一、心血管发育中的分子调控及其相关疾病（论文文献综述）
潘杰,刘来浩,牟建伟[1]（2021）在《肠道菌群与人类健康研究进展》文中研究表明在漫长的生物共演化过程中,肠道菌群之间及其与人类宿主之间形成了辅车相将、相互影响、交能易作的共生关系.肠道菌群生态失调与人体神经、消化、代谢、免疫等众多系统的发育及功能异常、疾病的发生发展以及对药物的反应等关系密切.近年来国内外学者对肠道菌群与人类健康相关性的探索不断深入;然而,依然有许多现象和疑问以及肠道菌群与人体组织细胞之间互作机制尚未明晰.本文将综述近年来国内外学者针对肠道菌群与人类健康相关性的研究成果和新的认知,试图从"大生命科学"的角度探讨调控肠道菌群微生态的策略及可行性,展望相关科研及其成果转化的发展趋势,希望能对从事相关基础和应用研究的人士以及关注自身健康的大众百姓,提供有价值的参考资料.
柯昌浩[2]（2021）在《DC源lncRNA在急性冠脉综合征中的差异性表达及其调控机制》文中研究指明研究背景:急性冠脉综合征（acute coronary syndromes,ACS）作为最常见的致命性疾病之一,其患病率及死亡率高居不下。因此,深入了解ACS的发病机制,降低患者死亡率,提高生存质量已成为不可忽视的全球性社会卫生问题。尽管已有大量研究报道ACS多种复杂的发病机制,但不同类型ACS病理机制的不同导致了临床治疗策略和预后有所差异,对各个亚型ACS发病机制的了解仍处于起步阶段。免疫炎症反应学说与ACS的发生发展及转归有着密切联系,在ACS发病过程中,坏死的心肌细胞激活免疫系统,产生剧烈的炎症反应,已修复坏死的组织区域。然而,不同亚型ACS是否有不同程度的炎症反应,炎症反应的发生发展是否受精准分子的调控,尚无明确定论。而作为功能强大的抗原呈递细胞,树突状细胞（Dendritic cell,DC）在不同类型ACS发病过程中的功能对于先天性及适应性免疫的平衡至关重要。因此,探讨不同亚型ACS中树突状细胞的具体功能作用,揭示其在发挥生物学效应中的具体机制,便是本研究的主要内容。本研究拟通过RNA测序技术,探讨不同类型ACS患者外周血单个核细胞源树突状细胞的（mononuclear cell-derived dendritic cells,moDC）长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（Message RNA,m RNA）差异性表达谱,寻找到与moDC分化发育相关的lncRNA,并对其调控DC功能的具体机制进行深入探讨,以揭示moDC源lncRNA在DC的激活及ACS的发生发展中的相关联系。第一部分不同类型ACS病人moDC的形态及其功能具有差异目的:培养不同类型ACS病人和健康正常人的moDC,并对其形态及功能进行实验研究,以探讨moDC与不同类型ACS之间的关联。方法:（1）通过Ficoll密度梯度离心法分离人外周新鲜血液,获取PBMC。采用免疫磁珠阳性分选法收集CD14+单核细胞,经完全培养基及细胞生长因子GM-CSF、IL-4诱导6天,培养出实验所需的moDC。通过倒置相差电子显微镜观察moDC的形态特征,并利用流式细胞术对DC相关表面分子（CD11c、CD14、CD80、CD86、HLA-DR）进行鉴定。（2）收集UA患者6例（UA组）,NSTEMI患者8例,（NST组）,STEMI患者9例（ST组）,健康志愿者8例（CON组）,计算各组病人获取的PBMC数量及诱导后的moDC数量,获得moDC得率。通过扫描电子显微镜（SEM）观察各组DC形态,并使用流式细胞术检测moDC的表面共刺激分子（CD80、HLA-DR）、鸡卵白蛋白（OVA）,ELISA检测moDC上清IL6、IL10、IL12p70含量,以探讨不同类型ACS病人之间moDC的功能差异。结果:（1）FCM检测发现,PBMC经MACS分选后,CD14+阳性率高达95%。CD14+单个核细胞经细胞因子GM-CSF、IL-4诱导六天后,分化为DC。镜下可见DC为悬浮细胞,细胞伸出少量树突样伪足,并呈葡萄样聚集,为典型DC形态。流式细胞术显示DC特异性表面分子CD11c、HLA-DR呈高表达,CD80、CD86在未受任何抗原刺激下为弱表达。（2）在相同培养体系下,ACS患者所提取的PBMC数量及诱导后的DC得率高于健康志愿者（p<0.05）。通过SEM发现,与CON组相比,UA组、NST组、ST组的DC具有更长、更密集的伪足样突起。相比于CON组、UA组,ST组与NST组CD80、HLA-DR表达水平增高,OVA表达水平减弱（p<0.05）。ST组、NST组moDC上清中的IL6、IL12p70表达水平显着高于CON组与UA组（p<0.05）,而IL10的表达量在四组中并没有显着的差异。结论:（1）利用Ficoll密度梯度离心法结合MACS可有效培育出纯度较高、数量可观的树突状细胞。（2）相同培养体系下,相比于CON组或UA组,AMI患者moDC具有更强的抗原呈递能力、促炎分泌功能及较弱的吞噬能力。第二部分不同类型ACS病人moDC源DElncRNA的筛选及生信分析目的:通过不同类型ACS病人moDC源lncRNA表达谱及生信分析,筛选出差异表达的lncRNA并进行验证,以探讨DElncRNA在不同类型急性冠脉综合征发病机制中的潜在调控机制。方法:（1）收集3例不稳定型心绞痛患者（UA组）、3例非ST段抬高型心肌梗死患者（NST组）、3例ST段抬高型心肌梗死组（ST组）、3例健康志愿者（CON组）外周血单个核细胞诱导的树突状细胞,采用RNA测序技术,建立m RNA、lncRNA差异表达谱并进行GO分析、KEGG分析、共表达网络分析,筛选出候选lncRNA。（2）扩大样本量,采用RT-PCR验证候选的DElncRNA,并与树突状细胞共刺激分子（CD80、CD86、HLA-DR）、白细胞（WBC）及AMI相关诊断指标CKMB、TNT-hs做相关性分析。结果:（1）在各个组两两比较m RNA和lncRNA表达差异情况时,发现CON组与UA组相比,ST组与NST组相比,两者的m RNA与lncRNA表达水平并无显着变化。将STEMI组与NSTEMI组中的样本合并,归纳在一个新的实验组中,取名为急性心肌梗死组（AMI）组,并与CON组进行显着分析研究。结果显示:CON组与AMI组相比,共有833个m RNA（229个上调,604个下调）和70个lncRNA（21个上调,49个下调）异常表达（fold change>2.0、p值<0.05）。（2）对AMI组与CON组中的差异性m RNA进行GO分析及KEGG通路分析。结果显示,大多数富集的信号通路和发挥的生物学效应与树突状细胞的分化、发育、激活密切相关。lncRNA-m RNA共表达网络数据显示,共表达网络由13个lncRNA与34个m RNA之间的47个网络节点和35个网络连接组成。其中,ENST00000418499.3能最多与12个m RNA相连接。（3）根据lncRNA的保守性评分、差异表达倍数择优选取了5个lncRNA（NR＿026793.1、NR＿027922.3、ENST00000446952.1、ENST00000457097.1、ENST00000590780.1）,在14个AMI患者及5个健康志愿者中进行RT-PCR验证。与RNA测序结果一致,NR＿026793.1、NR＿027922.3、ENST00000446952.1、ENST00000590780.1表达上调（p<0.05）,然而ENST00000457097.1表达水平在两组之间无统计学意义。（4）RT-PCR发现AMI患者的moDC的共刺激分子（CD80、CD86、HLA-DR）在RNA水平上表达上调。此外,通过相关性分析,发现ENST00000590780.1（R=0.61,p<0.05）表达水平与CD80呈正相关。ENST00000446952.1（R=0.61,p<0.05）、NR＿027922.3（R=0.56,p<0.05）表达水平与CD86呈正相关。NR＿027922.3（R=0.47,p<0.05）、ENST00000446952.1（R=0.69,p<0.05）表达水平与WBC呈正相关。NR＿027922.3（R=0.60,p<0.05）、ENST00000446952.1（R=0.63,p<0.05）表达水平与CK-MB呈正相关。NR＿027922.3（R=0.66,p<0.05）、ENST00000446952.1（R=0.58,p<0.05）表达水平与TNT-hs呈正相关。结论:（1）AMI患者moDC源m RNA、lncRNA与正常健康者存在差异性表达,而UA患者与健康正常人,ST患者与NST患者之间,差异性表达的m RNA和lncRNA数量较少。（2）AMI患者moDC源DElncRNA与ACS的发病机制具有潜在的联系,这可能与DElncRNA调控树突状细胞的生物学功能相关。第三部分DElncRNA CCL15-CCL14在moDC中的作用及机制研究目的:探讨lncRNA CCL15-CCL14在树突状细胞发挥生物学功能中的调控作用及其具体机制方法:（1）过表达或沉默lncRNA CCL15-CCL14,通过流式细胞术、RT-PCR检测moDC在抗原呈递、细胞因子的分泌等生物学功能变化,Western Blot检测moDC PI3K-AKT蛋白通路磷酸化水平。（2）通过荧光原位杂交技术探索lncRNA CCL15-CCL14在moDC中的亚定位,并结合lncRNA数据库预测其可能的作用靶点。结果:（1）以慢病毒为载体,可成功将lncRNA CCL15-CCL14过表达至moDC中。以脂质体为载体,可成功将CCL15-CCL14 Smart Silencer转染至moDC中,沉默lncRNA CCL15-CCL14。（2）过表达CCL15-CCL14（OE CCL15-CCL14）可促进moDC的激活,增强抗原呈递能力,促进细胞分泌促炎因子。此外,沉默CCL15-CCL14（SS CCL15-CCL14）能抑制moDC的正向免疫调控功能。Western Blot结果显示:lncRNA表达水平的变化会影响moDC中PI3K/AKT的磷酸化水平。（3）荧光原位杂交技术及lncRNA数据库分析结果显示:CCL15-CCL14是跨越CCL14与CCL15两个位点的非编码RNA,其主要定位于细胞核中,对趋化因子CCL14可能具有正向调控作用。结论:lncRNA CCL15-CCL14可调控CCL14的表达水平,引起PI3K/AKT蛋白通路磷酸化水平的改变,从而影响moDC的生物学效应。
张天然[3]（2021）在《抑癌因子LKB1和LGL1在血管钙化中的作用及机制研究》文中提出1.研究背景血管钙化（Vascularcalcification）主要是指心血管组织中钙和磷的沉积,其表现为血管顺应性的下降和僵硬性的增高,容易诱发心衰、急性血栓栓塞、心肌缺血等心脑血管相关疾病。目前普遍认为血管钙化是一种可预防调节的主动性病理过程,而血管平滑肌细胞向成骨细胞的转化是其最重要的中间环节,主要表现为平滑肌特异性基因（如α-SMA和SM22等）的表达下降和成骨性特异性基因（如Runx2、Msx2、ALP等）的表达上调。可参与血管钙化进程的因素有很多,但具体机制仍在探索中,加强其机制研究,对于临床防治血管钙化及其相关疾病具有重要意义。高迁移率族蛋白（HMG,high mobility group）在血管钙化调节中亦处于极其重要的位置,可通过多种信号通路影响血管钙化相关病理过程的发生和发展。HMG最早于1973年在牛胸腺中被提取,由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移能力超高而得名与此。依据分子量的不同和DNA结构的差异,它被分为三个族群:HMGA、HMGB 和 HMGN,而 HMGB 族群又被分为 HMGB1、HMGB2 和 HMGB3,其中HMGB1的含量最为丰富。HMGB1具有高度保守性,首先体现在氨基酸序列上,其含有219个氨基酸残基,不同物种间同源性高达98%以上;另外,在结构上,HMGB1蛋白被分成3个结构域,分别为A盒、B盒和C尾。目前已知,HMGB1主要位于细胞核内,其主要的生物学功能就是结合DNA,作为细胞骨架蛋白参与转录过程的调节,但是一旦出现应激刺激,其可向细胞质转移,发挥其促炎、促肿瘤形成等生物学效应。此外,HMGB1还可参与凝血和血管内皮细胞功能的调控。肝激酶B1（LKB1）是一种抑癌基因,也被称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 1（STK11）,它主要存在于细胞核内,在哺乳动物中广泛表达。LKB1蛋白含有433个氨基酸,由3个结构域组成:激酶区域、N端和C端。目前已知,LKB1是重要的蛋白激酶,可直接磷酸化AMPK使其激活,从而发挥抑癌、调控能量转换等生物学功能。此外,LKB1可以调控血管内皮生长因子的表达和血管新生,LKB1还可调节内皮舒张功能和血压稳定。这提示:LKB1与心血管系统疾病之间存在相关联系。然而,目前尚无文献显示LKB1可以在血管钙化中发挥作用,本课题旨在探讨两者之间的关系。2.研究目的（1）研究LKB1对小鼠平滑肌细胞钙化的影响;（2）阐明小鼠平滑肌特异性敲除LKB1对血管钙化的影响;（3）探讨LKB1调控平滑肌钙化的具体分子机制。3.研究方法（1）动物模型构建:LKB1flox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠杂交可得LKB1flox/flox/Cre十小鼠,6周龄时给予连续5天腹腔注射他莫西芬（每只小鼠每天1mg）处理,可构建出LKB1SMKO小鼠。另外,同窝的LKB1flox/flox/Cre-小鼠接受相同剂量他莫西芬处理后作为对照组（CTR）。上述实验小鼠,在8周龄时给予连续4天皮下注射维生素D（VD3）处理,构建血管钙化模型。为了探究LKB1敲除对小鼠血管钙化的作用,设置以下4组:①CTR+Vehicle;②LKB1SMKO+Vehicle;③CTR+VD3;④LKB1SMKO+VD3。为了验证LKB1对小鼠血管钙化的影响是通过HMGB1而实现的,给小鼠注射HMGB1抑制剂（GA）,并设置以下4组:①CTR+VD3+Vehicle;②LKB1SMKO+VD3+Vehicle;③CTR+VD3+GA;④LKB1SMKO+VD3+GA。（2）细胞模型:培养小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,分别感染LKB1和GFP（对照）的病毒,然后用高磷酸盐溶液（高Pi）处理6天诱导其发生钙化。为了进一步探究LKB1对小鼠血管平滑肌细胞钙化的生物学效用,设置以下4组:①GFP+Vehicle;②LKB1+Vehicle;③GFP+Pi;④LKB1+Pi。此外,提取LKB1SMKO和CTR小鼠原代VSMCs,然后用高Pi处理6天从而诱导其钙化,并分为 4 组:①CTR+Vehicle;②LKB1sMKO+Vehicle;③CTR+Pi;④LKBlSMKO+Pi。（3）探究多种钙化条件刺激下LKB1的表达变化:分别用高Pi、高糖、醛固酮和地塞米松处理VSMCs,检测LKB1蛋白和mRNA表达水平的变化;检测与相应的对照相比,钙化小鼠LKB1蛋白和mRNA表达水平的变化以及血管钙化病人的主动脉中LKB1表达水平的变化;另外,用尿毒症病人血清刺激VSMCs后检测LKB1的表达变化。（4）探索LKB1对高Pi诱导的血管平滑肌细胞钙化的效用:培养VSMCs,分别感染LKB1和GFP（对照）病毒,给予高Pi刺激6天,检测平滑肌细胞中Runx2的蛋白表达、钙沉积、钙含量、碱性磷酸酶活性以及Runx2、ALP、Msx2、Wnt3a、Wnt7a的mRNA表达水平的变化。另外,提取6-8周龄LKB1SMKO和CTR小鼠原代VSMCs,给予高Pi刺激,检测上述钙化相关指标。（5）研究LKB1对维生素D诱导的小鼠血管钙化的作用:给予8周龄的各实验组小鼠连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Vonkossa染色评价小鼠主动脉弓的钙化面积;Western blot评价Runx2的蛋白表达水平的变化;组织钙含量、血清钙含量和血清ALP活性的检测评价血管钙化程度。（6）探讨LKB1HMGB1的调控作用:在VSMCs中敲除或过表达LKB1,利用western blot、RT-PCR、ELISA和免疫组化技术检测HMGB1的表达变化;进行免疫共沉淀实验明确LKB1是否能与HMGB1直接结合;另外,利用蛋白降解途径实验去验证LKB1通过何种途径影响HMGB1的表达。（7）验证HMGB1在LKB1调控血管钙化中的作用:在感染LKB1或GFP病毒的VSMCs中过表达HMGB1,并给予高Pi刺激6天,检测前述钙化相关指标。在LKB1SMKO和CTR小鼠中腹腔注射HMGB1抑制剂（GA）,并连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Vonkossa染色评价小鼠主动脉弓的钙化面积;Western blot评价Runx2的蛋白表达水平的变化;组织和血清的钙含量和ALP活性检测用以评价血管钙化程度。4.研究结果（1）在多种钙化条件刺激下,LKB1的表达下调。首先我们分别用高Pi、高糖、醛固酮和地塞米松处理VSMCs,发现LKB1蛋白和mRNA的表达水平明显降低。接着,我们发现与对照小鼠相比,钙化小鼠血管LKB1蛋白和mRNA的表达水平显着下降。同样地,免疫组化显示:与对照相比,血管钙化病人主动脉的LKB1表达水平亦减少。此外,VSMCs经尿毒症病人血清刺激后LKB1的表达水平也是降低的。（2）LKB1抑制了高Pi诱导的小鼠血管平滑肌细胞的钙化。在血管平滑肌细胞中分别感染LKB1和GFP病毒,给予高Pi刺激6天,发现与对照组相比,过表达LKB1显着降低了由高Pi诱导的Runx2蛋白表达、钙沉积、钙含量、碱性磷酸酶活性以及Runx2、ALP、Msx2、Wnt3a和Wnt7a的mRNA表达水平的增加。另外,提取LKB1SMKO和对照小鼠原代VSMCs,给予高Pi刺激,发现与对照小鼠相比,LKB1SMKO增强了高Pi诱导的血管钙化。（3）LKB1敲除促进了维生素D对小鼠血管钙化的诱导作用。对8周龄的各实验组小鼠,连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Von kossa染色发现:LKB1SMKO小鼠主动脉弓的钙化面积明显大于对照小鼠;Western blot显示:LKB1SMKO小鼠的Runx2蛋白水平高于对照小鼠。另外,LKB1SMKO小鼠的组织钙含量、血清钙含量和血清ALP活性亦明显高于对照小鼠。（4）LKB1直接结合HMGB1,并通过溶酶体途径促进了它的降解。利用western blot、RT-PCR、ELISA和免疫组化技术,我们发现:过表达LKB1降低了 HMGB1的蛋白水平和分泌水平,而敲除LKB1则明显提高了 HMGB1的水平。免疫共沉淀实验显示LKB1能与HMGB1直接结合;另外,蛋白降解途径实验证实LKB1是通过溶酶体途径促进HMGB1的降解的。（5）LKB1通过HMGB1发挥其抑制血管平滑肌钙化的作用。在感染了LKB1和GFP（对照）病毒的VSMCs中过表达HMGB1,并给予高Pi刺激6天,结果发现,过表达HMGB1可以明显缓解LKB1对Runx2的蛋白表达、钙沉积、钙含量、碱性磷酸酶活性以及Runx2、ALP、Msx2、Wnt3a、Wnt7a等mRNA表达水平的抑制作用。在LKB1SMKO和对照小鼠中注射HMGB1的抑制剂,接着连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Von kossa染色显示:注射HMGB1抑制剂后,可以显着减少LKB1SMKO和对照小鼠主动脉弓增加的钙化面积;Western blot显示:注射HMGB1的抑制剂后,LKB1SMKO和对照小鼠增加的Runx2的蛋白表达水平被有效下调;此外,组织和血清的钙含量和ALP活性亦明显减少。5.结论（1）LKB1可以抑制高磷诱导的血管平滑肌钙化;（2）LKB1可以与HMGB1直接结合,并通过溶酶体途径促进其降解,导致其表达水平下降,从而发挥抑制血管钙化的作用。
龙向淑[4]（2021）在《HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、冠状动脉腔内成形术/支架植入术后再狭窄及脑卒中等动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）发病率和病死率在多数发展中国家仍呈逐年升高的趋势,是中国乃至全球范围内非感染性疾病死亡的首要原因。动脉粥样硬化（AS）是ASCVD的主要病理基础。在多种导致AS的不良因素作用下,位于中膜层的血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移至内膜及内膜下层并异常增殖,而内膜层的血管内皮细胞（VECs）凋亡增多,是AS发生发展的主要细胞病理学基础。然而,血管壁细胞异质性生物学行为异常及其介导AS发生的分子机制尚未完全明了。同源框（HOX）是一类进化上高度保守并影响脊索动物形态发生的同源域转录因子。HOX基因家族包含39个同源基因。近期研究表明,HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXB1及HOXB9等多个HOX基因在猪主动脉壁的表达受剪切应力影响,但这些基因对血管生物学功能和AS的影响未知。同源框C6（HOXC6）属HOX基因家族C簇成员。研究显示,HOXC6在多器官系统恶性肿瘤组织中表达增高并影响肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡等生物学行为。此外,HOXC6可调节血管壁多能干细胞分化为VSMCs、以及皮肤成纤维细胞分化为血管壁间充质细胞。但是,HOXC6对VSMCs和VECs的增殖、迁移及凋亡等生物学行为是否有影响迄今未见文献报道。研究目的了解Hoxc6等39个Hox基因在AS大鼠主动脉壁和正常主动脉壁的差异表达,然后进一步探讨HOXC6对VSMCs增殖及迁移和VECs凋亡的影响及其部分机制,为明确HOXC6能否成为ASCVD分子治疗新靶点奠定理论基础。研究方法采用苏木素和伊红（H&E）染色法对大鼠主动脉染色验证AS大鼠建模是否成功。应用免疫组织化学法检测Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉的原位表达。采用免疫荧光染色法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在VSMCs和CD31在VECs中的表达。采用反转录实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测39个Hox基因、p53、增殖细胞核抗原（PCNA）、磷脂酶C beta（PLCβ）和血小板活化因子受体（PTAFR）mRNAs表达。用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测大鼠主动脉或心脏组织中和大鼠VSMCs（RVSMCs）中Hoxc6、p53及PCNA蛋白表达,检测VECs中HOXC6、BCL-2、BAX、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、PTAFR、PLCβ及IL-18蛋白表达,以及检测VECs中蛋白激酶C zeta（PKCζ）、NF-κBp65磷酸化和PKCζ膜转位水平变化。应用Cell counting kit-8（CCK-8）和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Ed U）实验检测VSMCs增殖。用细胞划痕法和Transwell实验检测VSMCs迁移。用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）和流式细胞技术检测VECs凋亡。采用生物信息学分析方法挖掘并分析GEO数据库中冠心病相关基因表达及其可能参与的信号通路。应用双荧光素酶报告基因实验检测HOXC6与PTAFR启动子DNA序列结合。采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）结合qPCR（Ch IP-qPCR）验证HOXC6与PTAFR启动子DNA结合的特定靶序列。结果1.在AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因H&E染色结果显示,AS大鼠主动脉内膜/中膜比值较正常主动脉明显增加（P<0.01）。采用qRT-PCR对39个Hox基因mRNA检测结果显示,AS大鼠主动脉壁较正常大鼠主动脉壁表达上调或下调（表达增加或减少倍数的均数绝对值≥2）的Hox基因为17个,其中Hoxa1、Hoxa3、Hoxa9、Hoxb7、Hoxc5、Hoxc6、Hoxc8、Hoxc9及Hoxc10共9个基因表达上调（均P<0.01）,而Hoxa2、Hoxa4、Hoxa5、Hoxa6、Hoxb2、Hoxb3、Hoxb4及Hoxb6共8个基因下调（均P<0.01）。在上调的9个Hox基因中,其中Hoxc6表达升高了10余倍,较之升高倍数更大的Hoxc9或Hoxc10,Hoxc6在大鼠主动脉壁的基础表达丰度最高,而且重复性最好,因此首选Hoxc6作进一步验证。2.Hoxc6和增殖、凋亡相关分子在AS大鼠主动脉壁异常表达qRT-PCR和Western blot结果显示,Hoxc6 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达明显升高（P<0.01）,伴随p53 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达显着减少,而PCNA表达显着增多（均P<0.01）。免疫组化染色结果显示,在AS大鼠主动脉壁的粥样斑块病变和迁移至内膜的VSMCs中,Hoxc6蛋白的表达较正常主动脉显着增多（P<0.01）,伴随抑凋亡分子Bcl-2蛋白在AS大鼠主动脉壁增厚的内膜组织和粥样斑块病变中的表达较正常主动脉明显减少,而促凋亡蛋白Bax表达显着增多（均P<0.01）。3.敲低Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖与迁移免疫荧光染色实验结果显示,氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的RVSMCs用α-SMA抗体染色后,阳性细胞/细胞总数的比率较正常RVSMCs下降（P<0.05）。Ed U、CCK-8、细胞划痕及Transwell实验结果显示,ox-LDL作用于细胞后,RVSMCs增殖明显增多,细胞迁移能力显着增强（均P<0.01）,伴随p53蛋白表达减少,PCNA表达增多（均P<0.01）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RVSMCs中Hoxc6表达后,RVSMCs增殖显着减少,细胞迁移能力明显减弱（均P<0.01）,伴p53蛋白表达显着增多,而PCNA表达明显减少（均P<0.01）。此外,先后敲低RVSMCs中Hoxc6和p53表达后,RVSMCs的增殖和迁移能力较单独敲低Hoxc6组增强（均P<0.05）,但比正常对照组减弱（均P<0.05）。4.下调HOXC6表达抑制VECs凋亡TUNEL、流式细胞技术、qRT-PCR及Western blot结果显示,ox-LDL作用于大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）或人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后,细胞凋亡率较正常对照组均显着升高（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显着减少（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达增多（均P<0.05）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RAECs或HUVECs中HOXC6表达后,细胞凋亡率较正常对照组或单独ox-LDL处理组下降（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显着增多（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达减少（均P<0.05）。此外,在HUVECs中过表达HOXC6之后,HUVECs凋亡率和凋亡相关蛋白变化的趋势与抑制HOXC6表达时相反（均P<0.05）。5.HOXC6靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径影响HUVECs凋亡GEO数据库中冠心病有关的三个数据集gse20681、gse40231和gse46560取交集结果显示,血小板活化因子受体（PTAFR）等68个基因存在交集。KEGG pathway分析显示,PTAFR可通过PLC/PKC途径影响细胞凋亡,进一步在JASPAR数据库预测结果显示,HOXC6与PTAFR启动子存在特异结合位点。鉴于HOXC6影响RAECs和HUVECs凋亡的一致性,选择HUVECs为靶细胞,探讨HOXC6影响VECs凋亡的机制。qRT-PCR、Western blot结果显示,ox-LDL处理HUVECs或促进HOXC6表达后,PTAFR表达增多（均P<0.05）,伴随下游信号分子PLCβ表达增多（均P<0.05）,PKCζ磷酸化和膜转位水平升高（均P<0.05）,NF-κBp65磷酸化和IL-18表达水平升高（均P<0.05）。然而,在ox-LDL处理或正常培养的HUVECs中敲低HOXC6表达之后,上述观察指标的变化趋势与促进HOXC6表达时相反（均P<0.05）。此外,分别用PTAFR激动剂血小板活化因子和PKCζ激动剂溶血磷脂酰胆碱作用于HUVECs,均可逆转下调HOXC6表达所致的抑制HUVECs凋亡及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路活性的效应（均P<0.05）。而且,双荧光素酶报告基因实验结果显示,HUVECs中过表达HOXC6之后,HOXC6与PTAFR启动子结合的活性显着增高（P<0.01）。Ch IP-qPCR实验结果显示,HOXC6可与PTAFR启动子特定位点AGAGGAATAGATTAAA和（或）GAAGCAATCAACCAAG序列结合（P<0.01）。结论1.39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁与正常大鼠主动脉壁之间差异表达,其中Hoxc6表达显着升高,伴随p53和Bcl-2与Hoxc6呈负向性、而PCNA和Bax与Hoxc6呈正向性表达异常。2.HOXC6一方面可负调控p53表达而促进VSMCs增殖与迁移,另一方面靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进VECs凋亡。由此提示HOXC6影响VSMCs增殖、迁移和VECs凋亡的异质性。
王芳[5]（2021）在《利用单碱基编辑系统构建早衰症非人灵长类模型》文中研究指明如何做到抵抗衰老,延年益寿是人类发展历史上经久不衰的话题。机体的衰老可分为正常衰老和病理性衰老。在病理性衰老中,属于单碱基突变的罕见遗传病的早衰症（HGPS,Hutchinson-Gilford progeria syndrome）一直受到研究者的重点关注。早衰症的致病原因是位于人类一号染色体上负责编码细胞核核纤层蛋白的LMNA基因的编码区域的第1824位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶。核纤层蛋白在维持细胞结构,有丝分裂,染色体凝集等方面发挥重要作用。LMNA（c.1824C>T）的突变会导致lamin A/C的m RNA发生错误剪切,引起毒性蛋白progerin的积累,最终诱发早衰症。另外,LMNA（c.357-2A>G）的突变会引起LMNA基因2号外显子缺失诱发扩张型心肌病（DCM,Dilated cardiomyopathy）。因为非人灵长动物与人类在遗传背景上具有高度的相似性,所以成功构建出非人灵长类动物疾病模型可以极大地推动人们对于遗传疾病致病机理与基因治疗的研究进程。作为CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统的衍生物,单碱基编辑器由单切Cas9酶（nick Cas9,n Cas9）和脱氨酶组成。目前单碱基编辑器可分为两个大类,诱导胞嘧啶突变为胸腺嘧啶的胞嘧啶单碱基编辑器和诱导腺嘌呤突变为鸟嘌呤的腺嘌呤单碱基编辑器。与传统的利用同源重组引入碱基突变相比,单碱基编辑器具有易操作,效率高的优势。本研究前期通过显微注射的手段分别将胞嘧啶单碱基编辑系统和腺嘌呤单碱基编辑系统注射到食蟹猴胚胎,获得LMNA（c.1824C>T）的HGPS食蟹猴胚胎模型和LMNA（c.357-2A>G）的DCM食蟹猴胚胎模型,成功建立了非人灵长类胚胎靶向基因位点的单碱基编辑方法学。后期,通过移植经过BE4max编辑的食蟹猴胚胎,本研究成功获得了5只存在LMNA（c.1824C>T）突变的新生小猴。通过蛋白检测相关实验,本研究证实HGPS模型猴全身多组织表达早衰progerin蛋白。临床表型观察证实HGPS模型猴在刚出生时和临床早衰患儿一样并无异常,但随着时间推移,早衰症小猴逐渐表现出脱发,骨骼发育异常,生长发育滞后等临床病症。组织病理学分析证实了HGPS模型猴出现皮肤老化,脂肪代谢异常和动脉粥样硬化早期症状。转录组分析数据显示HGPS模型猴的上调差异基因主要集中在免疫应答及细胞因子与细胞因子受体相互作用通路。相较于已有的HGPS动物模型,本研究构建的HGPS模型猴更全面且较高水平地模拟了临床早衰症患儿。综上所述,本论文研究证实了单碱基编辑器在构建非人灵长类动物疾病模型上的可行性和安全性。并且,本研究构建出的HGPS模型猴将为后续早衰症的机制研究和治疗,以及正常衰老的机制研究提供强有力的平台。
段红霞,熊朝亮,景林,徐庆吉,刘晶玉,马欣然,王大吉,向建全,何志恒,冯静,阎锡蕴[6]（2020）在《CD146三十年研究的回顾与展望》文中认为CD146分子发现于1987年,最初被认为是黑色素瘤标志分子,随后30余年的研究,逐渐揭示了该分子在早期发育、免疫应答、代谢等生理过程,以及在肿瘤、炎症、自身免疫病中的重要作用及机制.目前认为, CD146不仅是一个黏附分子,还是新生血管、T细胞活化和多种肿瘤的标志分子,更是一种细胞膜受体,接受细胞外信号并调控细胞内多种重要信号途径.最近,越来越多的临床研究报道,无论是细胞膜表面的CD146,还是血清和其他体液中的可溶性CD146（soluble CD146, sCD146）,都已成为多种疾病诊断和预后评价的重要参考,将成为疾病治疗的新靶点.迄今,全球已有40余株CD146抗体,有些治疗性抗体已进入临床试验阶段.本文全面回顾了CD146的研究历史,分析了当前亟待解决的关键科学问题,展望了其未来临床应用的潜能,以期为全面认识CD146,充分发挥其在疾病诊疗中的价值提供更多借鉴.
周曼丽,冯宇,钱舒乐,罗晓欣,徐思琦,简维雄[7]（2020）在《心肌缺血再灌注损伤潜在治疗靶点-线粒体动力学相关蛋白的研究进展》文中研究说明急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）仍是世界范围内的主要致死原因。目前,AMI的处理主要是通过心肌再灌注恢复心脏供血。随着冠状动脉旁路移植术和经皮冠状动脉介入术（PCI）的广泛应用,心肌再灌注损伤是临床面临的主要问题。线粒体功能障碍是心肌缺血损伤的重要病理基础。因此,线粒体可作为抗心肌损伤的重要靶标。该文将对线粒体动力学蛋白生理功能及其在心肌缺血再灌注损伤中的病理机制、药理干预作简要综述。
卢环宇[8]（2019）在《RNA结合蛋白QKI在冷暴露激活脂肪产热代谢中的分子调控机制及功能研究》文中研究指明研究背景冷暴露与机体健康密切相关,冷暴露易导致冻伤、低体温症的发生;冷暴露也会增加心脑血管的发病风险。近期研究表明,适当的冷环境暴露可以调节免疫平衡,改善机体代谢稳态并有效缓解肥胖、糖尿病的代谢紊乱症状。因此,冷环境因素对于人体健康是一把双刃剑。脂肪组织在机体应对冷暴露中发挥了重要的代谢调节功能。脂肪组织分布遍及全身,主要分为白色脂肪、棕色脂肪和棕色样脂肪。在冷暴露中,白色脂肪一方面利用储存的脂肪垫抵抗热散失,促进脂滴分解,为外周器官提供代谢底物;另一方面促进棕色样脂肪的产生。棕色样脂肪具有和棕色脂肪相类似的作用,发挥解耦联产热代谢功能,参与体温的维持和抵抗低温症的发生。研究证明,冷暴露可以促进脂肪组织产热代谢,缓解机体代谢紊乱症状。因此,阐明冷暴露中机体脂肪组织产热代谢的分子调节机制,一方面可预防冷诱导的相关疾病发生,为低体温症的防治提供干预靶点,另一方面也可以为代谢类疾病提供安全有效的治疗靶标。目前关于脂肪产热代谢的研究主要集中在信号通路和转录相关分子的功能作用方面,而这些复杂的分子信号网络是如何相互协调影响,尚未完全阐明。我们前期研究发现,在冷暴露脂肪产热活化过程中,产热相关分子在转录后水平受到明显的调控。基于这一现象,我们通过多个高通量数据比较分析,筛选到RNA结合蛋白Quaking（QKI）。本课题中,我们构建转基因小鼠模型,利用RNA-IP seq、表达谱芯片以及多聚核糖体分析技术,探讨QKI分子转录后调控产热代谢分子PGC1α、UCP1表达的机制及其在机体能量代谢调节、低体温症及肥胖相关代谢疾病中的作用。研究目的1.证明脂肪组织中QKI表达变化与机体代谢水平的关系;2.探明QKI对脂肪组织细胞产热代谢的调控作用;3.揭示QKI调控脂肪组织能量代谢的分子机制;4.阐明QKI对于靶分子RNA多层次调节的转录后调控特征;5.验证QKI作为靶点在防治低体温症、肥胖及其相关疾病中的作用和意义。研究方法1.通过Western blot、免疫组化、报告基因等实验,检测QKI分子在冷暴露条件下脂肪组织中的表达变化,及受调节的信号通路。构建QKI脂肪特异性敲除小鼠,利用小动物代谢笼、冷暴露模型,检测QKI对机体能量代谢的影响;2.通过Western Bolt、RT-PCR、HE染色、透射电镜观察、氧电极检测,明确QKI对脂肪组织代谢水平的调控作用;3.利用表达谱芯片、RNA-IP Sequencing检测分析,揭示QKI调控的分子信号通路和作用关键分子。建立体外脂肪细胞模型,利用慢病毒感染、si RNA转染技术沉默QKI表达,通过Western blot、RT-PCR、免疫荧光染色等分子生物学方法,验证QKI对于下游靶分子的调控作用,及建立QKI介导的分子信号网络;4.通过体外3’UTR荧光素酶报告系统、RNA半衰期、胞浆胞核分离提取、多聚核糖体分离提取检测,明确QKI对于下游靶分子RNA稳定性、转运及翻译效率的影响;5.构建高脂饮食诱导肥胖的小鼠模型,利用QKI脂肪特异性敲除小鼠和AAV病毒介导的QKI干预方法,分析检测体重、胰岛素敏感性、糖耐量等相关数据,探讨QKI分子在肥胖及其相关代谢疾病发生发展中的功能作用。研究结果1.冷暴露促进脂肪组织中QKI分子的表达。Western blot、免疫组化结果显示,在冷暴露过程中,QKI分子在棕色脂肪组织、皮下脂肪组织中的表达量都呈现出逐渐增高的趋势;通过QKI启动子荧光素酶报告系统实验证明QKI受到c AMP信号通路的转录调控;抑制脂肪组织QKI分子表达促进小鼠机体代谢率,有效抵抗冷暴露导致的低体温症。小动物代谢笼系统检测数据表明,QKI脂肪特异性敲除小鼠基础氧耗率增高、产热增高,自主运动活性没有明显差异。实验揭示,QKI脂肪特异性敲除小鼠抗寒能力增强,有效抵抗冷诱导的低体温症发生,提高机体冷适应能力;2.干预QKI表达激活脂肪组织产热代谢。通过对转基因小鼠脂肪组织Western Bolt、RT-PCR、HE染色、透射电镜观察、氧电极检测分析发现,QKI敲除的棕色脂肪组织氧耗代谢率明显增高,线粒体数目增多,脂滴大小、数目显着减少,产热分子表达水平显着增高,并且在QKI敲除的棕色脂肪组织中线粒体呼吸链氧化解耦联功能明显增高。与棕色脂肪代谢功能改变一致,QKI敲除的皮下脂肪组织氧耗代谢率明显增高,线粒体数目增多,脂滴面积明显缩小,产热分子表达水平显着增高。在冷暴露条件,QKI敲除的皮下脂肪组织中产生更多的棕色样脂肪细胞;3.QKI调控产热信号分子。表达谱芯片的KEGG pathway结果显示,QKI参与AMPK、PPAR以及Insulin等代谢信号通路。GSEA分析表明,QKI参与调节PPARα、Phospholipid metabolism、TCA Cycle and Respiratory electron transport以及Fatty acid triacylglycerol and ketone body metabolism相关的功能基因。RNA-IP Sequencing检测分析提示产热代谢关键分子PGC1α可能是QKI的潜在作用靶点;4.QKI转录后负向调节产热信号通路分子。干预QKI在体外脂肪细胞中的表达,通过Western blot,RT-PCR,免疫荧光染色方法证明,抑制QKI分子促进下游靶分子PGC1α、UCP1的表达,并且证实QKI调控的产热信号途径,主要依赖于PGC1α分子。通过用Forskolin、IBMX刺激细胞c AMP信号通路来模拟体内冷介导的脂肪产热代谢通路,该实验结果表明冷刺激条件下,抑制脂肪组织/细胞QKI分子可以迅速有效激活产热分子的表达,明确QKI在冷暴露条件下发挥的产热“制动”调节作用。通过体外3’UTR荧光素酶报告系统实验,阐明QKI通过结合PGC1α、UCP1 3’UTR上的QRE作用元件,并抑制其荧光素酶的表达活性;RNA半衰期、胞浆胞核分离提取、多聚核糖体分离提取检测结果显示,抑制QKI表达可以显着提升PGC1αRNA稳定性,促进PGC1α、UCP1 RNA的胞浆转运并提高其翻译效率;5.干涉脂肪组织QKI分子表达有效阻止高脂饮食诱导的小鼠肥胖及相关代谢疾病。利用高脂诱导的小鼠肥胖模型,阐明QKI脂肪特异性敲除小鼠可以显着抑制高脂诱导的肥胖,并且该QKI转基因敲除小鼠血液中游离脂肪酸含量、外周脂肪组织及肝脏组织中脂滴堆积水平显着减少。胰岛素敏感性、糖耐量检测实验证明,QKI脂肪特异性敲除小鼠明显提升胰岛素敏感性和糖耐量水平;通过AAV病毒介导的QKI干预方法证明,干预脂肪组织QKI表达可以有效改善高脂摄食诱导的肥胖和葡萄糖耐受水平,提示QKI可以成为一个潜在的肥胖病治疗靶点。研究结论1.QKI参与机体代谢调节,介导棕色脂肪、皮下脂肪产热代谢功能,可能是有效预防冷暴露诱导低体温症的干预靶点;2.QKI负向调控产热代谢信号通路,在冷暴露激活的产热途径中发挥“制动”作用;3.QKI靶向作用于产热分子PGC1α、UCP1 RNA 3’UTR区,负向调节其分子表达水平;4.QKI转录后调控影响PGC1α、UCP1 RNA稳定性、转运及翻译效率;5.QKI介导的脂肪产热代谢功能可以有效地抵抗高脂饮食诱导的肥胖,是防治相关代谢疾病的潜在靶点。
庞湃[9]（2019）在《SP1/miR-92b信号反馈通路通过CCR7分子参与头颈鳞癌侵袭迁移的研究》文中进行了进一步梳理目的:头颈部鳞癌占全身恶性肿瘤的第六位,是头颈部最常见的恶性肿瘤。区域性淋巴结转移的特性是导致头颈鳞癌患者预后不良的主要原因之一。详细的阐明头颈鳞癌细胞侵袭转移分子机制、寻找临床干预因子,对于头颈鳞癌的临床靶向治疗来说具有十分重要的意义。转录因子SP1是具有锌指结构的转录因子,在包括乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌及甲状腺癌等肿瘤中表达升高,并且其表达水平与患者临床分期、肿瘤侵袭情况及患者的预后等临床特征均显着相关。SP1能够通过调控p53,VEGF,PDGF,MDC1,MMP-9等分子参与调节细胞增殖、侵袭、转移、凋亡、血管生成以及DNA损伤修复和细胞应激反应等。Micro RNA是一组小的内源性非编码RNA,长度在21-25个核苷酸之间,他们通过识别特定的m RNA 3’-UTR序列并与之结合,在转录后水平促进其降解或抑制其表达而发挥生物调控作用。MiR-92b是miR-17-92基因簇的一员,在大部分癌症相关的研究中,miR-92b扮演着肿瘤促进因子的作用,比如在在口腔癌中miR-92b能够通过调控NLK的表达促进细胞增殖、抑制凋亡等等。趋化因子受体CCR7是G-蛋白偶联受体家族的一员,通过与其两个配体CCL19及CCL21相互作用起到促进细胞侵袭迁移等生物学行为的作用。我们在对头颈鳞癌淋巴结转移机制研究过程中,证实了CCR7能够通过调控下游PI3K/Akt/m TOR、Cdc42、Rac、p70s6k、MAPK家族、pyk2及STAT3等分子的表达起到对头颈鳞癌细胞侵袭和迁移能力的调节作用。在本研究中我们主要研究了miR-92b在头颈鳞癌中的生物学功能,miR-92b与转录因子SP1的相互调控关系,以及SP1/miR-92b信号轴对CCR7分子的调控作用,以进一步完善头颈鳞癌侵袭及转移的分子机制,为头颈鳞癌的临床靶向治疗提供一定的理论基础依据。研究方法:1.检测miR-92b在头颈鳞癌细胞及组织标本中的表达水平。通过基因芯片检测miR-92b在两对头颈鳞癌细胞系PCI-4A/4B及PCI-37A/37B细胞中的表达水平,并通过Real-time PCR实验进行验证。通过下载及分析TCGA数据库中头颈鳞癌患者基因表达数据表达miR-92b在头颈鳞癌癌旁、癌及转移灶中的表达水平。1.Detecting miR-92b levels in HNSCC cells and specimens We detected miR-92b levels in two pairs of HNSCC cells PCI-4A/4B and PCI-37A/37B by microarray,and verified the results by Real-time PCR.By analyzing HNSCC patients gene expression data in TCGA database,we compared the miR-92b levels in the adjacent normal tissue,primary focus and metastasis.2.MiR-92b表达与头颈鳞癌患者临床分期及预后相关性分析分析TCGA数据库头颈鳞癌患者基因表达数据,比较不同临床分期患者及有无淋巴结转移患者病灶组织中miR-92b的表达水平。通过ROC曲线将患者分为miR-92b高表达及低表达组,通过Kaplan-Meier曲线分析两组患者生存时间差异,采用Log-rank检验。应用Mann-Whitney检验分析miR-92b表达水平与头颈鳞癌患者临床特征相关性,采用单因素及多因素Cox比例风险回归模型分析头颈鳞癌患者死亡相关风险因素。2.Analysing the relationship between miR-92b expression and clinical stage and prognosis of HNSCC patients By analyzing TCGA data,we compared miR-92b levels in HNSCC patients with different clinical stages and lymph node metastasis status.By using ROC curve we divided HNSCC patients into high miR-92b expression group and low expression group.Kaplan-Meier curve was used to compare survival days of the patients and was tested by Log-rank test.By using Mann-Whitney test we analyzed the correlation between miR-92b levels and clinical features of HNSCC patients.Univariate and multivariate Cox-proportional hazards model were used to analyzed the death-related risk factors of HNSCC patients.3.MiR-92b对头颈鳞癌细胞侵袭迁移及增值能力的影响通过细胞转染技术向头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B转染RNA Oligo:miR-92b mimics,inhibitor以及negative control调节细胞中miR-92b的表达水平。通过transwell迁移实验及划痕愈合实验检测各转染组细胞迁移能力,通过transwell侵袭实验检测各转染组细胞侵袭能力,通过CCK8细胞增殖实验检测各转染组细胞增殖能力。3.Evaluating the effect of miR-92b expression on migration,invasion and proliferation of HNSCC cells By using cell transfection technique we transfected RNA Oligo-miR-92b mimics, inhibitor and negative control into PCI-37A/37B to regulate its expression.Transwell migration assay and wound healing assay were used to compare migratory abilites of each transfection group.Transwell invasion assay was used to detect cell invasive ability.CCK8 cell proliferation assay was used to detect cell proliferation.4.MiR-92b对SP1表达调控作用分析通过分析TCGA数据库头颈鳞癌患者表达数据分析SP1表达与miR-92b表达水平相关性。通过细胞转染技术上调/下调头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B中miR-92b表达水平,通过Real-time PCR检测各转染组细胞中SP1 m RNA表达水平,通过Western blot技术检测各转染组中SP1蛋白表达水平。4.Evaluating SP1 regulation from miR-92b By analyzing TCGA data we analyzing the relationship between SP1 and miR-92b expression levels.MiR-92b levels in PCI-37A/37B cells was regulated by using cell transfection.SP1 m RNA levels were used by Real-time PCR,and SP1 protein levels were detected by Western blot.5.SP1对CCR7表达的调控作用通过分析TCGA数据库头颈鳞癌患者表达数据分析CCR7表达与SP1表达水平相关性。通过细胞转染技术向头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B中转染SP1 siRNA。通过Real-time PCR检测各转染组细胞中SP1及CCR7 m RNA表达水平,通过Western blot检测各转染组中SP1及CCR7的蛋白表达水平。5.Evaluating CCR7 regulation from SP1By analyzing TCGA data we analyzing the relationship between CCR7 and SP1expression levels.SP1 siRNA was transfected into PCI-37A/37B cells to down-regulating its levels.Real-time PCR was used to detect SP1 and CCR7 m RNA levels.Western blot was used to detect SP1 and CCR7 protein levels.6.MiR-92b对CCR7表达调控作用分析通过细胞转染技术上调/下调头颈鳞癌PCI-37A/37B细胞中miR-92b的表达水平,通过Real-time PCR检测各转染组细胞中CCR7 m RNA表达水平,通过Western blot检测各转染组细胞中CCR7的蛋白表达水平。通过双荧光素酶报告基因验证miR-92b与CCR7 m RNA 3’-UTR序列的结合作用。通过细胞共转染技术同时向头颈鳞癌细胞PCI-37A/37B中转染SP1 siRNA及质粒载体miR-92b inhibitor以及相应阴性对照。通过Real-time PCR检测各转染组细胞中miR-92b,SP1及CCR7 m RNA表达水平,通过Western blot技术检测各转染组细胞中CCR7蛋白表达水平。6.E7.SP1/miR-92b/CCR7信号通路作用关系体内实验验证通过向头颈鳞癌细胞感染慢病毒载体构建稳定低表达SP1头颈鳞癌细胞株,分为SP1敲低组、SP1对照组及空白对照组细胞,皮下接种于BALB/c-nu裸鼠进行成瘤实验,观察各组裸鼠瘤组织生长速度及最终成瘤大小。接种后25天处死各组裸鼠获取成瘤组织比较大小,通过Real-time PCR实验检测各组瘤组织中miR-92b的表达量,将瘤组织制作石蜡切片,通过免疫组化检测各组成瘤组织中SP1及CCR7蛋白表达水平。结果:1.MiR-92b在头颈鳞癌细胞系中的表达前期芯片结果显示miR-92b在具有较高侵袭迁移能力的PCI-4B及PCI-37B细胞中表达水平较高。Real-time PCR检测结果验证了这一表达差异。对TCGA数据库数据分析显示miR-92b在头颈鳞癌原发灶中表达高于癌旁组织,在转移灶中表达水平又高于原发灶中表达水平。2.MiR-92b与头颈鳞癌患者的临床分期及预后相关性通过对TCGA数据库数据分析发现,miR-92b在临床分期III期及IV期的患者中表达水平高于I期及II期患者,在有淋巴结转移的头颈鳞癌患者中的表达水平高于无淋巴结转移的患者。高表达miR-92b组的头颈鳞癌患者生存时间较短。同时miR-92b的表达水平与患者N分期具有相关性,N分期及miR-92b高表达是头颈鳞癌患者的死亡相关风险因素。3.MiR-92b对头颈鳞癌细胞迁移、侵袭及增殖能力影响向头颈鳞癌细胞中转染了miR-92b mimics及inhibitor后,细胞中miR-92b的表达出现相应的上调及下调。Transwell迁移实验及划痕愈合实验结果表明miR-92b表达升高后,头颈鳞癌细胞迁移能力显着提高,miR-92b表达降低后,细胞迁移能力下降。Transwell侵袭实验结果表明miR-92b表达升高后,细胞侵袭能力显着增高,而敲低miR-92b后细胞侵袭能力明显下降。CCK-8实验结果表明,上调miR-92b表达后细胞增殖能力提升,而下调miR-92b表达后细胞增殖能力下降。4.MiR-92b对SP1表达调控作用分析TCGA数据库数据,SP1在头颈鳞癌标本中表达随miR-92b表达升高而升高。在头颈鳞癌细胞中上调miR-92b后,SP1 m RNA及蛋白的表达升高,而下调细胞中miR-92b表达后,SP1 m RNA及蛋白表达水平均下降。5.SP1对CCR7的表达调控作用分析分析TCGA数据库数据,在头颈鳞癌患者标本中CCR7的表达随SP1表达水平升高而升高。在头颈鳞癌细胞中转染SP1 siRNA降低其表达后,CCR7 m RNA及蛋白表达水平均下降。6.MiR-92b对CCR7表达调控作用分析在头颈鳞癌细胞中上调miR-92b表达后,CCR7 m RNA表达水平下降,下调miR-92b表达后,CCR7 m RNA表达水平上升。荧光素酶实验证实miR-92b能够与CCR7 m RNA 3’-UTR序列结合进而下调其表达,而这一调控作用在蛋白水平明显减弱。同时下调头颈鳞癌细胞中SP1和miR-92b的表达,与单独降低SP1表达相比CCR7 m RNA及蛋白的表达水平有所回升。7.SP1/miR-92b/CCR7信号通路作用关系体内实验验证构建SP1敲低慢病毒载体,感染头颈鳞癌细胞PCI-37B。分别使用空白对照组细胞、SP1对照组细胞以及SP1敲低组细胞进行裸鼠体内成瘤实验。结果与对照组相比SP1敲低组肿瘤生长速度明显减慢,成瘤体积减小。在SP1敲低组成瘤组织中,miR-92b表达水平降低,CCR7蛋白表达水平亦下降。结论:MiR-92b能够促进头颈鳞癌细胞迁移、侵袭以及增殖过程,并且与头颈鳞癌患者的临床特征、临床分期及预后有关。转录因子SP1及miR-92b在头颈鳞癌细胞中形成互相促进的正反馈调节环路。SP1/miR-92b反馈环路总体对CCR7的表达起到促进作用,其中SP1起到主要的上调作用,而miR-92b对CCR7具有微弱的下调作用。
张在恒[10]（2018）在《MicroRNA-206调控激素性股骨头缺血性坏死进程的分子机制研究及Dixdc1b基因骨骼发育调控功能的初步探讨》文中提出激素性股骨头缺血性坏死（Steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH）是指因脱氢皮质醇等激素类药物长期过量使用而导致股骨头组织供血不足的坏死现象,是一个困扰激素类药物临床使用的医学难题。肿瘤抑制因子PDCD4（progranmmed cell death 4）在肿瘤细胞和心血管细胞等凋亡发生过程中具有重要调控作用,且PDCD4基因表达受到多个microRNA分子的调控。已有研究发现PDCD4参与破骨细胞生成调控,但该基因在激素性股骨头缺血性坏死过程中的作用及该疾病发生过程中可能调节PDCD4表达的microRNA分子还未见报道。以往研究发现,miR-206调控成骨分化过程,且miR-206表达水平在激素诱导的股骨头缺血性坏死动物模型中显着升高,但其在人激素性股骨头缺血性坏死发生过程中的病理作用与分子机制尚不清楚。为了探讨miR-206与PDCD4基因在激素性股骨头缺血性坏死中的潜在病理功能与相互作用,我们对miR-206与PDCD4表达及其相互调控在成骨细胞凋亡与激素性股骨头缺血性坏死发生过程的功能与机制进行了系统研究。通过临床组织标本分析,我们发现miR-206表达水平在激素性股骨头缺血性坏死患者骨组织中显着升高,但PDCD4基因表达则在患者骨组织中显着下降。为了探讨PDCD4基因表达抑制的分子机制,我们通过双荧光素酶报告基因分析发现在293T细胞中miR-206可以直接结合PDCD4基因启动子并抑制其表达。此外,我们发现miR-206 mimics转染成骨细胞可以促进该类细胞凋亡发生,抑制其细胞活性和增殖能力,且调控成骨细胞内ALP（alkaline phosphatase）,凋亡调控蛋白Bax（Bcl-2 associated X）与 Bcl-2（B-cell lymphoma 2）基因的表达水平,而 miR-206 inhibitor转染成骨细胞则获得了完全相关的研究结果。最后,我们研究证实PDCD4 siRNA与miR-206 inhibitor共同转染成骨细胞的凋亡水平明显高于miR-206 inhibitor转染组成骨细胞,且成骨细胞中下游ALP,Bax和Bcl-2蛋白水平也发生了相应改变,表明PDCD4及其相关信号途径参与调控了 miR-206促进成骨细胞凋亡的生理过程。综上所述,我们通过对临床组织标本和成骨细胞的相关研究,证明了miR-206通过对PDCD4基因表达和下游信号途径的抑制作用促进成骨细胞凋亡发生,从而参与激素性股骨头坏死病理进程。上述研究揭示了激素性股骨头缺血性发生的新病理机制,并为该疾病早期诊断和新型治疗药物开发提供了重要研究基础。除此之外,我们通过基因沉默技术对斑马鱼dixdc1b基因的发育调控作用进行了初步探讨,发现该基因沉默将导致斑马鱼发生严重胚胎发育和骨骼形成缺陷,初步揭示了dixdc1 基因是骨骼发育的重要调控因子。但microRNA对dixdc1b基因的可能调控作用及dixdc1b基因参与骨骼发育调控的具体作用机制尚需进一步研究。
二、心血管发育中的分子调控及其相关疾病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心血管发育中的分子调控及其相关疾病（论文提纲范文）
（1）肠道菌群与人类健康研究进展（论文提纲范文）
| 1 引 言 |
| 2 何为肠道菌群 |
| 3 肠道菌群的定植及其多样性形成 |
| 4 肠道黏膜结构特点 |
| 5 肠道菌群的分布与门类 |
| 5.1 不同区段肠道菌群的分布 |
| 5.2 肠道菌群的门类 |
| 6 肠道细菌的功能分类和主要作用 |
| 6.1 肠道细菌的功能分类 |
| 6.1.1 益生菌 |
| 6.1.2 中性菌 |
| 6.1.3 致病菌 |
| 6.2 有益菌的作用 |
| 6.2.1 双歧杆菌 |
| 6.2.2 乳酸菌 |
| 6.2.3 艾克曼菌 |
| 6.2.4 丁酸梭菌 |
| 6.2.5 普拉梭菌 |
| 6.2.6 其他有益菌 |
| 6.3 致病菌的种类及作用 |
| 6.4 中性菌及其作用 |
| 7 影响肠道菌群的因素 |
| 7.1 生活环境对肠道菌群定植和建立的影响 |
| 7.2 遗传、年龄和性别对肠道菌群的影响 |
| 7.3 膳食和饮食方式对肠道菌群的影响 |
| 7.3.1 碳水化合物饮食对肠道菌群的影响 |
| 7.3.2 西方饮食对肠道菌群的影响 |
| 7.3.3 高膳食纤维对肠道菌群的影响 |
| 7.3.4 地中海饮食对肠道菌群的影响 |
| 7.3.5 高盐饮食对肠道菌群的影响 |
| 7.3.6 限食对肠道菌群的影响 |
| 7.4 药物对肠道菌群的影响 |
| 7.5 新冠病毒与肠道菌群相关性以及肠-肺轴 |
| 7.6 其他因素对肠道菌群的影响 |
| 8 肠道菌群对人体的影响 |
| 8.1 肠道菌群对肠道免疫的影响 |
| 8.2 肠道菌群对宿主营养吸收的影响 |
| 8.3 肠道菌群与肠-脑轴 |
| 8.4 肠道菌群与人体代谢轴 |
| 8.4.1 肠道菌群与血压 |
| 8.4.2 肠道菌群与肥胖和糖尿病 |
| 8.4.3 肠道菌群与血脂代谢 |
| 8.4.4 肠道菌群与肝脏 |
| 8.5 肠道菌群对肿瘤的影响 |
| 8.6 肠道菌群与骨代谢 |
| 8.7 肠道菌群与干细胞 |
| 9 如何维持健康的肠道菌群多样性 |
| 10 肠道菌群的研究策略、问题与发展趋势 |
（2）DC源lncRNA在急性冠脉综合征中的差异性表达及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 不同类型ACS病人moDC的形态及其功能具有差异 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 不同类型ACS病人moDC源 DElncRNA的筛选及生信分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 DElncRNA CCL15-CCL14在moDC中的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 lncRNA 在树突状细胞中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）抑癌因子LKB1和LGL1在血管钙化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 肝激酶1通过高迁移率族蛋白B1抑制血管平滑肌钙化 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅰ 果蝇幼虫巨大致死基因1通过高迁移率族蛋白B1抑制血管平滑肌的钙化 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的SCI论文 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 同源框C6影响细胞增殖、迁移与凋亡的机制及其在心血管疾病的研究进展 |
| 引言 |
| 1.HOXC6与细胞生长相关分子和(或)信号通路 |
| 2.HOXC6与细胞凋亡相关分子和(或)信号通路 |
| 3.HOXC6与非编码RNA |
| 4.HOXC6影响细胞增殖、迁移及凋亡的其它机制 |
| 5.HOXC6在心血管疾病研究进展 |
| 6.总结及展望 |
| 7.本论文立题依据和研究目的意义 |
| 8.本研究技术路线 |
| 第二章 粥样硬化主动脉异常表达的同源框基因及Hoxc6促进大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 组织、细胞和主要实验试剂 |
| 2.1.3 siRNA和引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 建AS大鼠模型和采集组织标本 |
| 2.2.2 大鼠主动脉组织苏木素和伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色 |
| 2.2.3 大鼠主动脉组织免疫化学染色 |
| 2.2.4 细胞实验分组与细胞培养及鉴定 |
| 2.2.5 siRNA转染细胞 |
| 2.2.6 反转录实时定量聚合酶链式反应(real time quantitative reverse transcription olymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 2.2.7 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.8 Cell counting kit-8(CCK-8)实验 |
| 2.2.9 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)细胞增殖检测方法 |
| 2.2.10 细胞划痕实验 |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 大鼠主动脉组织H&E染色结果 |
| 3.2 AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因 |
| 3.3 Hoxc6 mRNA和蛋白在正常大鼠主动脉和心脏的差异表达 |
| 3.4 Hoxc6、p53及PCNA在 AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.4.1 Hoxc6、p53及PCNA mRNAs在AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.4.2 Hoxc6、p53及PCNA蛋白在AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.5 大鼠血管平滑肌细胞免疫荧光鉴定结果 |
| 3.6 Hoxc6 siRNAs抑制RVSMCs中 Hoxc6表达的效率 |
| 3.7 下调Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖 |
| 3.8 下调Hoxc6表达抑制RVSMCs迁移 |
| 3.9 下调Hoxc6表达对RVSMCs中p53和PCNA蛋白表达的影响 |
| 3.10 p53 siRNA抑制RVSMCs中p53的表达 |
| 3.11 下调p53 表达部分逆转Hoxc6 siRNA抑制RVSMCs增殖的作用 |
| 3.12 下调p53 表达部分逆转Hoxc6 siRNA抑制RVSMCs迁移的作用 |
| 3.13 Hoxc6与p53 siRNAs对 Hoxc6、p53和PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁异常表达 |
| 4.2 Hoxc6在AS大鼠主动脉壁高表达可能与VSMCs增殖活性增高有关 |
| 4.3 Hoxc6可能与ox-LDL协同促进RVSMCs增殖及迁移 |
| 4.4 Hoxc6促进RVSMCs增殖、迁移的效应可能与Hoxc6负调控p53表达有关 |
| 5.小结 |
| 第三章 HOXC6促进血管内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 细胞及主要实验试剂 |
| 2.1.3 siRNA和引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 H&E染色 |
| 2.2.2 免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 细胞实验分组和细胞培养、鉴定及细胞转染 |
| 2.2.6 原位末端转移酶标记技术(Td T-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 H&E染色验证AS大鼠建模成功 |
| 3.2 Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉壁的原位表达 |
| 3.3 大鼠主动脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.4 鼠Hoxc6 siRNAs对 RAECs中 Hoxc6表达的抑制作用 |
| 3.5 下调Hoxc6 表达抑制RAECs凋亡 |
| 3.6 下调RAECs中 Hoxc6表达影响凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.7 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.8 人HOXC6 siRNAs对HUVECs中HOXC6表达的抑制作用 |
| 3.9 下调HOXC6表达抑制HUVECs凋亡 |
| 3.10 下调HOXC6表达影响HUVECs中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.11 过表达HOXC6促进HUVECs凋亡 |
| 3.12 过表达 HOXC6影响HUVECs中凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.讨论 |
| 4.1 Hoxc6在AS大鼠主动脉壁表达升高可能与VECs异常凋亡有关 |
| 4.2 HOXC6可促进体外培养的VECs凋亡 |
| 5.小结 |
| 第四章 HOXC6 经 PLCβ/PKCζ/NFκ-Bp65/IL-18途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 qPCR引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组和细胞培养及细胞转染 |
| 2.2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.3 总蛋白提取和细胞膜蛋白及胞浆蛋白提取 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 下调HOXC6表达抑制PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.1.1 下调HOXC6表达抑制PLCβmRNA表达 |
| 3.1.2 下调HOXC6表达抑制PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.2 过表达HOXC6促进PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.2.1 过表达 HOXC6促进PLCβmRNA表达 |
| 3.2.2 过表达HOXC6激活PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路 |
| 3.3 溶血磷脂酰胆碱逆转下调HOXC6表达而抑制 PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性的效应 |
| 3.4 LPC逆转下调HOXC6表达而抑制HUVECs凋亡的效应 |
| 3.5 LPC逆转下调HOXC6表达所致凋亡相关蛋白的表达变化 |
| 4.讨论 |
| 4.1 VECs异常凋亡是AS发生的始动环节 |
| 4.2 HOXC6经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进HUVECs凋亡 |
| 5.小结 |
| 第五章 HOXC6靶向血小板活化因子受体经PLCβ/PKCζ/NFκ-Bp65/IL-18途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 qPCR引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组和细胞培养及细胞转染 |
| 2.2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.3 总蛋白提取和BCA测蛋白浓度 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 生物信息学分析 |
| 2.2.8 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.9 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 对3个CHD相关数据集进行生物信息学分析的结果 |
| 3.2 敲低HOXC6基因抑制PTAFR表达 |
| 3.3 过表达HOXC6促进PTAFR表达 |
| 3.4 血小板活化因子逆转下调HOXC6表达而抑制HUVECs凋亡的效应 |
| 3.5 PAF逆转敲低HOXC6而抑制PTAFR表达及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性的效应 |
| 3.6 过表达HOXC6促进HOXC6与PTAFR启动子结合 |
| 3.7 ChIP-qPCR验证HOXC6蛋白与PTAFR启动子特定位点序列结合 |
| 3.7.1 10%total Input染色质DNA样品片段化效果的验证 |
| 3.7.2 ChIP-qPCR标准曲线 |
| 3.7.3 ChIP-qPCR扩增产物的特异性及片段大小的验证 |
| 3.7.4 HOXC6 蛋白与PTAFR启动子特定位点结合 |
| 3.7.5 过表达HOXC6促进HOXC6蛋白与PTAFR-promoter扩增位点结合 |
| 4.讨论 |
| 4.1 HOXC6可能靶向PTAFR经 PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路促进VECs凋亡 |
| 4.2 HOXC6与PTAFR启动子特定位点序列结合而促进PTAFR/PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18轴活性 |
| 5.小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 4.研究不足之处 |
| 致谢 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ:发表论文 |
| 附录 Ⅱ:参加科研项目 |
（5）利用单碱基编辑系统构建早衰症非人灵长类模型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.基于CRISPR/Cas系统的靶向基因编辑 |
| 1.1 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发现 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas9系统的作用原理 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9系统的发展 |
| 1.2 CRISPR/Cas13系统 |
| 1.3 单碱基编辑系统 |
| 1.3.1 单碱基编辑系统的发展 |
| 1.3.2 单碱基编辑系统的应用 |
| 1.3.3 单碱基编辑系统的脱靶效应 |
| 2.衰老 |
| 2.1 衰老的概述 |
| 2.2 衰老的研究进展 |
| 3.基于LMNA突变引起的衰老相关疾病 |
| 3.1 衰老相关疾病 |
| 3.1.1 核纤层的概述 |
| 3.1.2 核纤层疾病的概况 |
| 3.2 Hutchinson-Gilford progeria syndrome |
| 3.2.1 HGPS的分子机制 |
| 3.2.2 HGPS的机理研究现状 |
| 3.2.3 HGPS的病理表型 |
| 3.2.4 HGPS的临床治疗 |
| 3.3 扩张性心肌病 |
| 3.3.1 DCM的分子机制 |
| 3.3.2 DCM机理研究现状 |
| 3.3.3 DCM的病理表型 |
| 3.3.4 DCM的临床治疗 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验主要试剂 |
| 1.2 实验主要仪器 |
| 2.主要实验方法 |
| 2.1 实验动物管理 |
| 2.2 细胞水平实验 |
| 2.2.1 gRNA的设计 |
| 2.2.2 gRNA质粒构建 |
| 2.2.3 原代成纤维细胞的建系和培养 |
| 2.2.4 胚胎干细胞的获取 |
| 2.2.5 细胞克隆扩增检测 |
| 2.2.6 SA-β-Gal染色 |
| 2.2.7 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 2.3 胚胎水平实验 |
| 2.3.1 sgRNA的体外转录 |
| 2.3.2 单碱基编辑器的的体外转录 |
| 2.3.3 猴子受精卵的获取 |
| 2.3.4 受精卵的编辑、培养及移植 |
| 2.3.5 BstXI限制性内切酶酶切实验 |
| 2.3.6 胚胎RNA的提取及测序 |
| 2.4 个体水平实验 |
| 2.4.1 基因组的提取及普通测序 |
| 2.4.2 全基因组的测序及生物信息学分析拷贝数变异,重复序列和单核苷酸变异 |
| 2.4.3 差异基因分析 |
| 2.4.4 行为学分析 |
| 2.4.5 血液检测 |
| 2.4.6 蛋白免疫印迹(Western blot,WB) |
| 2.4.7 qPCR |
| 2.4.8 X射线检测 |
| 2.4.9 组织学染色 |
| 第三章 非人灵长类胚胎靶向基因位点的单碱基编辑方法学的建立 |
| T的单碱基突变'>1.Cytidine base editor(CBE)介导DNA上C>T的单碱基突变 |
| T)突变'>1.1 CBE介导HEK293T LMNA(c.1824C>T)突变 |
| T)突变'>1.2 CBE介导的食蟹猴胚胎LMNA(c.1824C>T)突变 |
| T)突变'>1.2.1 CBE可诱导食蟹猴胚胎LMNA(c.1824C>T)突变 |
| T)突变导致胚胎细胞核结构异常'>1.2.2 LMNA(c.1824C>T)突变导致胚胎细胞核结构异常 |
| 1.2.3 BE3可导致胚胎发育异常 |
| G的单碱基突变'>2.Adenine base editor(ABE)介导DNA上A>G的单碱基突变 |
| G)突变'>2.1 ABE可诱导食蟹猴胚胎LMNA(c.357-2A>G)突变 |
| G)突变'>2.1.1 ABE可诱导食蟹猴胚胎LMNA(c.357-2A>G)突变 |
| G)突变可引起LMNA2 外显子的剪切'>2.1.2 LMNA(c.357-2A>G)突变可引起LMNA2 外显子的剪切 |
| 2.1.3 ABE7.10和ABEmax均不会导致胚胎发育异常 |
| C)突变'>2.2 ABE介导的食蟹猴胚胎EGFP(c.199T>C)突变 |
| C)突变'>2.2.1 ABE介导的核移植胚胎EGFP(c.199T>C)突变 |
| 2.2.2 ABE可同时编辑多个位点 |
| 3.脱靶分析 |
| 3.1 BE3可导致大量新生突变 |
| 3.2 ABE很少引起新生突变 |
| 4.讨论与小结 |
| 第四章 单碱基编辑器构建非人灵长类早衰模型 |
| 1.构建早衰猴模型 |
| 1.1 HGPS模型猴的获取 |
| 1.2 HGPS模型猴全身多组织表达早衰蛋白 |
| 1.3 HGPS模型猴脱靶分析 |
| 1.3.1 HGPS模型猴的染色质稳定 |
| 1.3.2 HGPS模型猴SNV与野生猴无差异 |
| 1.4 HGPS模型猴模拟临床早衰症病症 |
| 1.4.1 细胞增殖能力减弱 |
| 1.4.2 HGPS模型猴生长受阻 |
| 1.4.3 HGPS模型猴的行动能力受限 |
| 1.4.4 HGPS模型猴的心血管异常 |
| 1.4.5 HGPS猴心脏功能受损 |
| 1.4.6 HGPS模型猴的皮肤异常 |
| 1.4.7 HGPS模型猴生理指标未见异常 |
| 2.HGPS早衰症机制初探 |
| 3.讨论与小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录B 实验动物伦理审批表 |
（6）CD146三十年研究的回顾与展望（论文提纲范文）
| 1 CD146的发现及命名 |
| 2 CD146的表达调控及翻译后修饰 |
| 2.1 CD146的基因组定位及结构 |
| 2.2 CD146在胚胎发育时期的动态表达 |
| 2.3 CD146在正常组织中的表达 |
| 2.4 CD146在病变组织中的表达 |
| 2.5 CD146的表达调控 |
| 2.6 CD146的翻译后修饰 |
| 3 CD146与信号转导 |
| 3.1 CD146作为细胞膜受体参与信号传导 |
| 3.2 CD146参与调控细胞骨架重排 |
| 3.3 CD146的反馈调节机制 |
| 4 CD146与发育 |
| 4.1 CD146与神经系统发育 |
| 4.2 CD146与循环系统发育 |
| 4.3 CD146与胚胎植入和极性建立 |
| 4.4 CD146的“极性”特征 |
| 4.5 CD146在发育领域的应用前景 |
| 5 CD146与间充质干细胞 |
| 5.1 CD146是MSCs的标志分子 |
| 5.2 CD146推动对间充质干细胞认知的发展 |
| 5.3 CD146与MSCs功能的相关性及其在应用研究中的意义 |
| 6 CD146与肿瘤及肿瘤微环境 |
| 6.1 CD146是肿瘤“恶性”的标志分子 |
| 6.2 CD146调控肿瘤增殖和转移的机制 |
| 6.3 CD146重塑肿瘤微环境 |
| 6.4 CD146成为肿瘤治疗新靶点 |
| 7 CD146与免疫 |
| 7.1 CD146是T细胞活化的标志分子 |
| 7.2 CD146+T细胞的功能 |
| 7.3 CD146与T细胞免疫相关疾病 |
| 7.4 CD146与其他免疫细胞 |
| 8 可溶性CD146 |
| 8.1 sCD146的来源 |
| 8.2 sCD146与疾病诊断 |
| 8.3 sCD146的生理功能 |
| 9 CD146抗体 |
| 9.1 CD146抗体与靶向治疗 |
| 9.2 CD146抗体的临床诊断意义 |
| 9.3 CD146的其他抗体 |
（7）心肌缺血再灌注损伤潜在治疗靶点-线粒体动力学相关蛋白的研究进展（论文提纲范文）
| 1 线粒体动力学蛋白 |
| 1.1 线粒体融合蛋白 |
| 1.2 线粒体分裂蛋白 |
| 2 线粒体动力学在I/R损伤中的分子作用机制 |
| 2.1 线粒体动力学与ROS |
| 2.2 线粒体动力学与Ca2+超载 |
| 2.3 线粒体动力学与mPTP |
| 2.4 线粒体动力学与自噬/凋亡 |
| 2.5 调控线粒体动力学与I/R时的心脏保护 |
| 3 总结 |
（8）RNA结合蛋白QKI在冷暴露激活脂肪产热代谢中的分子调控机制及功能研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 冷暴露对小鼠RNA结合蛋白QKI表达变化的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 实验二 脂肪组织特异性QKI敲除小鼠的建立及代谢表征检测 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 实验三 QKI影响能量代谢的分子信号通路及功能作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 实验四 QKI转录后负向调节产热代谢的关键分子机制 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 实验五 干预QKI表达在肥胖症及相关代谢疾病防治中的作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）SP1/miR-92b信号反馈通路通过CCR7分子参与头颈鳞癌侵袭迁移的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :SP1及miR-92b在头颈鳞癌中表达作用关系及生物学意义 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料、试剂和方法 |
| 2.1 主要实验试剂和耗材 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞转染 |
| 2.3.3 Transwell细胞迁移实验 |
| 2.3.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.3.5 细胞划痕实验 |
| 2.3.6 CCK8细胞增殖实验 |
| 2.3.7 细胞总RNA提取 |
| 2.3.8 实时定量PCR |
| 2.3.9 Western blot检测 |
| 2.3.10 TCGA数据提取及统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 MiR-92b在头颈鳞癌细胞系中的表达 |
| 3.2 MiR-92b与头颈鳞癌患者的临床分期及预后相关性分析 |
| 3.3 MiR-92b对头颈鳞癌细胞迁移、侵袭及增殖能力影响研究 |
| 3.4 MiR-92b对 SP1 表达调控作用分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 :SP1/miR-92b信号反馈通路对CCR7 分子表达调控作用研究 |
| 6.前言 |
| 7.实验材料、试剂和方法 |
| 7.1 主要实验试剂和耗材 |
| 7.2 主要实验仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 细胞培养 |
| 7.3.2 细胞转染 |
| 7.3.3 MiR-92b inhibitor质粒的扩增和提取 |
| 7.3.4 细胞及组织RNA提取 |
| 7.3.5 实时定量PCR |
| 7.3.6 Western blot检测 |
| 7.3.7 双荧光素酶报告基因检测 |
| 7.3.8 慢病毒稳定转染细胞株 |
| 7.3.9 裸鼠成瘤模型建立 |
| 7.3.10 组织学染色 |
| 7.3.11 TCGA数据提取及统计学分析 |
| 8.实验结果 |
| 8.1 SP1对CCR7的表达调控作用分析 |
| 8.2 MiR-92b对 CCR7 表达调控作用分析 |
| 8.3 SP1/miR-92b/CCR7 信号通路作用关系体内实验验证 |
| 9.讨论 |
| 10.结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA-92b及其相关疾病研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）MicroRNA-206调控激素性股骨头缺血性坏死进程的分子机制研究及Dixdc1b基因骨骼发育调控功能的初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 miR-206通过PDCD4促进股骨头缺血性坏死 |
| 1 前言 |
| 1.1 股骨头缺血性坏死简介 |
| 1.2 激素性股骨头坏死病因与临床治疗 |
| 1.3 激素性股骨头坏死的病理机制 |
| 1.4 细胞凋亡介导激素性股骨头坏死 |
| 1.5 细胞凋亡相关信号转导途径 |
| 1.6 MicroRNA调控激素性股骨头坏死过程 |
| 1.7 本论文的选题意义和目标 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 激素性股骨头缺血性坏死患者中miR-206与PDCD4表达分析 |
| 3.2 miR-206直接结合PDCD4基因启动子 |
| 3.3 miR-206调控成骨细胞活性、增殖与凋亡 |
| 3.4 PDCD4介导miR-206对成骨细胞凋亡的促进作用 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Dixdc1b参与骨骼发育调控功能的初步探讨 |
| 1 前言 |
| 1.1 骨骼发育与疾病发生 |
| 1.2 骨骼发育的调控网络 |
| 1.3 Dixdc1b基因研究进展 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 DIXDC1基因序列及其编码蛋白结构高度保守 |
| 3.2 靶向斑马鱼dixdc1b基因的吗啡啉反义寡核苷酸序列设计 |
| 3.3 dixdc1b基因调控斑马鱼机体发育与骨骼形成 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
四、心血管发育中的分子调控及其相关疾病（论文参考文献）
- [1]肠道菌群与人类健康研究进展[J]. 潘杰,刘来浩,牟建伟. 山东师范大学学报(自然科学版), 2021(04)
- [2]DC源lncRNA在急性冠脉综合征中的差异性表达及其调控机制[D]. 柯昌浩. 遵义医科大学, 2021(01)
- [3]抑癌因子LKB1和LGL1在血管钙化中的作用及机制研究[D]. 张天然. 山东大学, 2021(12)
- [4]HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响[D]. 龙向淑. 贵州大学, 2021(01)
- [5]利用单碱基编辑系统构建早衰症非人灵长类模型[D]. 王芳. 昆明理工大学, 2021(02)
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- [7]心肌缺血再灌注损伤潜在治疗靶点-线粒体动力学相关蛋白的研究进展[J]. 周曼丽,冯宇,钱舒乐,罗晓欣,徐思琦,简维雄. 中国中药杂志, 2020(17)
- [8]RNA结合蛋白QKI在冷暴露激活脂肪产热代谢中的分子调控机制及功能研究[D]. 卢环宇. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [9]SP1/miR-92b信号反馈通路通过CCR7分子参与头颈鳞癌侵袭迁移的研究[D]. 庞湃. 中国医科大学, 2019
- [10]MicroRNA-206调控激素性股骨头缺血性坏死进程的分子机制研究及Dixdc1b基因骨骼发育调控功能的初步探讨[D]. 张在恒. 南方医科大学, 2018(01)