陈梅红[1]1999年在《蛋白差示噬菌体表面呈现全套抗体库的初步研究》文中进行了进一步梳理不同的细胞的功能之所以不同，是由于执行其功能的蛋白质有所不同。研究两种处于不同状态的细胞在蛋白质方面的差异将有助于了解差异蛋白及其相应基因的功能，进而解释细胞及生物体的有关生命活动现象，此外，分离与疾病相关的蛋白或基因也将会有巨大的临床及商业价值。因而寻找细胞间的差异蛋白及其基因成为近年来颇令人感兴趣的研究领域。目前有关的差异显示(differential display)技术大部分是在RNA水平研究差异基因的表达，而实际上有些DNA或RNA的改变并不影响到其编码的蛋白质的改变，而且某些蛋白质在被合成后，常常要经过“翻译后修饰”，也会影响到蛋白质的功能。因而仅凭对RNA的研究并不能全面反映细胞功能的差异，有必要在对DNA、RNA研究的同时，在蛋白质水平研究细胞间功能的差异。本研究的目的是利用全套抗体库技术，建立有效的蛋白差示技术(Protein Differential Display)，在细
潘博, 童贻刚[2]2010年在《噬菌体抗体库技术及其应用研究进展》文中提出噬菌体呈现抗体库是近年发展的一项分子生物学新技术,它的建立是抗体技术领域中的一次革命性进展。它以其独特的构建和筛选系统,彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段,并对生物学领域中许多技术的发展起到了巨大的推动作用。该技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体技术。我们简要综述此项技术的研究应用进展。
闫晓敏[3]2010年在《鱼源Fab噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗SAs抗体的可溶性表达》文中指出抗体因其独特的重组类型和基因结构形成巨大的多样性,不仅可以通过结合抗原来有效保护机体,同时也是生物技术、临床诊疗、药物检验检测等许多科学研究中的重要工具。噬菌体抗体库技术因其能够高效快速的制备高亲和力的特异性抗体,被誉为功能抗体研究史上的巨大变革。目前,该技术已在医学、基础理论研究、药物制造生产、残留检测以及病害防治等方面发挥了重要的作用。但是,在发展相对滞后的水产领域,该技术的应用研究还少有报道。基于斑点叉尾鮰抗体基因信息已比较清晰,所以,本试验对本室自建的斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库(赵琳,2009)进行筛选、鉴定并对筛得抗体进行可溶性表达。具体工作如下：1抗体库筛选：以偶联卵血清蛋白的磺胺甲氧嗪(Sulfamethoxypyridazine,SMP)和磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazde,SMZ)为固相包被抗原,将包被板处理后,对自建的斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库进行筛选,经过5轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选过程,获得特异性较强的Fab抗体,并对抗体进行鉴定。主要结果如下：1)从Fab噬菌体抗体库中经过5轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选,分别得到抗SMP阳性克隆株9个,抗SMZ阳性克隆株10个。经ELISA检测,结果证明所筛得抗体具有一定特异性。2)分别经SacI+Xba、SpeI+XhoI双酶切鉴定后,证实所得到的片段大小与预想目的片段大小一致。2 Fab段的可溶性表达：挑选噬菌体抗体阳性克隆感染大肠杆菌XL1-Blue,扩增提取质粒DNA,经双酶切构建Fab可溶性表达载体p3MHSA,转化大肠杆菌XL1-Blue,经IPTG诱导,收集培养液及菌体裂解液上清。进行ELISA、SDS-PAGE和Western blot检测。结果如下：1)ELISA结果显示在菌体裂解液上清及培养液中均可检测到可溶性抗体Fab段的表达,与理论上是一致的。且该抗体分别与偶联蛋白的磺胺甲氧嗪和磺胺甲恶唑可特异性结合。2)SDS-PAGE及Western-blot结果证明,抗SMZ克隆分别有4个克隆、抗SMP克隆有3个克隆在48KD处出现明显条带,与理论计算值相符,说明表达成功。3)通过对表达较好的阳性克隆的可变区进行GenBank检索DNA序列分析,证实该克隆轻链可变区、重链可变区氨基酸序列与GenBank中斑点叉尾鮰免疫球蛋白轻链、重链同源性均在80%-90%。通常同一基因家族的同源性在85%以内,因此可以断定我们所获得的轻链和重链基因均来自斑点叉尾鮰且VH属于斑点叉尾鮰免疫球蛋白VH3基因家族,轻链V区属于斑点叉尾鮰免疫球蛋白VK1基因家族。本研究从自建的斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库中成功筛选得到抗两种磺胺类药物的抗体,并证实了此抗体的有效性,希望噬菌体抗体库及相关技术可以成为一种有效的制备鱼源单抗的方法,在水产动物的基础研究及实际应用上发挥作用。
罗义辉[4]2011年在《杀螟硫磷重组单链抗体研究》文中研究指明基因工程抗体(genetically engeering antibody)是人们利用基因重组技术,在基因水平上对抗体分子进行有目的切割、拼接、修饰,或直接进行基因序列合成,再将重组基因导入受体细胞表达产生出的一类抗体。其中单链抗体(singe-chain variable fragment,ScFv)已被广泛应用于医学领域,因为它具有低或无免疫原性、组织穿透力强、相对分子质量小、可大规模生产等特点。单链抗体制备方法有核糖体展示技术和噬菌体展示技术等。其中核糖体展示技术由于具有库容量远比噬菌体展示文库大、完全在体外进行、建库和筛选方法简便等优点,并且还可通过突变或重组技术来提高重组抗体的亲和力,因而显示出了诱人的发展前景。有机磷农药(Organophosphorus pesticides)是我国目前在农业生产上使用较多的一类化学农药,农产品上有机磷农药的残留直接危害人们身体健康。必须对农产品中的有机磷残留进行严格检测。目前对这类农药的残留分析一般采用气相色谱法等仪器分析法检测。但这些方法必须对样品进行复杂的纯化处理,且操作者必须经过严格的专业培训,不适合现场操作。近年来,被广泛用于小分子化合物定量分析的免疫分析法为有机磷农药残留的快速检测提供了可能,获得高亲和力和高特异性且廉价的抗体是免疫分析操作的关键,目前还没有应用核糖体展示技术制备抗有机磷的高亲和力单链抗体的报道。本研究利用核糖体展示技术筛选具有高亲和力和高特异性的抗杀螟硫磷的重组单克隆抗体。本研究用杀螟硫磷-BSA免疫BALB/c小鼠,构建了抗杀螟硫磷单链抗体文库,用杀螟硫磷-OVA作为筛选抗原,应用核糖体展示技术筛选特异于杀螟硫磷的单链抗体,然后将筛选的单链抗体基因表达、纯化,并研究其特异性与亲和力。制备的重组单链抗体为杀螟硫磷的快速检测奠定了基础,该单链抗体可用于杀螟硫磷的ELISA(酶联免疫分析)检测,也可用于杀螟硫磷的免疫传感器的制备。主要研究结果如下:①用重氮化法分别合成了免疫抗原杀螟硫磷-BSA和筛选抗原杀螟硫磷-OVA。②利用杀螟硫磷-BSA免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右,符合建库要求。③提取小鼠脾细胞RNA,经RT-PCR构建的单链抗体文库轻链为700bp左右,重链为400bp左右,经连接肽连接后所得到的单链抗体大小约为1.1kb。测序结果表明,单链抗体序列为开放阅读框。它们的的互补决定区都互不相同,说明所构建的ScFv文库多样性好,可进行下一步的单链抗体的筛选。④将构建的ScFv文库经体外转录/翻译后,产生了三元复合体(单链抗体-核糖体-mRNA,ARM)文库。用杀螟硫磷-OVA对产生的ARM三元复合体进行亲和筛选,洗涤后,使保留的三元复合体解离,再对释放的mRNA进行RT-PCR扩增获得筛选后的ScFv DNA文库,重复上述过程,得到经三轮筛选后的ScFv DNA文库。⑤将原始ScFv文库DNA和经过三轮筛选的ScFv文库DNA分别与噬菌体表达载体pPOW3.0相连接后,转入大肠杆菌DH5α中表达。然后后用间接ELISA分析单链抗体与杀螟硫磷-OVA的结合活性。结果表明从原始ScFv文库中随机挑取的50个克隆子的表达产物与杀螟硫磷-OVA几乎没有结合能力;而从经过三轮筛选后的ScFv文库中挑取的100个克隆子中有25%与杀螟硫磷-OVA有较好的结合能力。从三轮筛选后的ScFv文库中共挑取了190个克隆子,用间接ELISA法初筛到50株抗原阳性的ScFv。然后用生物传感技术对ELISA筛选呈阳性的ScFv进行了复筛,获得了3株高亲和力的单链抗体(ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132),用于下一步的表达、纯化和分析。⑥将筛选的抗原阳性ScFv进行了特性研究。单链抗体(ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132)特异性强、亲和力高。杀螟硫磷对它们的IC50分别为1.6、3.4和2.2 ng/ ml,检测限分别是0.02、0.07和0.01 ng/ml。它们与其它有机磷(甲基对硫磷、乙酰甲胺磷、马拉硫磷、乐果、三唑磷、毒死蜱)交叉反应低,除了与甲基对硫磷有一定的交叉反应(≤2.8%),其余的均小于0.1%。Biacore分析其亲和力表明,单链抗体ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132的解离平衡常数分别为4.56×10-10 M、1.42×10-9 M和2.66×10-10 M。⑦分析了ScFv基因的序列特征。IMGT(international immunogenetics database)软件分析单链抗体DNA序列,表明单链抗体scFv-AF50和AF132重链属于VH4基因家簇, scFv-AF93重链属于VH1基因家簇;三株单链抗体的轻链均属于Vk IV亚基因家簇。序列同源性通过basic local alignment search tool (BLAST)软件分析,表明scFv-AF50和AF93重链有97%的同源性,scFv-AF50和AF132轻链有89%的同源性。⑧以我们筛选的ScFv-AF132为抗体蛋白,以竞争ELISA进行了稻米和黄瓜中杀螟硫磷的添加回收率的实验,并与气相色谱进行了比较,ELISA法的回收率在80.6%-108%之间,而GC法则在64%-91%之间,两方法的相对误差无明显差异。
刘军莲[5]2006年在《高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的蛋白质组学研究》文中研究表明高脂血症及动脉粥样硬化属于中医“痰浊”、“血瘀”范畴,痰浊血瘀是高脂血症及动脉粥样硬化的重要病机早已成为共识,高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候可能是机体在血浆蛋白质水平发生了某些改变产生的后果,这些发生改变的蛋白质与动脉粥样硬化、高脂血症等疾病密切相关。寻找发生改变的蛋白质与高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的关系,将有利于深刻揭示痰瘀证候的生化基础和病因病机。 本研究以国家自然基金资助的“有关中医药几个关键问题”之一的“高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的蛋白质组学”课题为依托,把中医的基础理论与前沿的现代科学技术相结合,对证候在蛋白质表达水平上的变化及可能的差异蛋白质与证候各种影响因素的相关性进行了深入的探讨。 方法 1.采集符合条件的146例高脂血症及动脉粥样硬化痰证、瘀证、痰瘀互阻证和非痰非瘀类证候(其他证型)患者及37例健康对照的血浆样品,采用GE公司的IPGphor等电聚焦仪、DALTSIX垂直电泳仪等仪器进行双向电泳。 2.利用GE公司的图像分析软件ImagmAster 2-DE platinum6.0对血浆样品的凝胶图谱进行分析。 3.利用Fisher判别法筛选差异蛋白质的典型成分及图模型分析方法对差异蛋白质进行相关性分析。 结果 1.双向电泳实验获得的电泳图谱经软件分析,对变异度在70%以上的差异蛋白质进行分析,得到以下几方面的结果: (1) 有31种差异表达的蛋白质可能是高脂血症及动脉粥样硬化的标志蛋白质群,其中有18种蛋白表达量较正常人呈现上调趋势,13种蛋白表达量呈现下调趋势。 (2) 上述31种高脂血症及动脉粥样硬化的标志蛋白在痰瘀类证候中有16种蛋白表达量较非痰非瘀类证候呈现升高趋势,15种蛋白表达量呈降低趋势。 (3) 31个差异蛋白质中,表达量最低的蛋白质分布,非痰非瘀类证候5个,痰证3个,瘀证8个;痰瘀互阻证8个,其中包含2个瘀证特有的标志蛋白,仅包
王宁[6]2007年在《人子宫内膜窗口期基因表达平台的建立及特异基因的筛选》文中认为胚胎着床是哺乳动物独有的涉及胚胎和母体子宫内膜相互作用的生殖过程。此过程在时间和空间上都是高度有序的。哺乳动物的子宫内膜只有在着床窗开放时,才能接受胚泡,最终完成着床。人类的子宫内膜仅在月经周期很短的一段时期可以接受胚胎着床。大量研究证实这一时期主要受激素调控,接受态子宫内膜的形成是这一时期的一个重要事件。为了解着床窗口期事件包括接受态子宫内膜形成及胚胎着床等过程中的分子机制的全貌并深入研究着床窗口期的分子调控机制,本研究采用抑制消减杂交技术,将人着床窗口期和早泌期子宫内膜组织cDNA互相消减,构建了这两个时期的双向消减cDNA文库,并对筛选出来的部分已知和未知基因进行了深入探索。主要结果如下:1.为了构建人子宫内膜窗口期基因表达平台,我们从最初的实验材料选择就严格把关。我们以同一位志愿者的不同时相的子宫内膜作为自身对照,结合扫描电镜观察结果、B超检测结果、HE染色结果和PR免疫组化染色结果从多方面验证了材料的可靠性,为后续的分子生物学实验打下坚实的基础。2.SMART~(TM) PCR cDNA Synthesis技术和抑制性消减杂交技术结合起来,构建了人窗口期子宫内膜和早泌期子宫内膜双向cDNA抑制消减文库。3.在人窗口期子宫内膜cDNA文库(HWE)和人早泌期子宫内膜cDNA文库(HEW)911个PCR纯化产物进行斑点杂交分析,有354个在人窗口期和早泌期子宫内膜存在4倍以上表达差异,其中192个在窗口期差异表达,162个在早泌期差异表达。对斑点杂交筛选出的354个克隆中的130个克隆进行测序,共产生了93个质量满意的ESTs,总测序成功率达到71.54%。4.通过在互联网上的比对,在HWE文库中已知基因、已知ESTs和全新ESTs分别为52.46%、40.98%和6.56%:在HEW文库中分别为48.57%、48.57%和2.86%。5.对代表已知基因的ESTs按照功能分类,发现主要涉及细胞分裂/细胞凋亡、蛋白合成和分解、物质转运、分子伴侣、转录调控因子、信号转导、细胞骨架、粘附分子几类,并初步探讨了人子宫内膜围着床过程中差异表达基因的作用和意义。6.通过序列比对发现在HWE文库中编号为82G7的克隆序列与已知基因NID-1同源性很高,用原位杂交技术检测在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示NID-1在窗口期子宫内膜的基质细胞中高表达,在早泌期的子宫内膜组织中表达很弱。根据文献推测,NID-1基因的表达产物的作用可能在人类的胚胎发生、着床和蜕膜化反应中发挥重要作用。7.将人子宫内膜窗口期特异表达的克隆编号为82F4的EST序列进行RACE扩增获得一个新的cDNA序列,命名为PPI-82-F4,登录GenBank,获得登录号为EF063108。8.应用Northern杂交技术检测PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示PPI-82-F4在窗口期子宫内膜的表达显著高于早泌期。应用原位杂交技术检测PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示PPI-82-F4在窗口期子宫内膜的基质细胞和腺上皮细胞中高表达,在早泌期的子宫内膜组织中表达很弱。综上所述,我们采用抑制性消减杂交构建了双向人子宫内膜窗口期消减早泌期cDNA文库,在这两个文库中各有192和162个阳性差异的克隆,我们所得到的基因包括转录调控因子、信号转导、细胞骨架几类。母体子宫内膜从排卵到着床的过程中发生剧烈的变化,在孕激素的调控下,为了使着床窗开放做了充分准备,有很多相关基因表达。我们发现了一些基因的表达上调,同时还有一些基因表达降低或受到抑制,为我们发现潜在的新基因提供可能性。
参考文献：
[1]. 蛋白差示噬菌体表面呈现全套抗体库的初步研究[D]. 陈梅红. 第四军医大学. 1999
[2]. 噬菌体抗体库技术及其应用研究进展[J]. 潘博, 童贻刚. 生物技术通讯. 2010
[3]. 鱼源Fab噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗SAs抗体的可溶性表达[D]. 闫晓敏. 华中农业大学. 2010
[4]. 杀螟硫磷重组单链抗体研究[D]. 罗义辉. 重庆大学. 2011
[5]. 高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的蛋白质组学研究[D]. 刘军莲. 中国中医科学院. 2006
[6]. 人子宫内膜窗口期基因表达平台的建立及特异基因的筛选[D]. 王宁. 中国协和医科大学. 2007