关键词：污染物；生物传感器；定量检测；污染物自动监测仪器
引言：在国家863计划和国家重大科学仪器设备开发专项的支持下，清华大学环境学院研究团队（以下简称研究组）经过十余年系统深入的研究，攻克了小分子环境污染物生物功能材料研制、传感元件修饰、微弱信号采集与干扰屏蔽等关键技术难点，完成了20余项发明和技术创新，成功地研制了基于生物传感技术的在线式、便携式、实验室台式和微型传感器四类水中有毒污染物高灵敏检测仪器。引领了环境监测生物传感器技术的发展，推动了该领域的技术进步。
1自动监测仪器的作用与原理
水中微量污染物自动监测仪器是具有自主知识产权的新型仪器，目前国际市场上还没有同类产品。此类仪器主要应用于对水中微量污染物的监测，可用于支撑国家对水环境保护与饮用水安保障的重大需求。
水中微量污染物自动监测仪器的研发工作包括四个组成部分：小分子污染物完全抗原制备、传感元件界面修饰及测试方法研究、污染物检测专用生物传感元件研发、仪器系统开发与应用验证。
首先，研究组自主创新提出了小分子污染物完全抗原制备的关键技术。在生物功能材料的研究中，突破了环境小分子污染物半抗原的完全抗原制备和高特异性抗体制备技术，在检测靶标物质耦联位点选择、分子改造间隔臂设计以及完全抗原空间构象控制等关键技术上取得创新性成果。以微囊藻毒素MC-LR为例，设计了新的制备微囊藻毒素-LR完全抗原的可行方案：即以7位氨基酸为偶联位点，在MC-LR分子上通过2-巯基乙胺引进氨基活性基团，采用戊二醛两步法将改造后的MC-LR与载体蛋白BSA偶联。并采用上述完全抗原的合成方案成功合成了完全抗原MC-LR-BSA。在已经合成的小分子环境污染物完全抗原的基础上，通过动物免疫制备的MC-LR单克隆抗体MC8C10，其亲和常数为2.76×108 L/mol，该抗体具有优良的反应灵敏性，并具有高度的特异性。研究组成功地研制了有毒有机物、重金属、生物毒素等特征污染物的抗体与核酸适体等对小分子环境有毒污染物具有高特异性识别功能的生物功能材料，建成了国内首个环境污染物抗体及免疫传感器配套功能材料库，为环境监测生物传感器的制备与应用提供了核心功能材料的保障。
2生物传感器关键技术难点与技术创新性突破
为了实现快速反应与定量检测，研究组在深入揭示复杂环境介质条件下生物功能材料交叉反应与基质效应的规律基础上，提出了水样的预处理和准确检测的方法体系。应用生物传感器实现环境污染物检测面临三个关键技术难点，一是各种不同环境背景产生干扰的消除；二是必须满足现场环境监测对传感器重复使用的需要；三是建立生物传感器用于环境检测的准确定量技术。面对上述问题，研究组提出了应对典型环境基质干扰（水样pH、离子强度、腐殖质等）的缓冲调节技术，保证了检测结果的准确性；提出采用间接竞争检测模式，通过优化控制反应体系条件，建立了标准化定量检测流程；研制了生物传感元件的再生活化技术，实现了传感元件的有效再生，确保检测标准偏差小于5%，能稳定重复检测可达200次以上，取得了生物传感器用于实际环境检测的开创性的技术突破。
研究组在技术原理上实现了创新性突破，将全内反射倏逝波原理与生物免疫反应原理相结合，有效利用倏逝波能量和生物材料特异性识别的优势，实现了对水环境中微量有毒污染物的快速精准检测。通过建立传感元件的数学模型，设计了具有专有波导结构形状的传感元件，保障传感系统在8个点位上入射激光的高效全内反射并产生精准位点倏逝波场，大幅度提高了传感元件对荧光信号的收集和传输效率。研究组提出了一种在传感元件表面固定修饰待测环境污染物的创新方法，有效地克服了环境检测传感器长期运行中生物分子失活的难题，在功能材料修饰与保证再生有效性的关键技术上取得了重大突破。实现了高载量、高稳定性、满足环境检测应用需要的新型生物传感元件制备，为生物传感器技术在环境监测领域的长期推广应用奠定了关键的技术基础。
3突破了光学系统五维，水中微量污染物自动监测仪器成果技术国际领先
在完成高灵敏生物传感器研发的基础上，研究组针对环境污染应急快速检测、特征污染物在线监测和实验室分析测试的技术需求，研制了微量有毒污染物检测生物传感器及仪器系统。研究中突破了光学系统五维（3维＋2个角度）自动调节及激发光与平面光波导芯片精确耦合的技术难点，采用多级逐级放大和数字锁相技术解决了复杂环境背景噪声下微弱荧光信号高灵敏度检测的技术难题。在上述成果的基础上产生了国际上第一台藻毒素在线分析仪和第一台多指标微量有毒污染物在线监测仪。研究组在多个水环境监测站对水中微量污染物自动监测仪器的性能进行了测试和验证。依据现行有毒有害污染物检测的国家和行业标准，对仪器检测实际水样中的二硝基苯、农药类2,4-D、重金属Hg、生物毒素藻毒素等的效果进行了对比与验证测试，测试结果表明本仪器的检测性能与HPLC等标准方法具有高度的一致性，且具有操作简便、费用低的优点，特别是可用于现场及在线自动监测。
水中微量污染物自动监测仪器通过了教育部组织的科技成果鉴定，鉴定意见认为：“该成果技术含量高、创新性强，具有自主知识产权，整体达到国际先进水平，其中藻毒素在线监测仪、生物传感器集成及仪器化达到国际领先水平。该成果已在多个环境监测站及科研机构成功应用，具有广阔的市场前景和社会效益”。国际同行对该成果给予了高度赞誉和肯定，例如：美国Northeastern大学April Z. Gu教授认为“清华大学研制的倏逝波光纤生物传感平台代表了国际上生物传感器的前沿水平……，该技术推动了生物传感器领域的发展，并将对现代环境监测和水资源可持续利用产生重大影响”。
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图1 生物传感器的间接竞争免疫反应原理
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图2 环境污染物免疫检测试剂与测试曲线.png)
图3 水中微量污染物自动监测仪器系统
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图4 水中微量污染物自动监测仪器及其对藻毒素的监测曲线
参考文献
【1】Han-Chang Shi, Bao-Dong Song, Automated Online Optical Biosensing System for Continuous Real-Time Determination of Microcystin-LR with High Sensitivity and Specificity: Early Warning for Cyanotoxin Risk in Drinking Water Sources, Environ. Sci. Technol. 2013, 47, 4434?4441
【2】Zhou Xiao-hong, Song Bao-dong, Shi Han-changa, An evanescent wave multi-channel immunosensor system for thehighly sensitive detection of small analytes in water samples, Sensors and Actuators B 198 (2014) 150–156
【3】Hongli Guo, Baodong Song, Hanchang Shi, Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by planar waveguide fluorescence immunosensor, RSC Adv., 2016, 6, 13837
论文作者:施汉昌1, 宋保栋2,,杨海洋2,,张晓聪2
论文发表刊物:《科学与技术》2019年第19期
论文发表时间:2020/3/16
标签：污染物论文; 生物论文; 传感器论文; 微量论文; 环境论文; 技术论文; 抗原论文; 《科学与技术》2019年第19期论文;