万东君[1]2003年在《大鼠胎肝前体细胞的生物学特性研究》文中研究指明肝脏疾病(如肝炎、肝硬化)在我国具有很高的发病率，这些疾病最终导致肝功能衰竭，如何治疗肝功能衰竭目前仍然是肝病临床的一大难题，虽然现在公认的最好的治疗方式是肝移植，但是由于受到供体来源缺少的限制和移植后的免疫排斥反应，而不能广泛应用。自70年代末发展起来的肝细胞移植技术，具有许多优点：一个供体可以给多个受体提供肝细胞，移植技术简单，即使移植失败，对受体的影响也十分微小，因此受到越来越广泛的重视，在众多可供移植的细胞中，肝干细胞具有多向分化和增殖能力强的特点，其来源丰富，对于修复肝脏细胞、维持肝功能、治疗肝脏疾病，以及研究肝脏的发育学均具有重要意义。目前认为具有肝干细胞特性的细胞有：肝卵圆细胞、骨髓造血干细胞、胰腺前体细胞和胎肝前体细胞(HPFL)等。 研究目的：本实验以大鼠ED13.5d的HPFL为实验材料，目的在于探索：1)肝干细胞的体外分离培养的特点；2)肝干细胞的体外多向分化；3)体外扩增的肝干细胞植入体内的发育潜力；4)冻存复苏对肝干细胞的生物学特性的影响。以便为临床应用治疗肝脏疾病奠定基础。 研究方法：1)取ED13.5d的大鼠胎肝，酶消化法离散细胞，用红细胞裂解液去除红细胞，差速贴壁法去除其它细胞，接种于不同的基质和培养液中，MTT法比较不同培养液和培养基质对大鼠HPFL的体外生长影响。2)将初步纯化的ED13.5d的大鼠HPFL采用显微法进行克隆培养，免疫组化法 第四军医大学硕士学位论文筛选ALB”CK－19一的克隆进行诱导培养，观察ALB”CK－19一的细胞分化趋势。3）收集在原代大鼠成纤维细胞（PREF）饲养层上培养的原代HPFL，注人SCto鼠脾脏，观察HPFL植人体内的增殖发育情况／）将分离的大鼠ED13．sd的HPFL分别冻存3周和6周，检测细胞的活性和贴壁率的变化，以及分泌白蛋白等情况，观察冻存因素对HPFL的生物学功能的影响。 研究结果：1）含有 EGF的 DMEM：FIZ对于 HPFL的体外增殖明显优于其它培养液；在不同的培养基质中，PREF饲养层优于明胶和胶原，可促进HPFL的生长，并能延缓 HPFL在体外的分化。2）HPFL在体外克隆诱导分化试验中，ALB”CK－19一细胞克隆中能诱导出 ALB”CK－19”细胞，结果说明HPFL具有向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力。3）原代培养的HPFL植人SCto鼠脾脏后，结果发现能在牌内形成肝索样结构，并且＊七P酶活性试验呈阳性，显示出一定的肝细胞功能。4）冻存复苏对HPFL的生物学功能有一定影响，随着冻存时间的延长，复苏后的细胞活性和贴壁率有一定下降，白蛋白分泌峰值亦有所降低。 研究结论：HPFL具有干细胞的一般特性：具有很强的体外扩增和双向分化能力。尽管冻存复苏对HPFL的生物学功能有一定的影响，但HPFL仍可通过冻存长期保存，为“肝干细胞库”的建立提供了理论依据和实验数据。作为一种有潜力的备选细胞，HPFL所表现出的这些优于成熟肝细胞的特点，为临床应用治疗肝脏疾病，提供了一种新的选择。
孙冰[2]2006年在《胎肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究》文中进行了进一步梳理本文研究了胎肝干细胞的特性，并诱导其分化为胰岛素分泌细胞，着重进行了胎肝干细胞的体外扩增培养，探讨胎肝干细胞的生物学特性和性质，以及胚胎发育中胎肝前体细胞的类型；采用阶段性化学诱导、生物诱导以及二者相结合的方法，启动胰腺发育的相关基因，使胎肝干细胞分化为胰岛素分泌细胞。全文共分四个部分。第一部分，胎肝干细胞的分离、培养与鉴定。通过体外分离培养并扩增大鼠胎肝干细胞，研究其形态、生物学特性，采用免疫细胞化学分析胎肝干细胞表面标志物的表达情况，初步研究胎肝干细胞体外扩增培养的实验条件，并探讨肝脏的发生发育及肝干细胞的性质及增殖潜能。本实验选取胎龄12～16d SD大鼠，先用机械分离结合酶消化法分离培养胎肝细胞，继而用特异的干细胞培养基进行克隆筛选法获得了数量较多、较纯化的胎肝干细胞克隆。SABC法检测原代、传代后及细胞克隆中的肝干细胞特异表面标志物OV-6、CK-19及胰腺前体细胞特异标志蛋白Nestin的表达。以上研究表明，胎肝干细胞可通过克隆筛选法进行体外扩增，含有特殊细胞因子的干细胞培养基有助于肝干细胞的扩增，可获得较好的效果。培养3d左右开始出现小细胞团，1个月即形成肉眼可见的细胞集落，5～7d传代一次。原代、传代培养的胎肝细胞部分表达OV-6、CK-19及Nestin；细胞克隆几乎全部为干细胞标志阳性细胞，表明胎肝干细胞具有较强的分裂增殖能力。胎肝内存在Nestin阳性干细胞，我们称之为肝源性Nestin阳性祖细胞(nestin-positive hepatic-derived progenitor，NHP cells)，可能是一种更为原始的干细胞在胚胎发育中起重要作用。第二部分，胎肝组织细胞的鉴定及分类。本部分实验旨在研究胎肝干细胞性质的同时也为肝干细胞进行较系统的分类提供实验依据，探讨肝脏中干／祖细胞的类型并筛选出易于向胰腺方向分化的细胞类型，为下一步的诱导获取较佳的种子细胞。采用免疫荧光双标记法，针对OV-6、CK-19及Nestin叁种抗体中二种抗体的不同组合，FITC和Cy3分别标记，DAPI染核，针对胎肝组织和原代、传代及克隆培养的细胞中不同的前体细胞类型进行初步的定位及分类。胎肝中包含了从原始到成熟不同发育程度的各种肝脏细胞：(1)多能前体细胞：OV-6~+nestin~+CK-19~-细胞，可能具有肝胰多向分化潜能；(2)双能前体细胞：OV-6~+CK-19~+nestin~-细胞，是肝脏的双能干细胞，可分化为肝细胞系和胆管细胞系；(3)定向前体细胞或过渡细胞：仅表达OV-6或仅表达CK-19，可能分别是仅有向肝脏方向分化能力的肝前体细胞和向胆管方向分化的细胞，或是正在分化为成熟细胞的过渡阶段；(4)较成熟细胞。体外获得的nestin~+细胞数量较少，大多是与OV-6一同表达，仅表达nestin的细胞数量很少。OV-6~+nestin~+细胞和nestin~+细胞可能具有向胰腺细胞分化的潜能，从胰岛发育的过程推测β细胞与肝细胞有共同的来源，它们共同的祖细胞是胰腺导管上皮内和肝内的nestin阳性细胞。因此我们选取此类肝源性nestin阳性祖细胞作为下一步诱导分化的种子细胞。第叁部分，EGFP-PDX-1融合表达载体电穿孔转染大鼠胎肝干细胞的研究。本室构建了PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体，通过电穿孔转染入大鼠胎肝干细胞以得到较稳定的表达，期望借助于外源性生物因子启动胎肝干细胞中PDX-1基因的表达，从生物诱导方面研究胰腺内分泌发育的关键基因PDX-1在肝干细胞定向分化中的调控机制，为今后定向分化的深入研究提供物质平台。由PDX-1插入pEGFP-C1的多克隆位点中构建的重组质粒pEGFP-C1-PDX-1用电穿孔法转染体外培养的大鼠胎肝干细胞，分析转染前后细胞的生长曲线，荧光显微镜下观察GFP发光情况，RT-PCR鉴定PDX-1基因的表达情况。经电穿孔转染后GFP和PDX-1的融合蛋白能在胎肝干细胞中一起表达，并维持较长的时间，对胎肝干细胞的生长增殖无显着影响(P＞0.05)。构建的PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体能在胎肝干细胞中较持续地表达，为研究PDX-1在干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞中的调控作用提供了物质基础。第四部分，胎肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究。采用阶段特异性的化学诱导、生物诱导以及二者相结合的方法，模拟胰腺发育的内外环境，使胎肝干细胞分化为胰岛素分泌细胞，并探讨肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的内源性及外源性调控机制。将筛选出的nestin阳性胎肝细胞分组诱导，分别进行分阶段的以Nicotinamide为诱导剂的化学诱导、电穿孔转染PDX-1基因的生物诱导、生物诱导后化学诱导以及未诱导组。ELISA检测细胞上清液中胰岛素的含量，绘制标准曲线后换算出各组细胞释放的胰岛素量并比较；RT-PCR检测与胰腺发育相关的基因和肝细胞特异基因在各组的表达情况。Nestin~+胎肝细胞经生物、化学及二者结合法诱导后分泌的胰岛素量分别为0.539、0.943和5.58ng／ml上清液(1×10~5细胞)，与阴性对照组相比均有显着性差异(P=0.000)，其中任意两组相比也有统计学意义(P=0.000)。各诱导组均表达胰岛素Ⅰ、GLUT-2及肝干细胞标志HNF-1、AFP和c-met，而不表达胰高血糖素、生长抑素和ALB。生物诱导组和生化诱导组表达PDX-1和胰岛素Ⅱ，化学诱导组弱表达这两个基因。生化诱导法通过模拟细胞内外的微环境能获得较高的胰岛素分泌水平，并表达一系列胰腺发育相关的基因，但是，nestin~+胎肝细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的机制还需更深入的研究，以实现胰岛素的生理性分泌调节。
万东君, 李六金, 施新猷, 朱华平, 师长宏[3]2003年在《大鼠胎肝前体细胞的分离培养》文中指出目的 探索胚龄 (ED) 13 5d大鼠胚胎肝脏中肝前体细胞的生物学特性 ,为细胞移植及基因导向治疗奠定基础。方法 酶消化法分离肝前体细胞 ,观察不同体外培养对肝前体细胞生物学功能的影响 ,并用免疫组化方法鉴定分离培养细胞的分化标志。结果 肝前体细胞在原代胚胎成纤维细胞饲养层 (PREF)培养 ,其增殖能力较无饲养层培养强 ,原代培养可保持未分化状态。细胞分化标志鉴定提示ED13 5d大鼠胚肝前体细胞中存在双分化能力的细胞。结论 ED13 5d大鼠胚肝前体细胞存在双分化能力的原始肝细胞 ,肝前体细胞可在PREF进行体外扩增。
祝尔建[4]2008年在《基因修饰胎肝干细胞治疗肝纤维化的实验研究》文中提出研究背景:肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时,肝脏细胞外基质分泌与降解失衡,从而在肝细胞的间隙可逆性沉积的结果;是多种肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段;成为诸多肝脏疾病预后与转归的关键。因此,抑制甚至逆转肝纤维化的进展,具有重要意义。多年来,抗肝纤维化的药物层出不穷,但是至今尚未出现理想的治疗药物。近年来以细胞为基础的肝病治疗方面的研究逐渐深入,目前研究较多的是骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞及早期胚囊来源的干细胞、中期妊娠的胚胎肝脏来源的干细胞等。干细胞免疫原性低,移植后排斥反应小,更易于基因修饰。胎肝来源的肝母细胞,在治疗肝病方面,具有“天然”优势:移植后靶向性强,在受体肝脏中更容易向肝实质细胞分化。中期妊娠的胎肝肝母细胞含量丰富,它们具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能。另外肝纤维化相关因子的基因治疗也呈现出良好前景。从肝母细胞含量丰富的大鼠中期妊娠(ED14.5)的胚胎肝脏中,以机械分离法、OX43/OX44免疫吸附法等分离纯化出肝母细胞并对其进行鉴定;细胞培养:体外培养肝母细胞,分析SCF、bFGF、EGF和LIF等细胞因子对肝母细胞增殖和分化的影响,选出既能刺激肝母细胞增殖同时又抑制其分化的细胞因子(组合);鉴定细胞的分化状态;载体构建:在pEGFP-C1质粒基础上构建大鼠HGF基因和绿色荧光蛋白基因共同表达的融合载体;转染:用脂质体转染法将该质粒转染到肝母细胞中,通过绿色荧光蛋白和HGF的表达情况检测该质粒的细胞内工作状态;细胞移植:将能够表达HGF的细胞移植到CCl4肝纤维化大鼠体内,检测不同时间段肝纤维化大鼠肝功能和血清肝纤维化指标,血清中HGF及TGFβ1的浓度,肝组织中荧光蛋白数量和分布,肝组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的沉积情况以及肝组织内HGF及其受体和TGFβ1的表达水平。综上所述,本研究在传统方法上改进的肝母细胞分离纯化方法,兼顾操作简单,细胞产量大,细胞活性高的优点,适合用于胎肝来源肝母细胞的规模化生产。HGF是一种具有抗肝纤维化作用的细胞因子,而胎肝来源的肝母细胞具有很强的肝靶向性,移植后能归巢于受体肝脏,并增殖分化。本研究将载有HGF基因的肝母细胞既可以分化为具有正常功能的肝实质细胞而发挥治疗作用,又能够表达HGF,这两个方面互相促进,逆转了肝纤维化,改善了肝功能。
刘卫辉[5]2009年在《大鼠胎肝干/祖细胞的离心富集和绿色荧光蛋白转染》文中研究说明肝干/祖细胞移植治疗各种终末期肝病,是目前最具吸引力和最有前景的研究热点。然而,肝再生修复肝损伤的细胞系起源,是造血源性还是肝源性肝祖卵圆细胞仍然备受争议。目前为止,胎肝细胞被认为是满足肝细胞移植条件的唯一细胞来源,其用于肝再生的优点是:(1)移植后不需要选择压力来促使胎肝细胞增殖;(2)细胞移植后长时间继续增殖;(3)同时再造肝细胞和胆管,形成完整的肝小叶。然而,由于胎肝中细胞成分复杂,肝脏干细胞(liver stem cells, HpSCs)缺乏确定的标志,阻碍了胎肝干/祖细胞(fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs)的分离。本研究利用Percoll连续和非连续密度梯度离心法,进行FLSPCs的富集。选取可能的干细胞标志,对富集的胎肝细胞进行干细胞特性的鉴定。体外培养,动态观察FLSPCs的生长和分化模式,研究LSCs对于肝脏形成和损伤修复的作用。进一步利用pAcGFP1-N1转染FLSPCs使其能表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)作为示踪,以搭建研究胎肝肝干细胞移植效果的可靠平台。最后以化学毒剂CCl4制造急性肝损伤模型,初步观察FLSPCs的修复效果。搭建FLSPCs移植修复急性肝损伤的平台,具有双重生物学意义:发掘肝细胞移植的可靠种子来源;明确肝损伤时细胞的迁移机制。研究目的:1.示踪FLSPCs的构建:利用Percoll离心技术富集FLSPCs,转染质粒构建稳定表达GFP的FLSPCs。2.FLSPCs的修复效果:探讨经门静脉移植FLSPCs对大鼠CCl4所致急性肝损伤的影响。研究方法:1.FLSPCs的富集和鉴定将胎龄14 d的大鼠胎肝酶消化后,利用Percoll非连续密度梯度离心法(Percoll discontinuous gradients centrifugation, PDGC)进行FLSPCs的初次富集。选取7个可能的LSCs标志,行流式细胞仪检测单阳性细胞及双阳性细胞所占的百分率。利用Percoll连续密度梯度离心法(Percoll continuous gradients centrifugation, PCGC)将培养细胞分层。由上至下选取1、2层作为二次富集后的FLSPCs,进行干细胞的鉴定。2.扩增和纯化以含有EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化5 min为限,弃去上层漂浮的细胞;当细胞进行传代培养时,以贴壁时间100 min为界限,超过该段时间未发生贴壁的细胞去除,余下的细胞继续培养。3.FLSPCs的转染示踪提取pAcGFP1-N1质粒,1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定质和量合格。以脂质体转染法,将pAcGFP1-N1质粒导入FLSPCs。利用新霉素梯度筛选法,获得稳定转染的FLSPCs。4.FLSPCs的移植修复将近交系SD大鼠随机分成空白对照组(A)、损伤造模组(B)和FLSPCs移植组(C)。A组腹腔注射生理盐水,B、C组腹腔注射CCl4。24h后戊巴比妥腹腔麻醉,消毒开腹,B组门静脉注入生理盐水,C组门静脉注入GFP示踪的FLSPCs悬液。4 wk后,采血测定肝功能,取组织标本行HE染色观察病理,并利用荧光显微镜追踪GFP标记的细胞。研究结果:1.经流式检测发现,经PDGC初次富集的FLSPCs干细胞标志表达率均在50%以上,包括常用的标志CD133和CD49f,尤其CD117和C-Met表达率达到85%以上。40% Percoll溶液作为梯度介质,以PCGC能将较好地将细胞分层。随着细胞层次的增加,即细胞大小的增长,干细胞表面标志逐渐下降(P<0.05)。尤其是第4层,干细胞表面标志骤降,提示成熟细胞层的出现。经过二次富集,FLSPCs的CD133和CD49f表达率达到73%以上。2.随着体外扩增,细胞出现了大小的不均一性。经胰酶消化后,较大的细胞在5 min左右回缩被消化,体积较小的细胞则保持原状态。经传代培养时,较小的细胞在100 min时几乎都贴壁伸展,较大的细胞难以贴壁,经过去除后,细胞群呈现较好的一致性。3.转染pAcGFP1-N1质粒后4 h,蓝光激发下,荧光显微镜观察到个别细胞发出绿光的FLSPCs。转染后10 d,大量细胞发出荧光,细胞分布欠均匀。转染后20 d,大量细胞发出绿色荧光,密度分布较一致。30 d后,检测到转染率为60%。在新霉素的挑选下,未转染的细胞逐渐凋亡,最终为荧光细胞替代。4.A、B、C叁组血清ALT、AST水平差异明显(P<0.01),说明模型制造是成功的,且经门静脉移植FLSPCs能有效缓解CCl4致急性肝功能损伤水平。病理检测显示:A组肝脏损伤轻微;B组大量炎细胞浸润,大面积肝细胞坏死,部分肝板结构破坏;C组炎细胞浸润,部分肝细胞水肿、脂肪变性,肝板结构完整。揭示门静脉注入FLSPCs能有效改善CCl4所致急性肝病理损伤程度。冰冻切片荧光显微镜下可以观察到由FLSPCs分化而来的肝细胞形成的肝板结构,提示其参与肝脏的再生与修复。研究结论:1.成功建立了一套简单有效的富集纯化、体外扩增FLSPCs的方法,该方法不但能保证FLSPCs的数量,而且可以调整FLSPCs的纯度。2.成功构建了GFP稳定示踪的FLSPCs,为细胞移植和体外分化研究检测提供依据。3.经门静脉FLSPCs移植,对CCl4所致同一近交系大鼠严重的急性肝损伤起到明显治疗作用,并观察到其参与了损伤肝脏的再生与修复。
王亚萍[6]2013年在《鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究》文中指出第一章一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法背景干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中；根据其发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)是成体干细胞的一种,可分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞。跟据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,前者主要包括肝卵圆细胞、小肝细胞,后者主要起源于骨髓干细胞和胚胎干细胞。目前研究肝干细胞已成为世界范围的热点,由于它具有来源广泛、增殖能力强、移植细胞体积小等传统肝细胞无可比拟的优点,可以预测它将替代肝脏移植和肝细胞移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源。正是由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势,因此探讨如何获得高纯度的肝干细胞及其特异性的标志物有重要的现实意义。正常情况下,体内肝干细胞多处于静息期,数量极少,分离时常先经药物或手术造成肝脏损伤,肝脏灌流或联合细胞分离液分离来获得肝干细胞,操作复杂且成本较高。相比较传统的肝干细胞分离培养方法而言,本实验室首次采用先机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,简单的离心分离法和胰蛋白酶选择性消化法相结合,从孕15天大鼠胎肝组织中成功分离出肝干细胞。此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化,得到较为纯化的肝干细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。2、将卵圆细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上置于24孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱培养24小时,至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代,对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C-Kit、0V6、CK19的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1-2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、细胞角蛋白(CK)19呈阳性表达,不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、 CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。结论此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。第二章大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来,成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题,对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。一方面,有报道认为部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小,有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面,在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering's管的卵圆细胞(OVC)被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。目前,为研究成体肝脏中肝干细胞的增殖、分化,研究者们采用各种不同的方法抑制肝细胞增殖,并采用药物(如CCl4)或肝部分切除术等诱导肝脏急性损伤,以激活肝脏干细胞。从而研究肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。本研究鉴于RS是公认的能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂,而PH又能给予强烈的肝再生需求,我们建立了肝脏切除及其联合应用倒千里光碱导致肝脏急性损伤的大鼠模型,通过对Rs/PH和1/3PH后肝再生过程中成熟肝细胞和卵圆细胞的比较病理学研究,并依据研究中观察到的一系列现象,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。目的联合应用倒千里光碱(RS)和肝脏1/3切除术(1/3PH)建立大鼠肝损伤模型。观察大鼠肝损伤后肝细胞和卵圆细胞增殖情况,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。方法1、30只大鼠随机分为2组,每组15只。倒千里光碱／肝脏1/3切除组(RS/PH组)：取150g左右SD大鼠,腹腔注射倒千里光碱溶液30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周。肝脏1/3切除组(1/3PH组)：用生理盐水代替倒千里光碱,腹腔注射30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周,第2次腹腔注射4周后,两组大鼠行肝脏1/3切除术。2、分别于术后第3、7、14、20天处死大鼠,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,采用苏木精-伊红染色,BrdU注射及BrdU免疫荧光化学检测,CK19、 C-Kit免疫组织化学检测观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组化检测情况结果RS/PH组大鼠术后20d体质量仍低于术前,肝脏增大明显小于1/3PH组,HE染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性,汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生；1/3PH组术后20d体质量恢复接近术前,肝脏损害较RS/PH组轻,Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生,术后14d见肝OVC增生,多出现在肝细胞索中,形态和免疫组化标记与RS/PH组OVC一致。结论成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除术的急性肝损伤大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象,证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果。第叁章GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究背景各种原因引起的急、慢性肝功能衰竭的发病率和死亡率很高,已成为威胁肝病患者生命的主要原因。目前,原位肝移植(OLT)已被证明是治疗各种肝功能失代偿期、肝功能衰竭期最有效的治疗方法,但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后并发症多等限制了OLT的广泛应用。近年来,新的干预性治疗不断出现,肝细胞移植已开始应用于一些动物模型和人类临床实验,但由于肝细胞来源不充足,人们仍然希望能够获得大量更安全的细胞来源。肝干细胞的移植为此开拓了新的途径,肝干细胞是一种多能干细胞,它具有自我更新、高度增殖及向肝细胞和胆管细胞分化的能力,在体内可以分化为肝细胞和胆管细胞,参与肝脏的发生发育及损伤后修复等生理病理过程。若能将其大量扩增后再进行移植,就可能从量上解决细胞来源短缺的问题。肝干细胞移植相对于肝细胞具有更大的优势：(1)肝干细胞具有更大的增殖能力,植入受体后增殖能力强,较少的移植细胞数就能达到较好的增殖效果；(2)移植肝内后能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,对肝组织结构重建及功能恢复更为有利,更为重要的是,肝细胞增殖需要受肝存在选择压力,而肝干细胞在正常肝脏环境中就能大量增殖,为受体肝脏的再生及肝功能恢复提供机会；(3)肝干细胞分化不成熟,免疫原性更弱,Kubota等研究表明肝母细胞中不表达经典的MHC-1分子,在肝干细胞同种异体移植时能引起免疫逃逸。移植失败现象较肝细胞移植少,对受体影响小；(4)肝干细胞直径(10-12μm)较肝细胞(20-35μm)小,更容易通过肝窦到达肝脏各叶,使其定植及扩增效率增加。而肝细胞移植浓度较高时部分细胞则不能通过汇管区小血管。因此肝干细胞可以作为生物型人工肝和肝细胞移植最理想的细胞来源,从而在肝病基因治疗中发挥重要作用,并有望成为取代严重肝功能衰竭患者肝移植的替代疗法,具有很大的研究前景。本研究对L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠进行GFP转基因小鼠胎肝干细胞移植,结果表明本实验室建立的肝干细胞系能够成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝脏中,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。而在未作预处理的正常大鼠肝脏中未见GFP+肝干细胞。虽然我们并不能明确移植的胎肝干细胞在肝内增殖程度,但从肝脏中GFP阳性的细胞比例比较,L-CL2MDP/RS/PH实验组比正常对照组具有明显的优势。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。今后我们将扩展这一研究成果,努力与临床实践相结合,并回答移植研究中尚待解决的排斥免疫学机制问题。目的1、从荧光转基因小鼠胎肝中获得稳定表达GFP蛋白的肝脏干细胞2、联合应用L-CL2MDP/RS/PH,建立适合肝脏干细胞移植的大鼠动物模型,进一步提高肝干细胞的移植效率。方法：1、孕15d绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠,体重40-60g,SPF级150g左右SD雄性大鼠30只,GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离、体外培养与传代及免疫组化鉴定2、建立L-CL2MDP/RS/PH动物模型,将分离的胎肝干细胞通过脾脏注射移植到大鼠肝脏,检测细胞移植后GFP蛋白的表达,以及免疫组化检测C-Kit、 AFP明确移植的肝干细胞在肝脏内是否增殖。结果1、倒置显微镜下见分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。接种培养瓶24h细胞开始贴壁并伸展；培养5d后细胞体积增大,呈梭形或多角形,荧光显微镜可观察到细胞发出绿色荧光。传代3次后,细胞状态良好,在荧光显微镜下可见炫目的绿色荧光,免疫组化检测P3代细胞CD34、AFP呈阳性表达,。2. HSCs经脾脏移植后3d在荧光显微镜下观察两组大鼠的肝脏冰冻切片,发现L-CL2MDP/RS/PH组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,细胞大小为正常肝细胞的1/3-1/2,与周围细胞相比,呈现高亮度的绿色荧光；而对照组大鼠肝内未见GFP阳性细胞。移植后30d移植大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达,阳性细胞成团聚集、局灶状分布,细胞形态与肝细胞相似。结论1、从GFP转基因小鼠肝脏中成功分离出胎肝干细胞,分离的细胞原代形态均一、增殖速度快、传代3次后均可以稳定而强烈表达绿色荧光,为进一步研究提供了良好的示踪工具。2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。小结1、改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。本研究选择大鼠胚胎肝脏作为细胞来源,采用机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进一步纯化,得到较纯净的大鼠胎肝干细胞。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物,证实本研究分离培养的细胞具有干细胞特性,是肝干细胞。2、观察倒千里光碱联合肝脏部分切除术(RS/PH)对肝损伤后再生修复的影响。本实验成功构建了倒千里光碱联合肝脏部分切除术导致肝脏急性损伤的大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞增殖的现象,术后H-E染色发现RS/PH组汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生,CK19、c-kit阳性细胞出现在汇管区,特别是小胆管周围,形态与周围胆管细胞相似。而PH组未见以上表现。证实该模型可抑制成熟肝细胞增殖,同时通过刺激肝卵圆干细胞增殖以实现修复。这为研究适用于肝干细胞移植的动物实验模型提供一些有价值的信息。3、肝干细胞移植的成功率低仍是目前国内外研究中亟待解决的一个问题。为了进一步提高肝干细胞在肝脏中的存活,本实验室完成脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL2MDP)的制备,通过腹腔注射L-CL2MDP,特异性的清除肝脏及脾脏中的巨噬细胞,并进一步联合应用我们已经构建的倒千里光碱/部分肝切的大鼠肝损伤模型,建立一种新的肝干细胞移植模型。目前,我们从本实验室已有荧光转基因小鼠肝脏分离肝脏干细胞,获得稳定表达GFP的细胞株,将GFP+-LSC细胞通过脾脏注射移植给L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠。观察其在肝内的增殖情况,并对对照组和处理组加以检测及比较,以确定此模型是否能够提高肝干细胞的移植效率。
高沿航[7]2007年在《人胎儿肝脏干细胞体外分离培养及增殖分化机制研究》文中提出本实验从妊娠早期胎儿肝脏中分离获得具有肝干细胞特征的肝脏原始细胞(hFHSCs),对其一般生物学特性及增殖分化机制进行研究。结果如下:(1)通过联合酶消化、重力沉降、单克隆消化及选择性消化获得hFHSCs;分离纯化方法简单易操作,很好地保持了细胞活力,细胞纯度较高;(2)hFHSCs符合肝干细胞的基本特征:在体外具有很强的增殖能力;同时表达肝系及胆系标志物,提示具有双向分化潜能;核型分析正常且无致瘤性,提示为正常细胞;(3)hFHSCs可表达EGF、EGF-R及c-met,缺失表达HGF,表明HGF通过旁分泌途径作用与hFHSCs细胞的受体c-met结合,从而发挥其生物学功能;(4)HGF和EGF对hFHSCs有明显的促增殖作用;(5)HGF对hFHSCs向成熟肝细胞分化有重要影响,EGF可协同其发挥作用;(6)建立了体外诱导分化体系,为解决人源性肝细胞治疗供体短缺问题提供了理论线索;(6)HGF可促进hFHSCs细胞中NF-κB活化,该信号转导途径可能是HGF促进hFHSCs增殖分化的重要通路。本研究为获取人源肝干细胞提供了一种简单易行的方法,同时在体外建立了有效的向成熟肝细胞诱导分化的培养体系,而分化机制的探讨为进一步优化该体系提供了理论基础;整体连续的研究将为解决供体肝细胞短缺及最终在临床实现肝细胞和肝干细胞移植提供实验依据和新线索。
黄启科[8]2014年在《C57BL/6J-EGFP小鼠和F344大鼠胎肝干/祖细胞分离纯化及定向分化潜能的研究》文中研究说明研究背景：终末期肝病（End stage liver disease, ESLDs）是指各种肝脏疾病的最后阶段，主要包括急性肝衰竭、慢性肝衰竭和遗传代谢性肝病，其主要临床表现为肝功能严重衰退及门脉高压症等。该病进展迅速，死亡率高。作为治疗该病的最主要手段，肝移植长期以来一直受到供肝极度短缺、手术创伤极大、免疫排斥及免疫耐受困扰、手术费用高昂等影响，大量患者因此丧失了救治机会。以细胞为基础的治疗是一种有效的替代方法。与传统肝移植治疗相比，肝细胞移植（Hepatocyte transplantation，HCT）具有许多优势，例如低侵入性、低免疫原性和可重复执行性，这使其已经用于治疗终末期肝病。细胞移植治疗终末期肝病的关键是细胞类型的选择，但成体肝细胞不能保证持续扩增，加之持续灌注困难，无法大规模应用于临床。相对于上述缺点，干细胞移植作为一种新兴的治疗手段为患者带来了希望，而众多可供选择的干细胞中，胎肝干/祖细胞（Fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs）因多能性、高存活、高增殖、低免疫、小体积而优势明显。要使其应用于临床，其增殖、分化的相关机制就需要深入研究，而如果能够稳定大量的获得FLSPCs，使其在体外增殖，按需分化，并能在体内很好的示踪，则是开展肝脏发育和临床治疗应用研究的基础。研究目的：分离C57BL/6J-EGFP小鼠和F344大鼠的胎肝干/祖细胞，优化培养方案得到高纯度的FLSPCs，探讨其自我增殖能力，及其在体内外向肝细胞和胆管细胞双向诱导分化的潜能。研究方法：1.取孕13d C57BL/6J-EGFP小鼠和孕14d F344大鼠胚胎肝脏，经胶原酶消化和机械分离获得细胞并扩大培养；2.流式细胞术鉴定其干细胞标志物的表达3.RT-PCR及Western blot测定AFP表达；4.分别将FLSPCs经肝细胞生长因子（HGF）及转化生长因子-β（TGF-β）诱导分化后，Real-time PCR测量ALB、角蛋白CK-7、8、19以及Western blot测量ALB、CK-8在诱导前后的表达变化，鉴定其向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力；5.经尾静脉注射FLSPCs到肝切除C57BL/6J野生型小鼠体内，观察其在肝内重构肝组织的能力。研究结果：1.流式细胞仪检测分离的FLSPCs表达EpCAM、CD133、CD49f等干细胞标志物；2.RT-PCR和Western blot检测AFP在FLSPCs中的表达显着高于成熟肝细胞的表达，两者比较，差异有统计学意义（t=8.77，5.35，P＜0.05）；3.超低黏附培养皿培养FLSPCs克隆球形成率显着高于同培养条件成熟肝细胞的克隆球形成率，两者比较，差异有统计学意义(t=12.71，P<0.01)；体外HGF诱导FLSPCs分化，ALB、CK-8mRNA表达分别在8、10d到达峰值，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=42.55，25.17，P＜0.05）；两者蛋白表达峰值均出现于第10天，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=175.08，41.69，P＜0.05）；体外TGF-β诱导FLSPCs分化，CK-7、CK-19mRNA在第12d达到高峰，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=12.32，9.09，P＜0.05）；两者蛋白表达峰值均出现于第14天，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=53.89，39.71，P＜0.05）；4.在移植有FLSPCs的肝切除小鼠体内可检测到表达EGFP的成熟肝细胞及胆管细胞。研究结论：本实验通过IV型胶原酶消化及机械分离法获取和纯化胎肝组织中的FLSPCs，其稳定表达干细胞标志，证明所得细胞具有显着的肝干细胞特征和向肝细胞和胆管细胞双向分化的潜能，且在体内研究中拥有良好的示踪性。
李文林[9]2003年在《小鼠肝干细胞系的建立及其生物学特性研究》文中研究表明肝脏是哺乳类动物重要的消化器官，参与体内蛋白质、碳水化合物、脂类等生物大分子的代谢。肝脏的物质代谢功能决定了该器官容易受到不慎摄入的外界有害物质的损伤。很早就发现多种生物、理化因素引起肝脏损伤的同时，伴随有新生细胞的产生、增殖和分化，以修复损伤并维持肝脏功能的正常发挥。目前已有大量的实验证据表明，当广泛而慢性的损伤导致大量肝细胞死亡或者肝细胞的增殖能力被抑制时，在再生肝中可观察到卵圆细胞的增殖和分化。这种细胞并不存在于正常成体肝脏中，具有肝干细胞的特性，在适当的条件下能够分化为成熟肝细胞和胆管细胞。本课题致力于从损伤后的成体肝脏中分离并长期培养具有双向分化潜能的肝干细胞，并对其生物学特性进行研究。 最近，Gordon GJ等报道了一种新的肝脏再生反应，他们首先用倒千里光碱(Retrorsine)抑制大鼠成熟肝细胞的再生能力，然后通过肝2/3切除施以肝脏强大的再生刺激。肝脏再生过程中，肝实质中会产生一种集落样增殖的“小肝细胞样原始细胞”(Small Hepatocyte-Like Progenitor Cells,SHPCs)，并通过这种细胞的增殖和分化完成肝脏的再生。本研究采用类似的方法损伤小鼠的肝脏，发现小鼠的肝再生反应与大鼠不同。在小鼠再生肝中并没有观察到从形态学上可以分辨的“小肝细胞样原始细胞”，但是有明显的胆管反应和卵圆细胞增殖。采用两步胶原酶消化法从损伤后的再生肝中分离细胞，经过长期的培养和不断的纯化，最终在体外建立了形态均一的连续细胞系。该细胞系是典型的上皮样细胞，体外生长时成“铺路石”样排布；在电镜下观察，细胞核质比大，胞浆中除一些线粒体和核糖体外缺乏其他细胞器；在体外培养时细胞可以保持不分化状态，表达卵圆／胆管细胞的分子标志，如CK14，CK19，OV6，OC．10，c-met等；还表达造血干细胞的分子标志，如Thy-1，c-kit，CD45等。这表明该细胞具有肝干细胞的分子表型，并因此将其命名为肝上皮样原始细胞(Liver Epithelial Progenitor Cells,LEPCs)。 DMSO和丁酸钠是两种最常用的小分子细胞分化诱导剂。在丁酸钠作用下，LEPCs的生长受到强烈抑制，细胞体积增大，核质比减小。诱导后第四天，有双核细胞产生。电镜下观察，胞浆中的细胞器较诱导前明显增多，有线粒体、内质网和高尔基体以及大量的核糖体和糖原颗粒。在细胞与细胞之间还观察到了肝细胞特征性的细胞间胆管结构。免疫细胞化学实验表明，诱导后的细胞表达成熟肝细胞功能性的分子标志，如白蛋白、Aldolase B、APO A4、李文林博士论文小鼠肝干细胞系的建立及其生物学特性研究APOB、AO日等。这有力的证明了在丁酸钠作用下，LEPCs可以被诱导分化为成熟肝细胞。胞外基质对细胞的生物学行为有着巨大的影响，Matrigel基质胶被广泛的应用于多种细胞类型的体外分化。将培养的LEPCs接种于铺有Matrigel基质胶的培养皿后，细胞很快聚集成团并向四周放射状生长出许多管状结构，在电镜下可观察到细胞团中包括胆管样结构。肝干细胞最本质的特征在于具有向成熟肝细胞和胆管上皮细胞分化的双向潜能。以上实验结果表明LE户Cs可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞，具有肝干细胞的特征。 采用逆转录病毒介导的基因转染手段，将LEPCs标记LacZ、EGF户和OsREO作为报告基因。将标记后的细胞移植到小鼠损伤后的肝脏中研究了LEPCs在体内的分化走向。发现LEPCs可以在肝脏的微环境中分化为成熟的肝细胞并嵌和进入肝实质，在形态学上与临近的肝细胞不可区分。这进一步证明了LEpCs是一种来自小鼠损伤肝脏的肝干细胞系。同时也展示了肝干细胞在肝损伤性疾病治疗方面的潜在应用价值。 我们首次从倒千里光碱损伤的小鼠肝脏中建立了肝干细胞系。目前，尚未见到从小鼠损伤肝脏中建立类似细胞系的报道。该细胞系已经在体外培养了一年以上，传代超过30代。细胞保持了正常的核型和增殖能力，裸鼠移植实验证明细胞不具有致瘤性。LE尸Cs的建立为研究肝脏的发育、肝脏损伤后的修复、肝脏肿瘤发生以及肝脏疾病的细胞治疗的重大生物学和医学问题提供了理想的细胞模型和材料。
余宏宇[10]2004年在《小鼠肝干细胞存在的病理学依据及其在肝再生中的作用》文中指出在个体发育中，细胞有分化等级差异——从受精卵、胚胎干细胞、各级多能干细胞到有成熟结构和功能的各组织、器官的细胞。个体发育完成后是否某些等级的干细胞仍存留于个体的组织器官中呢?生命历程中，组织器官不可避免地经历生理性或病理性细胞丢失和再生。存留于造血系统、表皮和肠上皮中的干细胞在这种再生中发挥了关键作用。肝脏中又是什么情况呢? 有报道多种物理或化学损伤后肝脏几乎可以完全再生。成体内有没有肝干细胞?几种来源?肝再生是通过肝细胞增殖或通过被推论的肝干细胞增殖完成或通过它们两者共同完成的呢?许多学者为此做了很多工作，但观察结果和认识并不很一致，尚有几方面悬而未决的问题：①肝干细胞的存在和来源存有争议，尤其是骨髓肝干细胞和小肝细胞；②肝细胞和肝干细胞在肝再生中的作用：一方面，有报道认为2／3肝切除(PH)后大鼠肝再生系单独由肝细胞分裂增殖完成；另一方面，在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering's管(COH)的卵圆细胞(OVC)被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞；与之不谋而合的是Zajicet的流动肝假说。但是：正常肝内并未发现有OVC；在使用肝细胞增殖分裂的抑制剂(例如倒千里光碱，RS)结合急性肝损伤的条件下有OVC出现，但也有人报道此时是由肝小叶内小肝细胞完成肝再生的；另外还有人认为骨髓细胞可能是帮助损伤肝再生的肝干细胞来源，但也有持相反观点的报道。本组已应用RS／PH模型诱导小鼠OVC产生、建立了稳定传代的C57小鼠肝干细胞候选细胞LEPCs细胞系，但在复习既往切片时偶然发现PH对照组肝内有个别卵圆样细胞及肝窦内有小核分裂相，这些现象值得探究以便更深理解肝干细胞在肝再生中的作用。③有报道大鼠和人骨髓细胞可在肝内(转)分化为肝细胞，但却未知体外培养的小鼠成体肝内源性、易于扩增的HSC候选细胞是否经长期传代后仍能维持肝干细胞特性、并能植入肝脏增殖分化为肝细胞以参与受损肝重建。 为此，本研究针对上述问题展开工作，主要方法、结果和结论概述如下： 1．得到C57小鼠不同来源的肝干细胞候选细胞：骨髓细胞(BMC)、胎肝源上皮样集落形成细胞(FECFC)和两种肝内源性成体肝上皮样集落形成细胞(LEPCs和HECFC)。细胞体外诱导分化、回输体内脾结节形成实验和受体内衍生于骨髓供体细胞的Mx-Cre余宏宇博士论文小鼠肝干细胞存在的病理学依据及其在用再生中的作用和sry的检测(免疫组化和PCR)，表明:这几种来源(骨髓源、胎肝源、成体肝内源)的细胞具备肝干细胞特性。另发现肝损伤还能使骨髓源脾结节细胞肝胆标志表达增强。 2.病理观察肝再生中肝l胆管细胞、OVC和肝细胞源大核分裂相及肝干细胞源小核分裂相，发现:1) RSIPH组:小核分裂相所反映的内外源肝干细胞(包括OVC)可能是肝重建的决定因素，其中窦板交界处小核分裂相可能是骨髓源肝干细胞参与肝重建的形态学证据;2)RS组，4天后小核分裂相逐步增多，可能反映了内外源肝干细胞在肝细胞更新中的作用:3)大小核分裂相所反映的肝细胞与肝干细胞可能不仅是单纯PH组肝重建的共同决定因素，而且可能共同参与了正常对照组和假手术组肝细胞的更新。结合上述结果和相关报道，提出了肝流域假说—肝内源性成体肝干细胞存在于小胆管/coH附近，其能复制、产生子代(由OvC经小肝细胞)向肝细胞分化:不同分化等级的细胞从小胆管/C0H附近流经肝板汇向中央静脉，形成该流域干流;由血循环路过的外源性干细胞在干流不同的部位分裂增殖、部分转分化为肝系细胞，作为支流汇入干流。生理性肝细胞更新和病理性肝重建实际上是肝流域中叁种成分(位于小胆管/C0H附近的肝干细胞/OVC，有有限增殖潜能的成熟肝细胞和外源性干细胞)共同对肝再生信号作出反应的结果。 3.肝内源性成体肝干细胞系(LEPCs)在体外转入由Alb启动子/增强子调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，用脾注射法移植到小鼠CC14肝损伤模型中，通过供体源细胞的绿色荧光检测及连续冰冻切片的H一E染色和Alb免疫组化染色，观察到体外培养的LEPCs能植入受损肝并增殖分化为具有正常形态和功能的成熟肝细胞、帮助损伤肝重建。
参考文献：
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[5]. 大鼠胎肝干/祖细胞的离心富集和绿色荧光蛋白转染[D]. 刘卫辉. 第四军医大学. 2009
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[8]. C57BL/6J-EGFP小鼠和F344大鼠胎肝干/祖细胞分离纯化及定向分化潜能的研究[D]. 黄启科. 第四军医大学. 2014
[9]. 小鼠肝干细胞系的建立及其生物学特性研究[D]. 李文林. 第二军医大学. 2003
[10]. 小鼠肝干细胞存在的病理学依据及其在肝再生中的作用[D]. 余宏宇. 第二军医大学. 2004
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