未有有效的防治方法。 本研究对水体温度在WSSV感染螯虾中起何种影响做了初步的研究。将螯虾培养在不同温度的水体中,通过注射来感染WSSV来观察死亡率的变化。经过RT-PCR以及组织切片等实验,说明低温可以影响WSSV在螯虾体内的繁殖,病毒在低温下可以在宿主体内长期存活。 用PCR的方法将四种囊膜蛋白基因扩增出来并克隆到pMAL-C2原核表达载体中。将表达的麦芽糖融合蛋白通过亲和层析的方法纯化出来,注射母鸡来产生对应的抗体。克氏螯虾的抗体中合实验结果显示,囊膜蛋白VP28与VP19的可以中合WSSV对螯虾的感染,而且这种综合是通过体内注射是浓度依赖性的。相关囊膜蛋白鸡抗的口服也可以作为一种潜在的免疫治疗方法来阻止病毒在宿主的感染。囊膜蛋白的口服注射免疫实验证明,在螯虾体内存在着类似于哺乳动物的免疫系统,外源刺激物可以引起相应的免疫反应,以增强对病原体的抵御。 由于到目前为止,还没有稳定的传代细胞能有效的接种和繁殖细胞,使得对虾白斑病毒基因组得研究进展缓慢,使得对病毒感染得分子机制不太明了,对病毒感染对虾也没有有效得防治方法。本文借鉴杆状病毒得研究方法,在昆虫细胞内对WSSV的凋亡抑制基因进行了鉴定,并对其进行了原核与真核的表达。利用
杨莹珠[3]2009年在《趋化因子配体18基因与卵巢肿瘤的关系研究》文中认为卵巢恶性肿瘤以其发病隐匿、症状不明显、进展迅速、早期发现率低以及生物学特性错综复杂,加之术后易复发,5年生存率徘徊在25%至30%,而成为目前女性生殖器恶性肿瘤中威胁最大的疾病。目前CA125在临床上得到广泛应用,但临床实践表明单一指标对于早期卵巢癌的诊断特异性、敏感性仅能达到25～30%,各种新的肿瘤标志物仍然无法替代CA125的诊断效果。而各种影像学检查和外科手术存在费用高、创伤大等缺点,对于早期卵巢恶性肿瘤妇女诊断率低。故寻找一种更加可信的肿瘤标志物,以提高临床早期诊断率,改善患者预后已成为急需。趋化因子配体18是一种炎性趋化性小分子分泌蛋白,但新近的研究表明,CCL18可以起着局部抗肿瘤免疫调节因子的作用,从而影响肿瘤的浸润、转移等生物学行为及患者的预后。本研究是在课题组先期使用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)结合IMAC-Cu和WCX-2蛋白质芯片分析卵巢恶性肿瘤患者与卵巢良性病变患者和健康人血清差异蛋白表达谱,筛选出31个潜在血清标志物蛋白,其中被鉴定为CCL18的标志蛋白对卵巢恶性肿瘤临床判断具有重要意义的基础上,进一步探讨趋化因子配体18在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其在卵巢恶性肿瘤的发生发展中的作用。本研究通过分子生物学技术及体外细胞实验对CCL18与人卵巢癌的发生发展的关系进行了研究,取得以下学术进展:1、通过用实时荧光定量PCR的方法检测31例卵巢恶性肿瘤组织、14例良性卵巢肿瘤组织及14例正常卵巢组织中CCL18的表达量,发现CCL18在卵巢恶性肿瘤组织中的阳性表达率和表达量明显高于良性和正常卵巢组织(p＜0.05);分析CCL18的表达量与卵巢恶性肿瘤的临床病理及预后联系,结果均无明显相关。2、通过基因工程技术,构建PET SUMO-CCL18原核表达质粒,并表达、纯化获得趋化因子配体18的重组成熟肽段。进一步将此肽段作为标准品,使用LCM联合免疫磁珠及MALDI-TOF检测不同卵巢上皮细胞中CCL18蛋白表达情况,发现卵巢恶性肿瘤上皮细胞确实表达CCL18蛋白,且表达阳性率高(9/10),良性卵巢上皮细胞中CCL18表达率50%,正常卵巢上皮细胞无明显CCL18蛋白表达。3、检测各种体外培养的卵巢上皮癌细胞株发现有CCL18基因的表达。构建CCL18真核表达载体,并通过体外实验了解CCL18过表达对卵巢癌细胞浸润转移过程中的作用。流式细胞仪检测显示SKOV_3-CCL18组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为32.8%,较对照组明显增加(p＜0.05);CCL18组和对照组的生长曲线无明显区别;SKOV_3细胞在转染前后的侵袭能力、粘附能力及迁移能力均有明显增加(p＜0.05)。4、构建CCL18的RNAi真核载体,转染卵巢上皮癌细胞株SKOV_3后测定细胞功能,细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间无明显变化;干扰组细胞周期中处于增殖状态(S+G2+M)的细胞明显减少;侵袭、迁移、粘附实验均发现干扰组细胞有明显降低,差异有统计学意义(p＜0.05)。总之,本研究在体外培养的卵巢上皮癌细胞及冰冻切片的卵巢上皮癌细胞中均发现有CCL18表达,且其在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于卵巢良性肿瘤及正常卵巢,体外细胞学实验表明CCL18对卵巢上皮癌细胞的浸润转移也有明显相关。表明CCL18有潜力成为卵巢上皮癌的早期诊断标志物和分子靶点。
张玲云[4]2013年在《miR-125b在皮肤鳞状细胞癌中的作用及其机制研究》文中提出皮肤鳞状细胞癌(简称皮肤鳞癌)是我国常见的皮肤恶性肿瘤之一,容易发生转移和复发,是导致非黑色素瘤皮肤癌患者死亡的主要病因。因此,寻找其发病过程中发挥关键作用的分子对鳞癌的诊断和治疗是必不可少的。微小RNA (microRNA或miRNA)是一类内源性的单链非编码小RNA分子,在转录后水平调控基因的表达。miRNA的异常表达与肿瘤的发生以及发展密不可分。本课题主要研究miR-125b对皮肤鳞癌细胞的作用及其机制,并对影响miR-125b表达的因素进行初步探讨。本研究分为四部分进行：1.首先运用低密度芯片检测皮肤鳞癌组织中差异性表达的miRNAs,运用实时定量PCR检测miR-125b在皮肤鳞癌、光化性角化病和健康人皮肤组织以及不同分化程度的皮肤鳞癌组织中的表达。最后运用原位杂交检测皮肤鳞癌组织中miR-125b的表达水平。2.运用脂质体介导方法将人工合成的miRNA前体转染皮肤鳞癌UT-SCC-7和A431细胞系,升高细胞内miR-125b的表达水平,观察细胞生长增殖、侵袭和迁移以及细胞凋亡的变化情况。3.运用芯片和生物信息学方法预测miR-125b的潜在靶基因,并运用荧光素酶报告基因系统、实时定量PCR和western印迹实验对靶基因进行验证。同时运用实时定量PCR检测皮肤鳞癌组织中靶基因的表达,并分析靶基因与miR-125b表达水平的相关性。运用RNA干扰技术敲降细胞内靶基因的表达,观察细胞生长增殖、侵袭和迁移以及细胞凋亡的变化情况。最后研究miR-125b下游调控可能涉及的分子机制,运用实时定量PCR检测miR-125b对下游基因的影响,阐述miR-125b在皮肤鳞癌细胞中可能参与的调控网络。4.通过生物信息学方法对miR-125b的启动子及其上游区域进行分析,利用药物5-aza对鳞癌细胞进行处理,运用实时定量PCR检测药物处理后细胞内miR-125b的表达,探讨miR-125b的表观遗传学改变。此外,利用KGF(角质细胞生长因子)刺激细胞,检测miR-125b的表达是否受影响。通过对本课题的研究,可以得到以下几个结论：1. miR-125b在皮肤鳞癌组织中低表达,但是miR-125b可能与肿瘤的分化程度无关。2.细胞内miR-125b的表达升高后,造成细胞克隆形成能力降低、细胞周期G1/S进程阻滞、细胞增殖减慢以及侵袭和迁移能力均降低,而细胞凋亡增加。3.MMP-13和MAP2K7是miR-125b的直接靶基因,miR-125b抑制MMP-13和MAP2K7的表达；同时MMP-13和MAP2K7与miR-125b的表达呈负相关。除此之外,TGFBR2、TP53INP1、MMP-7、cyclinD1和c-Jun等基因也受miR-125b的调控。敲降细胞内MMP-13的表达后,细胞克隆形成、侵袭和迁移能力降低,但细胞的增殖和凋亡不受影响。敲降MAP2K7的表达后,细胞的增殖和克隆形成能力降低,细胞凋亡增加。通过对下游基因的分析,推测miR-125b可能参与TGF-β、NF-kappaB. JNK和Wnt信号通路的调控。4. miR-125b的启动子区域呈现密集的CpG岛,并且利用5-aza对鳞癌细胞进行去甲基化处理后miR-125b的表达水平升高,说明受到甲基化的调控。同时KGF刺激细胞后miR-125b的表达受抑制。
蔡丽敏[5]2008年在《肿瘤抑制基因ING4对黑素瘤细胞株M14生物学行为影响的体外实验研究》文中提出黑素瘤是恶性程度很高的皮肤肿瘤,预后不良,其发生机制目前仍不十分清楚。肿瘤抑制基因在黑素瘤的发生、发展中具有重要的作用。ING4基因是一种新的肿瘤抑制基因,其功能还不完全清楚。目前国内外尚未见有关其与黑素瘤的研究报道。本研究旨在探讨ING4在黑素瘤发病机制中的作用及机制。(1)ING4在黑素瘤组织中的表达经免疫组化法检测发现,ING4在皮肤黑素瘤组织中的表达明显下调,与良性色素痣组织对比,差异有显着性。(2)ING4重组表达质粒的构建及细胞转染通过RT-PCR法从人的正常组织获得目的基因片断,体外构建真核表达载体pCDNA3.1-ING4,经PCR及基因测序证实重组质粒构建正确。将其转导入人黑素瘤细胞株M14,经免疫细胞化学及蛋白印迹法证实转染的外源ING4基因可高效表达ING4蛋白。(3)ING4对M14细胞生长的影响经MTT、流式细胞术及TUNEL法检测发现,转染外源性ING4基因后,M14细胞的增殖明显受抑,凋亡增加,并伴有G2/M期阻滞。此外蛋白印迹法还发现,M14细胞呈现细胞周期调控蛋白表达的变化及凋亡通路的活化。(4)ING4对M14细胞侵袭能力的影响经重组基底膜侵袭实验、MTT法、Transwell小室法及明胶酶谱法观察发现,ING4能够抑制M14细胞的体外粘附和侵袭穿过基底膜的能力,但并不影响其运动能力。ING4能够抑制M14细胞分泌MMP2和MMP9,从而降低其降解细胞外基质及基底膜的能力。结论ING4可能参与了黑素瘤的发生、发展,并可能为黑素瘤发生机制之一。ING4在体外能够有效地抑制M14细胞的生长及侵袭,并可影响其细胞周期的进程及明显增加其凋亡。ING4对M14细胞增殖的抑制作用及凋亡的促进作用,可能是通过对其细胞周期以及凋亡信号通路活化的调控而实现的。
宋长年[6]2011年在《枳和柑橘microRNA及其靶基因的识别、鉴定与表达分析》文中研究表明植物microRNA (miRNA)是广泛分布于植物基因组中的长度在19-25个核苷酸的内源性非编码调控RNA,是真核生物基因表达的一类调控因子,主要通过指导靶基因的切割或降低靶基因的翻译从转录后水平上调控植物基因表达,在控制植物的发育、开花时序、新陈代谢、应激反应等方面起着重要的作用。目前,分离和鉴定miRNA的方法主要包括实验方法(遗传筛选、直接克隆、高通量测序、northern杂交、荧光定量PCR)和生物信息学方法。柑橘是世界性的重要水果。枳(Poncirus trifoliata)是绝大多数柑橘品种的一种优良砧木。它是柑橘学研究的重要对象,有关枳分子生物学的研究备受重视。在重要经济植物上开展miRNA及其靶基因的研究,为从表观遗传学方面解释更多的重要生命现象,达到有效调控与利用重要功能基因的目的具有重要意义。本论文以枳和柑橘中的'Nules'、‘宫本’、‘纽荷尔’为试验材料,通过生物信息学预测了柑橘中的niRNA及其靶基因,并用Northern杂交、miR-RACE、RLM-5'-RACE、qRT-PCR、高通量测序以及PPM-RACE和RLM-RACE系统全面的研究了枳、宽皮橘和甜橙中的miRNA及其靶基因的表达。主要研究结果如下：1.用生物信息学预测miRNA的方法,从NCBI数据库中柑橘的EST中挖掘miRNAs。通过采取一系列的筛选条件,从四种柑橘的430,000EST序列中找到了38个潜在的miRNAs:枳(Poncirus trifoliata)中9个miRNAs(命名为ptr-miRNAs);克莱门柑(C.clementine)中5个miRNAs (ccl-miRNAs);宽皮橘(C. reticulata)中9个(crt-miRNAs);甜橙(C. sinensis)中15个(csi-miRNAs)。其中8个用Northern杂交表明在枳的根、茎和叶中都有表达,但是表达量不同。用潜在的miRNA序列,进一步对NCBI中mRNA数据库的BLAST搜索,在柑橘的数据库中发现10个靶基因。用RNA连接酶介导的5’RACE研究了miRNA对其靶基因的调控作用,结果表明枳中这些(?)miRNAs对其靶基因是通过mRNA剪切来行使功能的。2.报告一个有效的方法来确定生物信息学预测的miRNA精确序列。这个方法主要包括小RNA文库的构建,miRNA的5'RACE、3'RACE和RACE产物的克隆测序。该方法创新的核心步骤是miRNA的5'RACE和3'RACE特异引物的设计。进一步利用RLM-5'RACE来验证miRNA对其靶基因的剪切和荧光定量RT-PCR来研究精确序列的表达。结果表明利用这种有效的新的方法验证了枳中生物信息学预测的9个miRNAs的精确序列。用和枳中相同的引物miR-RACE可以验证葡萄和苹果生物信息学预测的精确的序列。这种方法可以克服生物信息学法预测miRNA的的主要缺点不能确定miRNA在前体上的精确序列,可能是miRNA研究非常有用的工具。3.用Solexa深度测序技术发现在枳中新的microRNA。从枳花芽、花以及不同发育时期的果实构建的小RNA文库中,总的13,106,753序列代表4,876,395独立的序列被克隆测序。基于miRNA相似性序列和二级结构预测,从克隆测序的156,639序列中发现63个miRNA属于42个高度保守的miRNA家族,与已知miRNA的完全匹配。我们还从枳中发现10个新的miRNAs,其前体从柑橘的560,271条EST中被确定,而且其中的5个miRNA其miRNA*也被克隆和测序。此外,定量RT-PCR研究了这10个新的候选的miRNA表达在枳不同发育时期不同组织基因的表达。对大多数保守的和新的miRNA潜在的靶基因进行了预测,其中4个靶基因,包括一个编码铜离子结合/还原酶的IRX12基因和另外3个编码NB-LRR类抗病蛋白的基因在转录水平上受miNRAs调控。对枳花和果小RNA测序发现10个新的miRNA和42高度保守的miRNA家族,这表明特异的miRNA在枳中存在。4.为了研究枳在生长发育时期miRNA及其靶基因的表达特性,利用生物信息学方法和RACE技术从枳的不同发育时期根、茎、叶、花、果等不同器官构建的cDNA文库中克隆了9个miRNA的10个靶基因的全长,采用荧光定量RT-PCR以及PPM-RACE和RLM-RACE方法分析13个miRNA及其靶基因和miRNAs剪切靶基因产物(5’端和3’端)在枳叶(直径大小分别是0.2,0.5和1 cm)、幼茎、老茎、根、花芽、花和果(直径大小分别是0.5,1.5,和2cm)等15种不同器官中的表达水平。结果表明枳miRNA和其靶基因在枳不同发育时期的不同器官中存在着相互消长的关系,在枳的组织发育和成熟过程中miRNA含量逐渐降低,而它的靶基因的含量逐渐上升。5.利用miR-RACE鉴定了生物信息学预测的9个宽皮橘和15个甜橙miRNA精确序列。采用荧光定量RT-PCR方法分析了这些miRNAs及其靶基因分别在宽皮橘和甜橙的幼茎、成熟茎、老茎、幼叶、成熟叶、老叶、花芽、花蕾、花和果(花后15天,花后45天,花后75天,花后105天,花后145天)等14种不同器官中的表达水平。用一种新的miRNA介导的靶基因检测剪切片段的方法PPM-RACE和RLM-RACE验证了miRNA潜在的靶基因。PPM-RACE和RLM-RACE不但可以验证靶基因的剪切位点,而且能够检测剪切片段的表达模式从而知道miRNA与靶基因的作用方式。实验结果表明miRNA在发育转变、花的发育以及果实的成熟等多以切割靶基因模式来调控靶基因的表达,从而拓展了小RNA介导地调控机制。6.用已知27个拟南芥miRNAs与柑橘的EST数据库进行比对来寻找柑橘miRNA的前体,其中13个柑橘的miRNA前体序列可以形成类似与拟南芥的二级结构。Northern杂交结果表明26个miRNAs在柑橘的叶片、幼梢、花、果实和根中都是普遍表达的,其中一些miRNA在不同的组织中其表达量不同。基于miRNA与靶序列完全或近乎完全的互补特性,在总共从15个柑橘miRNA中找到41个潜在的靶基因。其中的四个靶基因在枳中mRNA水平上已被实验证实在被miRNA剪切。
田玥[7]2008年在《腺病毒介导的hING4基因联合持续低剂量率γ射线照射治疗胰腺癌的体外实验研究》文中进行了进一步梳理胰腺癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全世界范围内呈上升趋势,被称为“癌中之王”。胰腺癌是多基因、多步骤、多阶段演变的产物,因此针对单一环节的治疗临床上常不能达到满意的治疗效果。近年来有研究者提出将基因治疗与其他传统抗癌策略(如放射治疗、化疗、免疫治疗等)相结合,希望获得增强或协同的抗癌作用。基因治疗与放射治疗的联合是其中比较有前景的一种方案。ING4作为一个新发现的抑癌基因,它不但能抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,还能抑制肿瘤组织中新血管的生成。鉴于ING4较好的抗肿瘤功能,因此我们通过腺病毒介导,将hING4基因转入人胰腺癌细胞株panc-1,联合持续低剂量率γ射线照射进行体外的抗肿瘤及其分子机制的实验研究,为其临床应用提供实验和理论基础。第一部分重组Ad-hING4转染Panc-1人胰腺癌细胞的体外实验研究目的探讨重组Ad-hING4对人胰腺癌panc-1细胞生长的影响,研究其体外抗肿瘤的效果。方法(1)重组Ad-hING4及Ad-GFP的扩增并进行效价检测及鉴定;(2)用Ad-hING4和Ad-GFP感染人胰腺癌细胞panc-1,在倒置显微镜和荧光显微镜下观察荧光表达情况及细胞生长抑制作用;(3)间接免疫荧光法检测Ad-hING4在人胰腺癌细胞panc-1中的表达;(4)MTT法检测Ad-hING4和Ad-GFP对细胞生长的抑制;(5)流式细胞仪检测Ad-hING4诱导凋亡的作用。结果(1)重组Ad-hING4及Ad-GFP的扩增、效价检测及鉴定重组病毒子经多轮感染、扩增后,Ad-GFP、Ad-hING4经荧光计数法检测其病毒效价滴度均达到10~(10)pfu/ml。RT-PCR法鉴定重组病毒子,结果表明腺病毒介导的Ad-hING4基因能在Panc-1细胞中成功转录。(2)用Ad-hING4和Ad-GFP感染人胰腺癌细胞panc-1,在倒置显微镜和荧光显微镜下观察荧光表达情况及抑制细胞生长的作用在荧光显微镜下观察荧光表达,90%的细胞都表达GFP;Ad-hING4和Ad-GFP均呈现很高的感染效率;在荧光倒置显微镜下观察Ad-hING4处理的Panc-1细胞,出现明显变圆、脱落、皱缩等病变,表明Ad-hING4对Panc-1胰腺癌细胞具有明显的抑制细胞生长的作用。(3)间接免疫荧光法检测Ad-hING4在人胰腺癌细胞panc-1中的表达Ad-hING4处理的Panc-1细胞中有外源性ING4蛋白的表达。(4)MTT法检测Ad-hING4和Ad-GFP对Panc-1细胞生长抑制经Ad-hING4处理的panc-1细胞生长明显抑制,并呈现一定的剂量依赖性与时间依赖性。Ad-ING4在50MOI剂量点时,panc-1细胞出现较明显的细胞抑制效应,作用72h后,panc-1细胞的抑制率为28.7%。(5) FACS检测Ad-hING4对Panc-1细胞生长抑制Ad-hING4处理组可见明显凋亡峰,50MOI Ad-hING4处理72h的Panc-1细胞的凋亡率为24.2%。结论Ad-hING4能在胰腺癌Panc-1细胞中成功表达,并可在体外抑制其生长,诱导其凋亡。第二部分持续低剂量率γ射线照射人胰腺癌Panc-1细胞的体外实验研究目的125I粒子持续低剂量率γ射线体外照射胰腺癌Panc-1细胞,研究粒子照射对肿瘤细胞的杀伤机制及其与剂量的关系,为临床粒子治疗提供依据。方法自制细胞照射装置,采用125I粒子持续低剂量率γ射线照射胰腺癌细胞panc-1:(1)照射后用倒置显微镜观察细胞的形态学变化;(2)克隆形成率检测细胞增殖的改变;(3)流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;(4) DAPI染色实验检测细胞凋亡的改变。结果(1)照射后用倒置显微镜观察细胞的形态学变化在荧光倒置显微镜下观察,经1Gy剂量照射Panc-1细胞,90%的细胞仍贴壁,细胞外形未见异常改变;而2、4、6、8、10Gy处理的Panc-1细胞出现明显变圆、脱落、皱缩等病变,并且随着剂量的增加发生CPE改变的细胞越多。(2)克隆形成率检测细胞增殖的改变不同照射剂量(1、2、4、6、8、10Gy)对Panc-1细胞克隆形成率的影响。未照射组集落形成率在本实验中为32.2%。给予panc-1细胞1、2、4、6、8、10Gy剂量后,细胞的克隆抑制率随剂量增大迅速上升。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡的改变正常对照组与2Gy剂量照射处理组Panc-1细胞的凋亡率分别为1.3%、22.5%,各组坏死细胞比例均较少(<1%)。(4) DAPI染色实验检测细胞凋亡的改变125I粒子照射后panc-1胰腺癌细胞的细胞核断裂形成大小不等的核碎片,形成有膜包绕的含核碎片的凋亡小体。结论持续125I粒子γ射线照射均可显著抑制胰腺癌细胞panc-1的生长,诱导细胞的凋亡,具有一定的细胞毒作用。胰腺癌细胞panc-1的抑制率随γ射线照射剂量的增加,呈上升趋势。第叁部分腺病毒介导的hING4基因联合持续低剂量率γ射线放射治疗胰腺癌的体外实验研究目的本研究使用重组Ad-hING4基因感染人胰腺癌细胞panc-1,并联合125I粒子持续低剂量率γ射线照射,研究其体外治疗胰腺癌的效果,并探讨其分子调控机理,为临床开展基因联合放射治疗提供实验依据。方法选用2Gy剂量与Ad-hING4基因治疗相联合,实验分5组,①正常对照组;②Ad阴性对照组;③Ad-hING4处理组;④单纯125I粒子处理组;⑤Ad-hING4及125I粒子联合处理组。观察并检测:(1)在倒置显微镜及荧光倒置显微镜下观察胰腺癌细胞panc-1的形态学改变;(2)克隆形成实验检测细胞增殖的改变;(3)流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;(4)RT-PCR法检测凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA的表达;(5)Western-blotting检测凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达;(6)蛋白芯片法检测各组上清中肿瘤标志物CA199、CA242及CA153的表达。结果(1)在倒置显微镜及荧光倒置显微镜下观察胰腺癌细胞panc-1的形态学改变经Ad-hING4感染处理的Panc-1细胞,90%的细胞都表达GFP,呈现很高的感染效率;并且Ad-hING4处理组、125I粒子处理组及联合处理组的Panc-1细胞均出现明显变圆、脱落、皱缩等病变(CPE),而正常对照组和Ad-GFP组未出现变圆、脱落、皱缩等病变。(2)克隆形成实验检测细胞增殖的改变各个实验组的克隆形成率分别为(32.93±0.61)%、(32.13±0.41)%、(21.87±0.81)%、(12.93±0.12)%、(7.73±0.76)%。联合处理组与正常对照组和Ad-GFP组相比,均有非常明显的差异(P<0.001)。Ad-hING4处理组和125I粒子处理组的克隆形成抑制率分别为(33.56±3.67)%和(60.83±0.88)% ,而联合处理组的抑制率高达(76.51±2.37)%,后者明显高于前两者(均P<0.001)。(3)流式细胞仪检测其凋亡的变化Ad-GFP组具有一定程度的抗肿瘤作用,但与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。与正常对照组及Ad-GFP组相比,Ad-hING4处理组、125I粒子处理组及联合处理组均能显着增加Panc-1细胞的凋亡率,分别为(17.80±3.03)%、(23.43±0.86)%、(51.23±5.05)%,而联合处理组比单纯125I粒子处理组凋亡率明显增高,高达(51.23±5.05)%。(4)RT-PCR法检测凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA的表达Ad-hING4处理组和125I粒子处理组均可下调凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA的表达,但联合处理组的下调作用更为明显。(5)Western-blotting检测凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达Western印迹法也检测出联合处理组较其余组可明显上调凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达。(6)蛋白芯片法检测各组上清中肿瘤标志物CA199、CA242及CA153的表达各组上清肿瘤标志物CA199、CA242及CA153,正常对照组与Ad-GFP组相比无明显差异(P>0.05);与正常对照组和Ad-GFP组相比,Ad-hING4处理组、125I粒子处理组及联合处理组上清中的肿瘤标志物CA199、CA242及CA153均降低,各指标联合处理组下降最显着。结论Ad-hING4联合持续γ射线照射可在体外抑制胰腺癌细胞的生长,诱导胰腺癌细胞凋亡。Ad-hING4可能封闭凋亡抑制蛋白survivin,并通过上调细胞凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达来抑制肿瘤的增殖、促进其凋亡,从而起到协同治疗胰腺癌的作用。
谢枫[8]2016年在《肿瘤抑制因子OTUD1的功能鉴定和分子机制研究》文中认为肿瘤转移是癌症病人死亡的主要原因。为了深入研究肿瘤转移的分子机制,我们以裸鼠肿瘤转移产物的信号为读出值,建立了体内转移模型,我们通过筛选去泛素化酶的shRNA文库发现了 OTUD1这一新的肿瘤转移抑制因子。OTUD1基因敲减的肿瘤细胞有间充质细胞的特性。进一步的研究表明,OTUD1直接去除TGF-β信号通路的抑制因子SMAD7的泛素化,并阻止它的降解。OTUD1不仅去除SMAD7的K48连接的多聚泛素链,进而稳定SMAD7,而且去除SMAD7的K220氨基酸残基上发生的K33连接的多聚泛素链,进而暴露SMAD7的PY结构域,便于其和SMURF2结合,促进细胞膜上TGF-βⅠ型受体的内吞降解。因此,OTUD1通过去除SMAD7的泛素化,抑制TGF-β诱导的致癌性反应,从而抑制乳腺癌转移。在心脏异位转移裸鼠模型中,OTUD1的敲除能促进肿瘤的转移。利用临床数据库和病人样品分析,我们研究了 OTUD1对肿瘤转移的临床意义。OTUD1在多种类型的癌症中存在下调或者缺失。在乳腺癌和其他类型的癌症中,低表达或者遗传丢失的OTUD1往往和不良预后相关。在乳腺癌临床病人的样品中,OTUD1蛋白的表达和它的靶蛋白SMAD7的表达成正相关的关系。全基因组Array数据库的分析显示,OTUD1表达高的病人富集了 70种重要的BRCA1的靶基因。与BRCA1和BRCA2 一样,在P53缺失的细胞中,OTUD1的表达被原癌基因RAS所抑制。综上所述,首先我们采用的筛选方法可以应用于其他类型的癌症,为肿瘤相关因子的发现提供借鉴意义。其次,我们的研究揭示了一种新的蛋白调节方式,阐明了一种不常见的可逆修饰是如何来调控特定蛋白质之间的相互作用,并间接地决定TGF-βⅠ型受体在细胞膜上的稳定性。因此,我们的研究不仅鉴定了一个重要的肿瘤抑制因子OTUD1,而且为TGF-β信号通路提供了一个全新的调控机制,即OTUD1通过去除SMAD7的泛素化从而抑制肿瘤转移。
牛国策[9]2012年在《ING1及突变型p53在脑胶质瘤中的表达及意义》文中认为背景与目的脑胶质瘤是神经系统常见的原发性颅内肿瘤,具有术后复发率高,病死率高,预后差等特点,外科手术仍然是主要的治疗手段,术后放疗及化疗己广泛应用于临床,但治疗效果仍然不够理想,脑胶质瘤的治疗仍然是神经外科领域攻克的难题。寻找有效地治疗手段也是神经外科领域的热点课题。随着肿瘤分子生物学的发展,人们渐渐认识到肿瘤的发生与发展与许多因素有关,包括多基因和许多细胞因子参与等,如正常细胞周期调节的失控,肿瘤新生血管的形成,癌基因的激活和抑癌基因的突变与失活等在肿瘤发生、发展的过程中起着至关重要的作用。因此,对于基因方面的研究,可能对胶质瘤的基因治疗提供新的依据。生长抑制因子(inhibitor of growth1, ING1)是在1996年Garkavtsev等利用改良cDNA减数法克隆出来的一个新基因,它能促进细胞周期阻滞、细胞衰老和凋亡、参与应激反应、调节DNA损伤反应,并抑制肿瘤细胞的转移、浸润和肿瘤血管的生成、对DNA修复和基因组稳定性进行调节等,是一个重要的肿瘤生长抑制因子。核磷酸化蛋白p53通过其基因突变或与癌蛋白之间的相互作用从而导致功能的失活,其往往造成细胞生长的异常并促使肿瘤的发生。已有数据表明,p53基因的突变在人类肿瘤的发生中是最常见的基因水平变化。从分子生物水平上的研究,ING1在脑胶质瘤中的作用在国内报道较少,为了了解ING1和突变型p53在人脑胶质瘤中的表达及意义,我们在实验中采用RT-PCR技术检测ING1和突变型p53mRNA在人脑胶质瘤中的表达情况,来探讨两者在人脑胶质瘤的发生与发展中的作用,从而为脑胶质瘤的基因治疗提供依据。一般资料与方法所取42例人脑胶质瘤标本来自郑州大学第二及第一附属医院2010年9月至2011年8月由神经外科医师手术切除的肿瘤组织,其中男24例,女18例,年龄7至75岁,平均年龄43.5±16.4岁,所取42例肿瘤标本均为原发病患者,且术前均没有经过放化疗,标本取出后立刻放入-80℃的冰箱里保存。所有标本均由病理科常规苏木素-伊红(hemotoxylin and eosin,HE)染色确诊。按照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准(见表1.1)：Ⅰ～Ⅱ级(低度恶性胶质瘤)28例,其中星形细胞瘤16例、室管膜下室管膜瘤2例、室管膜瘤3例、少突-星形细胞瘤4例、少突胶质细胞瘤3例；Ⅲ-Ⅳ级(高度恶性胶质瘤)14例,其中间变性星形细胞瘤4例、间变性少突胶质细胞瘤5例、胶质母细胞瘤3例、髓母细胞瘤2例。10例对照组非瘤脑组织均取自脑外伤、脑出血需内减压的病人。采用RT-PCR技术检测ING1mRNA和突变型p53mRNA在42例人脑胶质瘤组织中和10例非瘤脑组织中的表达量,使用SPSS17.0软件包对其数据进行统计学分析,检验水准取a=0.05。结果1.ING1基因mRNA在人脑胶质瘤中的表达ING1基因mRNA在非瘤脑组织、脑胶质瘤组织及其Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ-Ⅳ组mRNA的表达量分别为1.19±0.27、0.64±0.16、0.77±0.29、0.34±0.11。ING1基因mRNA的表达量在非瘤脑组织和胶质瘤之间,Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ级之间均有统计学意义(P<0.05)。2.突变型p53基因mRNA在人脑胶质瘤中的表达突变型p53基因mRNA在非瘤脑组织、脑胶质瘤组织及其Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ组mRNA的表达量分别为0.29±0.16、0.75±0.34、0.45±±0.14、0.95±±0.21。突变型p53基因mRNA的表达量在非瘤脑组织和胶质瘤之间,Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ-Ⅳ级之间均有统计学意义(P<0.05)。3.ING1和突变型p53表达的相关性分析ING1基因mRNA的表达量在非瘤脑组织中较高,而突变型p53基因mRNA的表达量在相同的标本中表达较低,ING1基因mRNA在表达量较高的低级别胶质瘤标本中,突变型p53的表达量趋于减少,而在ING1基因mRNA在表达量较低的高级别胶质瘤标本中,突变型p53的表达量趋于增加,二者呈现负相关,Pearson相关性系数r=-0.417,(P<0.05)。结论1.ING1在脑胶质瘤组织中的表达相对于非瘤脑组织明显减弱,并且胶质瘤的病理学分级越高,其表达量越低。突变型p53在脑胶质瘤组织中的表达相对于非瘤脑组织明显增强,并且胶质瘤的病理学分级越高,其表达量越高。2.ING1和突变型p53在胶质瘤中的表达呈负相关,ING1表达量的降低和突变型p53表达的增强不是各自孤立的事件,有望为胶质瘤的诊断与治疗提供新的思路。
纪宗玲[10]2001年在《人era基因的表达分布及其功能的相关研究》文中指出era基因是1986年测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseⅢ的rnc基因下游发现的一个开放读框，其编码的蛋白具有鸟苷酸结合活性，氨基酸序列与人和酵母的Ras有明显相似性，故命名为E.coli Ras-like（era）基因。后来的研究表明，era的同源序列存在于所有探讨过的细菌中，era编码的Era蛋白并不属于Ras家族，其独特的C端使其成为一个新的G蛋白亚家族。 Era蛋白由两个结构域组成，N端是一个典型的鸟苷酸结合蛋白结构域，与其它G蛋白有较高的同源性；C端为Era家族所特有，与其它蛋白家族无任何同源性，其中含有一个RNA结合功能结构域—KH结构域。大肠杆菌era是属于rnc操纵元的一个细菌生存必需的基因，并参与细胞周期的调控，Era可以特异地与16S-rRNA结合。陈苏民教授在美国NIH工作期间，以大肠杆菌Era的C端序列为靶序列，通过计算机搜索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌Era同源的EST序列，以此为线索，成功地克隆了人和小鼠全长的era-cDNA。在此基础上，本文对人Era的组织表达谱及其功能进行了相关研究。 在本研究工作中，首先对人era的表达分布规律进行探索。1、人era-mRNA的组织分布规律：以人era编码区基因为探针，用CLONTECH公司的MTN和MTE ＄四旱医大学俗士攀位论文 第7 页杂交膜进行杂交，发现人。。－mRNA的大小为2．ZKb，分布于所有检测的组织和细胞系中，但表达水平有很大差异。表达最高的组织为心尖部、肝脏、胎肺和甲状腺。2、人。。。的蛋白表达分布规律：用课题组制备并经过亲和纯化的兔抗人Era多克隆抗体对几种胎儿组织进行免疫组织化学染色，结果人Era蛋白分布于绝大多数所检测的组织，由强到弱依次为胰脏、肺、心脏、脾脏、胃、小肠、肝脏和肾脏。 经免疫电镜检测大肠杆菌Era定位于胞浆膜的内侧面，其C端对细胞内定位有着重要意义。为分析人ERA在细胞内的定位，构建了人Era与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体pSMEGFP－hEra和PEGFP－CI－hEra，即目的蛋白分别位于荧光标签蛋白（EGFP）的N端和C端。瞬时转染NIH3T3细胞，带荧光的融合蛋白主要位于靠近核膜的胞浆部分；进一步用纯化的兔抗人Era多克隆抗体对类风湿关节炎滑膜细胞系RA，骨肉瘤细胞系MG63、胃癌细胞系7901等几种培养细胞进行问接免疫荧光检测，发现均有强弱不等的荧光，且主要分布于胞浆中。表明人Era具有不同于大肠杆茵Era的细胞内定位，其细胞内分布以胞浆为主，可能具有与细菌Era不同的信号转导途径。 为研究人Era对细胞形态、细胞周期的影响，进行以下工作：1、对人Era的氨基酸序列进行了计算机分析，在此基础上构建了人Era的定点突变体，其突变的位置分别针对N端结构域的GTP结合位点和C端结构域的KH基序；2、带HA标签的野生型和突变型人Era的真核表达载体，转染Nll－I3T3细胞，筛选到稳定表达的细胞株。3、对稳定表达人Era细胞株的细胞形态和细胞周期进行分析，发现野生型人Era对细胞生长有促进作用，而KH基序突变后对细胞生长起抑制作用。流式细胞仪分析表明，转染野生型Era的细胞株表现为GZ期和S期细胞增多，可能为DNA合成旺盛的结果；转染Era S36N细胞株各时相细胞所占百分数变化不明显；转染 Era 31 ON的细胞株 S期细胞和 GZ期细胞增多异常显着，结合细胞形态和生长曲线，可能存在细胞周期阻滞；即在细胞DNA复制后期不能向M期转化。 进一步使用完全可调控诱导表达系统表达突变型人Era，以深入研究该蛋白的功能。在构建稳定高表达蜕皮激素受体基因的细胞株3V3的基础上，转染突变型人Era的表达载体进行压力筛选，对所得到的单克隆细胞株进行诱导与未诱 DopGI’－’’’ent ofBtochthe andMolecularmp FMMU2001 窜回旱医大学博士学位论文 章 吕 页导条件下细胞周期的分析，结果表明未诱导加酒精的对照细胞可以引起细胞凋亡，而Era诱导表达后可以显着抑制凋亡细胞的数量，Western表明Era S36N可以诱导细胞仇 1－2表达，提示人 Era可能与细胞凋亡相关。 为进一步研究人Era的作用机理，对其结合蛋白的功能区进行鉴定，将人。。a基因克隆入融合表达载体 PRSETB中，转化大肠杆菌 BL21DE3（pLysS），经IPTG诱导，表达6His－hEra融合蛋白。光密度扫描结果表明其占菌体总蛋白50％以上，表达产物分子量约为42KD，以包涵体形式存在。在SM i存在条件下，包涵体溶解，利用6Hk与过渡态金属离子N广高亲合力结合的性质，用N广一叮A亲和树脂一步法纯化，即获得纯度达96％以上的6His－hEra融合蛋白。将纯化的蛋白进行包被，从噬菌体表面呈现随机十＝肽库中经过叁轮淘筛（Biopanning），并用ELISA检测，筛选到具有人Era结合活性的阳性重组噬菌体克隆，测序后发现大多（7／9）具有 HxHSxxH的氨基酸序列，初步认为是人 Era的结合基序，为进一步Era结合蛋白基因的克隆及其功能研究提供了依据。
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