关键词：酮体；肿瘤
【中图分类号】R917 【文献标识码】A 【文章编号】1439-3768-(2019)-02-WYP
与正常细胞相比，大多数癌细胞对葡萄糖的需求高于周围正常组织。所有癌细胞无论是细胞来源或者组织来源都是一种能量代谢障碍的细胞，由于癌细胞内线粒体结构功能缺损及β-羟丁酸脱氢酶（β-Hydroxybutyrate Dehydrogenase，β-OHBDH)或琥珀酰辅酶A：3酮酸辅酶A转移酶（succinyl-CoA：3—ketoacid CoA transferase，SCOT)等酶缺乏，导致癌细胞线粒体不能利用分解酮体类物质作为能量来源，从而使癌细胞由于不能获取营养物质而死亡[1]。
葡萄糖是推动癌细胞迅速增长的能源代谢物质，恶性肿瘤通过高度的有氧糖酵解消耗大量葡萄糖，在有氧条件下恶性肿瘤仍主要利用有氧糖酵解供能，而不是更高效产生ATP的氧化磷酸化方式[2]。另一方面，氧化应激为机体活性氧成分与抗氧系统之间平衡失调引起的适应性反应。自由基尤其是活性氧衍生物是氧化反应重要成分。酮体可以增加癌细胞的氧化应激，酮体能促进正常细胞葡萄糖转运蛋白1的表达，增强机体线粒体的呼吸作用，以加强其抗氧化应激能力。
生酮饮食以脂肪取代碳水化合物作为机体主要功能物质，目前生酮饮食用于临床肿瘤治疗主要针对两种恶性脑肿瘤：多形性胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤，而其效果还扔在观察中[3]。本项目选择针对小鼠皮肤肿瘤进行相关研究。
本项目中根据相关文献选择H22癌细胞试剂进行皮下注射[4]。
本项目通过喂食营养液排除其他因素影响更准确研究葡萄糖和酮体对癌细胞的影响，不仅对葡萄糖组和酮体组进行对比，并在时间前后上对每个个体肿瘤进行对比。
1 材料与方法
1.1 实验材料
16只6周龄正常小鼠，雌雄各8只，饲养于清洁实验室，每只鼠饲喂等量饲料。
带食盘和饮水器的鼠笼4个、木屑、磨牙石、营养液、体重秤。
1.2 实验步骤
1.2.1 建立移植瘤
取H22肿瘤细胞，3000转离心5分钟，再用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，取40微升细胞悬液加入10微升0.4%台酚蓝染色并镜检计数，制成浓度为3*106个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠背部皮下接种肿瘤细胞悬液0.2毫升。6日后开始记录肿瘤大小盒小鼠体重，并每3日记录一次。正常喂养6天可见0.5cm小结节，12天小鼠背部长出明显肿瘤，注意有无感染，18天进行营养液喂养。
1.2.2 营养液配制
调制营养液a、b两种，a营养液以碳水化合物为主，碳水化合物与蛋白质和脂肪的比例为4：1，b营养液以长链脂肪酸（long chain triglyceride,LCT)为主，脂肪与蛋白质和碳水化合物的比例为4：1，这种方法中机体能量来源90%来源于脂肪，10%来源于蛋白质和碳水化合物。营养液由上海帆泊生物技术有限公司配制。
1.2.3 动物培养
将16只大小、体重、精神状况相同的6周龄正常小鼠分为A、B两组，每组各8只，雄鼠和雌鼠分开饲养，避免因竞争繁殖互相咬伤。提供充足且干净的水和食物，以确保小鼠健康生长，减少过于密集的分配，以避免打斗。饲养笼勤通风，减少小鼠患病机率和异变。接种前喂养等量普通饲料。接种后喂养一个月，第6日开始记录肿瘤长径a和短径b及小鼠体重，计算肿瘤平均直径r=(a+b)/2。
1.2.4 营养液喂养
分别用量筒量取相同量进行喂食，A组小鼠喂食a种营养液，B组小鼠喂食b种营养液，培养在适宜温度20~28摄氏度一个月，避免阳光直晒并注意通风,继续每3日记录肿瘤长径a、短径b及小鼠重量。
1.2.5 肿瘤直径测量
使用游标卡尺，每周测量肿瘤长径a和短径b，计算平均直径r=(a+b)/2,每天测量小鼠体重。
1.3 统计学分析
用SPSS16.0以及GraphPad Prism7.0软件进行数据分析。用Mann-Whitney U非参数检验法比较重量、肿瘤生长，P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 小鼠重量
A、B两组小鼠均有增长。接种时，A、B两组平均体重分别为（20.2±0.7）g及（20±0.7）g(P>0.05)。实验结束时，两组小鼠分别为（28.8±1.0）g及（28.5±0.8）g（P>0.05）。
2.2 肿瘤大小
肿瘤细胞接种后18天，A组小鼠给予a营养液，B组小鼠给予b组营养液。每隔3日测量肿瘤长径a和短径b以评估肿瘤生长状况。A、B组小鼠肿瘤在喂养酮体为主饮食当日肿瘤平均直径分别为2.0cm和2.1cm，一月后A组小鼠背部肿块较大且出现明显出血、破裂，平均直径为2.7cm，B组小鼠肿瘤平均直径分别为2.3cm,且各小鼠时间前后对照，3只小鼠肿瘤直径未增长。
3 讨论
生酮饮食，即一种高脂肪、低蛋白、低碳水化合物饮食，生酮饮食影响癌细胞代谢基于1956年Warburg对肿瘤生长代谢的观点——肿瘤代谢高度依赖于葡萄糖作为能源来源，通过有氧糖酵解，产生能量，维持其生长需要[5]，后来研究表明肿瘤细胞主要依靠低效生成ATP的糖酵解方式来供应能量[6]。本实验用于验证以酮体为主的饮食对肿瘤生长的影响。肿瘤具有高代谢、以糖为主要能源物质的特点，酮体为主的饮食通过影响肿瘤代谢，减少机体糖供给来影响肿瘤生长。
本实验直接研究生酮饮食对小鼠背部肿瘤生长的影响，且发现以酮体作为主要营养物质的B组小鼠肿瘤生长情况对比A组明显受到抑制。目前实验应用的生酮饮食疗法有两种，一种为通过改变食物结构达到升高血酮体为目的的生酮饮食疗法（ketogenic diets,KD)，其包括经典的霍普金斯疗法（the classic KD)、MCT饮食疗法和Atkins饮食疗法。另一种为限制能量饮食（calorie restriction,CR)。本实验选用经典的霍普金斯疗法，即以长链脂肪酸（long chain triglyceride,LCT)为主，脂肪与蛋白质和碳水化合物的比例达到4：1，这种方法中机体能量来源90%来源于脂肪，10%来源于蛋白质和碳水化合物[7]。
本实验肿瘤模型的建立使用H22癌细胞试剂进行背部皮下注射，其具有价格低廉、容易操作等众多优点[4]。
酮体饮食目前主要用于治疗癫痫且疗效较好[8]，且对于治疗不同病因难治性癫痫有效性不受病因影响，对婴儿痉挛效果尤为显著[9]。目前，在治疗肿瘤方面，生酮饮食用于临床肿瘤治疗主要针对两种恶性脑肿瘤：多形性胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤，而其效果还仍在观察中[3]，也由此提出了生酮饮食的许多不足之处，首先配制复杂，费用较高，因个体差异进行生酮饮食配制更加困难，而且由于味道较差影响食欲，导致服用生酮饮食的患者体重下降。且生酮饮食有呕吐、腹痛、腹泻的不良反应，稍有不慎，就可能导致进行生酮饮食的患者出现水电解质紊乱的情况，引起各种并发症。目前对于生酮饮食治疗癌症只在动物实验和少数临床案件中有报道，且个别恶性肿瘤本身就有自愈能力，对于报道准确性也有待考证。
本实验在宏观上验证了生酮饮食对小鼠背部癌细胞生长有抑制作用，对于 临床效果还有待研究，生酮饮食疗法治疗癌症的治疗机制、治疗副作用、生酮饮食配制还有许多未知的问题。晚期癌症患者想尝试生酮饮食疗法，也不可轻信网络视频上的方案，而应该到已经许可的临床研究机构，经专业医生指导监测下进行。
参考文献:
1、郝光伟.生酮饮食对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响[J]. 中国肿瘤临床，2014,41（18）：1154-1157
2、陈平，夏良平，张蓓.癌细胞中葡萄糖代谢与转运特点[J]. 肿瘤学杂志， 2014,20（03）：244-247
3、严慧芳.生酮饮食真能饿死癌细胞[J].南方日报，2016
4、丁运萍，王建，杨文，刘学旭.多品系多部位腹水癌(H22)淋巴转移动物模型的研究[J].四川动物，2007，26（01）：185-188
5、Warburg O.On the origin of cancer cells [J].Science,1956,123(3191);309-314
6、Nishimura Y，RomerLH,Lemasters JJ.Mitochondrial dysfunction and cytoskeletal disruption during chemical hypoxia to cultured rat hepatic sinusoidal endothelial cells:the pH paradox and cytoprotection by glucose,acidotic pH,and glycine[J].Hepatology,1998,27(4):1039-1049
7、 KOSSOFF EH,Zupec-Kania BA,Amark PE,et al.Optimal clinical management of children receiving the ketogenic diet:recommendations of the International Ketogenic Diet Study Group [J].Epilepsia,2009,50(2):304-317
8、许海泉.生酮饮食治疗儿童难治性癫痫合并智力低下的研究[J].医学信息，2018，31（7）：57-60
9、许海泉.生酮饮食对不同病因及发作形式儿童难治性癫痫疗效差异的临床观察[J].医学信息，2018，31（08）
论文作者:王彩琴 余跃 刘霞芬 张博禹 周晶琳
论文发表刊物:《药物与人》2019年2月
论文发表时间:2019/5/28
标签：小鼠论文; 肿瘤论文; 酮体论文; 癌细胞论文; 饮食论文; 碳水化合物论文; 细胞论文; 《药物与人》2019年2月论文;