廖劲松[1]2004年在《原生质体融合提高玫瑰茄细胞生长速率的研究》文中认为首先，对微甘菊愈伤组织诱导和继代增殖培养进行系统研究，愈伤组织诱导研究表明：外植体中芽尖诱导率最高，在含2，4-D2.0mg／L、KT1.0mg／L、pH5.8的MS培养基上25℃黑暗条件下愈伤组织诱导效果较好。继代培养的关键问题在于褐变控制，继代培养的优化条件为：培养基添加5.0mg／L的抗坏血酸(Vc)，激素比例改用2，4-D0.5mg／L+NAA2.0mg／L+KT0.5mg／L+BA0.5mg／L，添加15％新鲜椰子汁，于2000lx光照16h／d培养，在细胞生长对数期进行继代转接。并对微甘菊细胞悬浮培养条件进行研究，结果表明，微甘菊细胞生长适宜的碳源是蔗糖，并且较合适的蔗糖浓度为30g／L；在不同蔗糖浓度下氨基氮的吸收差别不大，氨基氮在迟滞期和对数期前期已基本消耗完毕，对数期生长主要利用硝基氮，因而提出，在微甘菊细胞液体悬浮培养中，氮源可以采用初始低氨基氮浓度，对数期中间维持高硝基氮，而且对数期中逐步流加少量的氨基氮；微甘菊细胞迟滞期分裂启动存在密度依赖现象，对数期生长存在密度抑制现象，最适接种量为40g／L。微甘菊细胞悬浮培养一个周期的生长基本呈现典型的S型曲线。和玫瑰茄相比，微甘菊生长曲线对数期时间比玫瑰茄多2d；玫瑰茄培养渡过对数期之后很快就进入衰亡状态，而微甘菊培养第13d～16d这四天减慢期生长依然旺盛。 然后，本文系统研究了微甘菊和玫瑰茄原生质体制备与再生的条件。结果表明，较好的原生质体分离方案为：取微甘菊和玫瑰茄新鲜愈伤组织或悬浮培养对数期细胞系作为材料； 采用降糖、添加L-半胱氨酸和质壁分离叁者结合的方式进行对两种植物细胞材料进行预处理；采用混和酶解液(组合为2％Celluase+0.5％Hemicellulase+0.2％Pectinase+CPW盐溶液+0.65mol／L甘露醇+0.1％2-N-吗啡啉乙磺酸+10mmol／L CaCl_2，pH5.7)26℃低速振荡酶解，微甘菊最适酶解时间为4h，玫瑰茄最适酶解时间为3h。低熔点琼脂糖包埋法比较适合培养原生质体；原生质体最适培养密度为5×10~5个／mL；采用KM8p培养基有利于原生质体的持续分裂和生长；最佳激素组合为：IAA 1.0mg／L+2，4-D 0.05mg／L+KT0.1mg／L；26℃培养温度和黑暗条件有利于原生质体再生成愈伤组织。 继而，将微甘菊与玫瑰茄进行不对称融合。融合前将供体微甘菊原生质体进行UV辐射处理，研究UV对原生质体分裂及生长的钝化作用，结果表明辐射强度300μW／cm~2时处理时间6min为宜；将受体玫瑰茄原生质体用16mmol／LIOA预处理10min钝化。试验了融合过程各因素对融合效果的影响，结果表明：PEG6000对融合率影响最显着，其浓度以40％最好；甘露醇浓度和pH高低对促融效果影响也比较明显，甘露醇以0.7mol／L为宜，pH值为9.5时最好；另外CaCl_2·2H_2O和KH_2PO_4。
谢秀祯[2]2005年在《拟南芥植物硫肽激素基因的克隆及其在玫瑰茄细胞中的表达》文中认为植物细胞培养技术在中药、植物药以及其他天然化合物的生产中具有巨大的潜力，它能从根本上解决传统方法(包括化学合成、从野生植物材料中提取、人工栽培)所面临的资源和环保问题。然而，由于植物细胞生长速度慢、生产周期长、且易招致染菌，极大地阻碍了这一技术的产业化发展。本研究通过建立一个高效的玫瑰茄细胞遗传转化体系，然后利用这一转化体系将来自拟南芥的植物硫肽激素基因AtPSK2导入玫瑰茄细胞，并实现功能性表达，以期获得在低密度条件下能启动细胞分裂和增殖的转基因细胞系。主要的研究结果如下： 1．以根癌农杆菌LBA4404(pBI121)和EHA105(pBI121)为供体菌株，对玫瑰茄外植体遗传转化的基本条件进行了系统的研究，初步建立了两个有效的玫瑰茄细胞遗传转化体系。不论采用无菌苗的下胚轴切段或子叶切块还是愈伤组织作受体材料，均能获得稳定表达GUS活性的转化愈伤组织和稳定表达NPTⅡ活性的转化细胞系。但用无菌苗的下胚轴切段或子叶切块作受体材料，其转化率远远高于用愈伤组织作受体材料时的转化率，前者为29.4％，而后者仅有4％。采用愈伤组织作受体材料时，使用乙酰丁香酮作诱导物，可大大提高转化率。另外，农杆菌LBA4404菌株更适合于玫瑰茄的遗传转化。 2．根据拟南芥基因组数据库提供的序列信息设计引物，通过对PCR反应体系和反应条件进行优化，将变性温度提高到96℃，并分段采用两个不同的退火温度，最终从拟南芥总DNA中克隆到AtPSK2基因和AtPSK3基因。序列分析表明它们的核苷酸序列与拟南芥基因组数据库的完全相同，两者分子大小分别为412bp和505bp，均由一个大内含子和两个外显子组成，但都不含5′-和3′-UTR序列。 3．通过用AtPSK2基因取代pBI121质粒上的gus基因，构建了一个重组表达载体pBI-PSK2，然后利用本研究建立的遗传转化法将之导入到玫瑰茄细胞中，获得卡那霉素抗性的玫瑰茄细胞系和愈伤组织，PCR检测证明了AtPSK2基因及其表达调控元件已经整合到玫瑰茄细胞的基因组中。 4．利用低密度的玫瑰茄细胞培养系统检测到了拟南芥植物硫肽激素基因AtPSK2在玫瑰茄细胞中实现了功能性表达，表现出在低密度条件下促细胞分裂与增殖的活性；另外，利用固体培养还检测到AtPSK2基因促愈伤组织生长活性，转化愈伤组织的比生长速率比对照提高了75％。
何雪娇[3]2009年在《朱砂根细胞组织培养及其岩白菜素含量分析》文中认为朱砂根是着名的药用花卉植物,其主要药用成分为岩白菜素。本试验以朱砂根的愈伤组织为材料,进行如下研究:①朱砂根愈伤组织的生长和分化的影响因素的研究;②朱砂根愈伤组织岩白菜素提取工艺的优化和岩白菜素含量HPLC测定方法的建立;③朱砂根悬浮细胞培养体系的建立及其细胞培养过程中的动力学研究;④朱砂根悬浮培养细胞的生长与岩白菜素含量的关系研究。主要研究结果如下:1朱砂根愈伤组织生长与分化的研究试验比较了不同培养基类型、不同碳源及其浓度、不同氮源、植物生长调节剂、不同光照强度、不同光质及添加物水杨酸对朱砂根愈伤组织继代、增殖与保持的影响。结果表明:MS+0.5 mg·L-1 2,4-D是朱砂根愈伤组织继代、增殖与保持的最佳培养基;最佳碳源为25 g·L-1蔗糖;最佳氮源为1900 g·L-1 KNO3;最佳培养条件为遮光培养;水杨酸的最佳添加浓度为10-5 mg·L-1,最佳添加时间为第20 d。在MS+0.05 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1 KT+100 mg·L-1肌醇+4 %蔗糖+3 %甘露醇+5 %椰汁培养基中根分化率最高,历时也较长;在同等条件下,激素对朱砂根愈伤组织分化根的影响效果为KT>6-BA>NAA;1/2 MS培养基比MS培养基更易促进朱砂根愈伤组织中根的分化。2朱砂根愈伤组织中岩白菜素的提取工艺、测定及含量研究本试验在单因素试验的基础上选取提取温度、提取时间、水料比这3个因素进行二次回归正交组合设计试验(响应面分析法),利用响应面法对其提取工艺参数进行优化研究。结果表明,当提取时间为49.7411 min,提取温度为80.0846℃,料液比为1:9.9966时,岩白菜素浓度达到最大为81.3388 ug·mL-1。测定方法:HPLC的流动相为甲醇:水=20:80(梯度洗脱),检测波长为275 nm。试验比较了不同培养基类型、不同碳源、不同氮源、植物生长调节剂、不同光照强度、不同光质及添加物水杨酸对朱砂根愈伤组织中岩白菜素含量的影响。结果表明:有利于朱砂根愈伤组织中岩白菜素含量的积累的培养基为4 mg·L-1 2,4-D + 1.5 mg·L-1 NAA + 0.5 mg·L-1 KT;0.5 g·L-1水解酪蛋白可以提高岩白菜素的含量;最佳氮源为1650 mg·L-1 NH4NO3;最佳光照为遮光培养;绿光可提高岩白菜素的含量;培养第20 d添加10-4 mg·L-1水杨酸可提高岩白菜素的含量。3朱砂根悬浮细胞系的建立及培养过程中的动力学研究本试验将颗粒性强的的愈伤组织进行悬浮培养,研究了基本培养基、激素、培养条件、接种量,细胞浓度及碳源对朱砂根细胞培养中细胞生长和岩白菜素含量的影响;测定了朱砂根细胞生长和岩白菜素积累的动态变化,并对悬浮培养的理化特性和动力学做了初步的研究。结果表明:悬浮培养细胞在MS培养基中生长良好,细胞分散性较好;最佳激素组合为0.5 mg·L-1 2,4-D+0.05 mg·L-1KT +0.1 mg·L-1 NAA;细胞继代周期以8 d左右为宜;悬浮细胞适合在23℃-25℃、110 rpm下生长;最佳碳源为蔗糖15 g·L-1添加0.03 g·L-1Ad;最佳接种密度为0.0714 g·mL-1。悬浮培养细胞在第3-7 d为对数生长期,细胞干重至第7 d达到最大。在细胞对数生长期内,岩白菜素积累与细胞生长呈线形正相关性,第7 d岩白菜素含量达到最大值0.0148 %。朱砂根悬浮培养基中营养物质(如氮源、磷源和碳源)的消耗与生物量的积累和岩白菜素的生物合成呈一定的相关性。试验建立了朱砂根细胞生长、蔗糖消耗、岩白菜素合成的动力学方程:细胞生长:底物消耗产物合成:上式中,μ代表比生长速率,μm代表最大比生长速率,KS代表底物饱和常数,KI代表底物抑制常数,Cs代表底物浓度,qs代表底物的比消耗速率,YX/S代表为底物消耗对细胞的得率系数,m代表细胞的维持系数,YP/S代表产物对底物消耗的得率系数,qp代表产物的比生产速率,α,β代表比例系数。经过验证,模型预测值与试验结果有较高的拟合度,说明模型具有一定的合理性、可信度。4朱砂根悬浮细胞生长与岩白菜素含量关系研究在MS基本培养基中,60 mM的硝态氮而去掉氨态氮,朱砂根悬浮培养细胞的生长最快;而当氨态氮与硝态氮的摩尔浓度比为5:1,总氮源为40 mM时,悬浮培养细胞岩白菜素的生物合成能力最强。采用氮源改变调节的二步培养可使细胞的生物量和岩白菜素含量分别达到0.3498 g和0.0478 %,分别为对照的3.11倍和3.57倍。磷酸盐浓度为1.1 mM时,即为MS基本培养基中磷酸盐浓度时,细胞生长量达到最高为0.1851 g,岩白菜素的含量也达到最大为0.0239 %;Mn2+,Zn2+,BO33+,I-,MoO42-,Cu2+,Co2+,Fe2+这8种元素中I-,MoO42-,Cu2+,Co2+对岩白菜素的合成影响较大,I-浓度提升到5倍,MoO42-浓度提升10倍,Cu2+浓度提升10倍,Co2+浓度提升20倍,即I-(25μM),MoO42-(10μM),Cu2+(1μM),Co2+(2μM)时对岩白菜素合成效果最佳。在这四种微量元素的最佳浓度的协同作用下,朱砂根细胞的生长量和岩白菜素的含量可分别达到0.2105 g、0.0287 %,分别是对照的168.43 %、227.78 %添加诱导子水杨酸10-5 mg·L-1,且在第6 d加入时,岩白菜素含量达到最大。
江年琼[4]2002年在《叁白草和鱼腥草原生质体融合的研究》文中提出本研究的主要内容及结果有以下几点： 1对叁白草科的叁白草(Saururus chinensis (Lour.)Baill.)和鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)的核型进行了分析，结果表明：叁白草和鱼腥草的核型公式分别为K(2n)=22=4m+16sm+2st和K(2n)=24=14m+10sm。 2叁白草的茎、叶和地下根茎均可诱导出愈伤组织，但以嫩茎段作为外植体，以MS为基本培养基，添加NAA0.2mg／L和BA1.0mg／L及肌醇200mg／L时愈伤组织诱导率较高。外植体消毒以0.1％HgCl2处理8min污染率最低。 3在叁白草悬浮培养时，不同碳源、蔗糖浓度、激素种类、不同培养基和接种量等对叁白草悬浮培养细胞的生长均有影响。其中以3％蔗糖作为碳源，以MS培养基中附加2，4-D1.5mg／L和BA1.0mg／L为好，接种量为4.0gDW／L时，细胞的绝对生长速率较快。 4通过L9(3~4)和L16(4~5)的正交设计，对酶溶液最佳配方及影响原生质体融合的因素进行了研究，结果表明：分离叁白草原生质体酶溶液的组成以1.5％的纤维素酶、0.1％果胶酶、0.7mol／L甘露醇和10h的酶解时间为好。分离鱼腥草原生质体的酶溶液除纤维素酶的浓度为1.0％外，其余与叁白草相同。由40％PEG(6000)、15mmol／L CaCl_2 2H_2O、0.4mmol／L KH_2PO_4和0.7mol／L甘露醇组成的、pH为9.0的融合剂效果较好。原生质体密度为1×10~6个／ml较佳。 5用PEG诱导融合的双核异核体率为11％左右，将融合原生质体培养在含有NAA1.0mg／L和BA0.5mg／L的MS培养基中，5～6d后，再生细胞发生首次分裂，培养12周后，将直径约2.0mm的愈伤组织转移到添加NAA1.0mg／L的MS培养基上培养4周，愈伤组织迅速增殖。杂种愈伤组织中，80％以上的染 叁自草和鱼腥草原生质体融合的研究 色体数目在36～50条之间，但形态学上有一定的变异。随着继代时间的延长， 染色体的变异系数越来越小。研究结果表明，叁白草和鱼腥草原生质体融合获得 了属间杂种愈伤组织。 6对杂种愈伤组织和两种原植物的混合物，分别用醇和水进行提取，再对提 取物进行药理实验，结果表明：杂种愈伤组织和两原植物混合后的水提取液可使 小臼鼠胸腺的重量增加，p＜O．05，但两者间无显着性差异，p＞0刀5。
谢秀祯, 林俏慧, 郭勇[5]2008年在《拟南芥植物硫肽激素基因在玫瑰茄细胞中的表达》文中研究说明利用玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系,通过根癌农杆菌将AtPSK2基因导入玫瑰茄细胞,并获得了功能性表达。研究结果表明,所获得的转基因玫瑰茄细胞系的临界植板细胞密度和临界起始细胞密度分别降低了60%和50%,悬浮细胞培养周期由16d缩短到12d,转化愈伤组织的比生长速率比对照提高了75%,转基因玫瑰茄细胞和愈伤组织中的花黄素含量与对照相比没有发生明显变化。本研究所获得的转基因玫瑰茄细胞系不仅为花青苷和花黄素等次生代谢产物高产细胞株的选育提供出发材料,而且为PSK-α作用机理的深入研究提供一个有用的模型。
杜晓映[6]2008年在《葡萄细胞的悬浮培养及诱导子对悬浮细胞多酚产量影响的研究》文中研究指明利用悬浮培养提高植物次生代谢物的产量,是生产某些次生代谢物的新方法。本实验利用鲜食葡萄巨峰,酿酒葡萄赤霞珠、黑比诺作为材料,以B5培养基作为基本培养基通过调整培养基的配比和激素浓度建立起了稳定的细胞悬浮体系,优化了细胞悬浮培养条件。通过在细胞悬浮培养过程中的不同时期添加不同浓度的外源诱导物质,蔗糖、苯丙氨酸。茉莉酸甲酯和紫外光(UV-C)处理,研究了诱导子对巨峰葡萄悬浮细胞生长和总酚、花青素、白藜芦醇产量的影响。为利用细胞培养进行次生代谢物的大规模工业化生产提供了理论依据。本实验研究结果如下:1.建立了稳定的葡萄细胞悬浮体系选择了适合葡萄愈伤组织产生和进行悬浮培养的激素浓度及配比、pH、蔗糖浓度等。不同的葡萄品种诱导愈伤组织和悬浮培养所需要的激素浓度与组合是不同的。以B5+250㎎·L~(-1)水解酪蛋白+0.1㎎·L-1NAA+0.2㎎·L~(-1)KT+30g·L~(-1)蔗糖+6g·L~(-1)琼脂为诱导愈伤组织的培养基,叁种材料均能建立起适合愈伤组织生长的培养体系。以B5+1㎎·L~(-1) NAA+0.5㎎·L~(-1) 6-BA+30g·L~(-1)蔗糖组成的液体培养基能建立起适合巨峰生长的细胞悬浮体系。以B5+250㎎·L~(-1)水解酪蛋白+2㎎·L~(-1) 2,4-D+0.2㎎·L~(-1) KT+1% PVP+30g·L~(-1)蔗糖组成的培养基能建立起适合赤霞珠生长的悬浮细胞系。以B5+1㎎·L~(-1) NAA+0.5㎎·L~(-1) 6-BA+0.2% PVP+30g·L~(-1)蔗糖组成的培养基能建立起适合黑比诺生长的悬浮细胞系。从生长状况来看,叁种材料的愈伤组织和悬浮细胞生活力均为巨峰>赤霞珠>黑比诺。巨蜂葡萄的悬浮细胞呈粘稠、均一、稳定的黄白色,以单个细胞和小细胞团的形式存在,适合进行诱导处理;酿酒葡萄赤霞珠和黑比诺的悬浮细胞主要以单个细胞和小细胞团的形式存在,底部存在有少量的的组织团块,颜色较深,易褐化。2.选择了适合悬浮培养的继代方法选取连续继代数次(3次以上)的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织15-20g,放入装有40ml液体培养基的100ml叁角瓶中,25℃下120rpm,黑暗条件下摇床上振荡培养,24h后将葡萄细胞悬浮液静置,将上层培养基连同单细胞和小细胞团一起转移到灭过菌的空叁角瓶中继续振荡培养,弃去大的组织团块及大的细胞团。3-4d后视情况用同样的方法再转移一次。一周后将已经粘稠的、正处于对数生长期的细胞加入其体积一半的液体培养基稀释,继续振荡培养。达到一定体积后转移到大的叁角瓶中,用同样的方法继续添加培养基振荡培养。直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液。在以后的继代过程接种量每40mL只要5～10g之间就可以快速建立起生长稳定的细胞悬浮培养体系.3.探索了防止和减轻悬浮细胞褐化的方法通过对愈伤组织的挑选、接种量的控制、转瓶、PVP和大孔吸附树脂的利用以及挽救等措施,探索了防止和减轻悬浮细胞褐化的方法。4.诱导处理对细胞生长的影响各种诱导处理对悬浮细胞生物量的增加都没有促进作用,相反诱导处理之后悬浮细胞会出现或轻或重的褐化现象。5.蔗糖对巨峰悬浮细胞多酚合成的影响不同浓度的蔗糖对悬浮细胞总酚的含量都有提高作用,并且总酚含量随着蔗糖浓度的增加而增加,但是蔗糖浓度越高褐化越严重。而蔗糖的添加对花青素的含量影响不大,30g·L~(-1)的蔗糖能轻微提高花青素含量,7.5 g·L~(-1)和15g·L~(-1)的蔗糖对花青素的含量则有轻微抑制作用。对于白藜芦醇,适当浓度的蔗糖对其含量有提高作用,浓度过高则有抑制作用。15g·L~(-1)的蔗糖能显着提高白藜芦醇的含量。6.苯丙氨酸对巨峰悬浮细胞多酚合成的影响苯丙氨酸的添加能显着提高总酚、花青素和白藜芦醇的含量。7.茉莉酸甲酯的添加对总酚和白藜芦醇的含量都有促进作用,但对花青素的含量有轻微的抑制作用。8.紫外光处理对巨峰悬浮细胞多酚合成的影响一定强度的紫外光UV-C处理能提高悬浮细胞的多酚含量。在紫外灯(直径D=2.5cm,长度L=88 cm,功率P=30W,λ=254nm)放在距悬浮细胞35cm处照射强度为41.5μW·cm~(-2)条件下照射2h,总酚、花青素、白藜芦醇含量均有显着提高。
郭肖红, 高文远, 陈海霞, 肖培根[7]2005年在《药用植物培养高产细胞系的选育》文中进行了进一步梳理通过植物发酵培养获得有用的药用植物次生代谢物是解决药用植物资源问题的有效手段。然而,大多数有用的次生物质在植物细胞中含量极低。为此,在工业化生产中首先需要适时地对植物细胞进行选育和改良,以解决提高植物细胞中次生物质含量问题。本文对药用植物培养高产细胞系选育方法和研究作了概述,针对高产细胞系筛选、诱变育种和基因转移关键共性技术研究及对解决高产细胞系不稳定性问题进行了讨论。
姜思佳[8]2011年在《胡桃楸体胚发生及胚性细胞悬浮体系的建立》文中研究指明胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim),属胡桃科落叶乔木,产于黄河流域以北和东北地区。胡桃楸木材优良被人们称为“东北叁大硬阔”(水曲柳、胡桃楸、黄菠萝)之一。由于胡桃楸树形优美观赏效果好,并具有较好的抗性和耐性,同时可吸收工业废气改善人类的生存环境,因此近年来在园林绿化中应用较为广泛,主要是街道绿化的行植和小环境的片植。此外胡桃楸还具有较高的药用和工业生产价值。近年来胡桃楸资源的过度开发利用及种子库繁殖率低等多种原因导致了胡桃楸林木资源的匮乏。体胚培养为种质资源的保存和利用提供了新的途径。本论文主要对胡桃楸体胚的发生体系及胚性细胞悬浮培养体系的建立进行了深入研究,为实现胡桃楸的快速繁殖、良种培育、体胚生物反应器生产技术研制以及林木树种基因工程的研究奠定了基础,主要研究结果如下：1.诱导胡桃楸胚性愈伤组织的最适条件是：①以合子胚为外植体时最易诱导出胚性愈伤组织,外植体最佳取材时期为5-6月(幼胚),合子胚愈伤诱导率最高达91.3%。②胡桃楸胚性愈伤组织最适诱导培养基为MS+1.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA附加蔗糖30g/L、琼脂6g/L。③体胚的诱导、发育和分化的适宜的培养基为MS基本培养基附加蔗糖30 g·L-1、水解酪蛋白700mg·L-1、琼脂6g/L并且不添加任何生长调节物质。2.悬浮培养最佳繁殖培养基为1/2MS+0.05mg/L 2,4-D的液体培养基；最佳体胚发育培养基为1/4MS不添加任何生长调节物质的液体培养基；最佳接种密度为7g/L,此浓度既有利于增殖,有利于发育生长。3.胡桃楸悬浮细胞培养液中,pH值的变化趋势呈“V”字型,细胞干重增加值变化呈“S”形曲线,胡桃楸悬浮细胞接种后第6d,培养液的pH平均值下降至4.21,细胞干重增长缓慢；12d时培养液pH平均值开始逐渐上升至5.3,细胞干重增长快速；15d以后悬浮细胞生长末期时将培养液的pH平均值维持在5.44左右,细胞干重趋于稳定。4.在细胞悬浮培养过程中,①30g/L蔗糖浓度有利于细胞繁殖和生长,蔗糖浓度过高或过低都影响细胞的生长。②悬浮培养的细胞生长周期在15d左右。③不同蔗糖浓度下悬浮培养发现,胡桃楸细胞对蔗糖的水解速度随蔗糖浓度的增加时间增长。④细胞内还原糖的含量随培养液中蔗糖含量的增加差异性逐渐减小
宋继园[9]2008年在《促进沙枣浓缩鞣质合成的植株栽培和愈伤组织培养技术研究》文中提出沙枣(Elaeagnus angustifolia L.)属胡颓子科植物,其主要活性成分为浓缩鞣质。为了有效开发沙枣生产浓缩鞣质,本文研究了沙枣植株浓缩鞣质含量的时空变化,施肥和外源诱导物对沙枣植株浓缩鞣质含量的影响;本文同时开展了沙枣愈伤组织培养浓缩鞣质生物合成的调控的可行性研究。结果如下:1沙枣中浓缩鞣质含量动态变化的研究一个生长季中不同月份的沙枣叶片中浓缩鞣质含量差异显着,在7月份和10月份两次达到高峰,分别为27_28和34.36 mg·g~(-1)DW;沙枣各个部位浓缩鞣质含量的高低顺序是:树皮＞树根＞树叶＞一年生新枝;腐殖土适于沙枣生长与浓缩鞣质的积累,施肥促进沙枣生物量的迅速增加、不利于浓缩鞣质的积累,单独合理施用氮肥既能促进植物生长也能促进沙枣叶片中浓缩鞣质的积累。2外源诱导物对沙枣中浓缩鞣质含量的影响外源水杨酸和脂肪酸诱导均可促进沙枣浓缩鞣质的积累,400 mgL~(-1)水杨酸溶液诱导第3天时沙枣叶片和一年生新枝中浓缩鞣质含量最高、分别达到50.87和20.01 mg·g~(-1)DW,分别是对照的2.43和1.53倍;250mgL~(-1)脂肪酸溶液诱导第2天时沙枣树皮中浓缩鞣质含量最大、为90.78 mg·g~(-1)DW,是对照的1.77倍。3沙枣组织培养体系的建立以叶片为外植体,以MS培养基附加2,4-D1.00 mgL~(-1)+BA0.50 mgL~(-1)激素组合对沙枣愈伤组织进行诱导,诱导率达98.00%;附加BA1.00 mgL~(-1)的MS培养基为沙枣愈伤组织分化培养的最适培养基;附加IBA 1.00 mgL~(-1)的MS培养基为沙枣最适生根培养基,移栽1月后成活率可达92.00%。4促进沙枣愈伤组织中浓缩鞣质合成技术的研究附加2,4-D1.00 mgL~(-1)和BA0.50 mgL~(-1)的MS基本培养基利于愈伤组织生长和浓缩鞣质的积累,培养20天时浓缩鞣质含量达到19.46 mg·g~(-1)DW;愈伤组织分化不利于浓缩鞣质的积累;添加蛋白胨和紫外辐射促进沙枣愈伤组织浓缩鞣质的积累,愈伤组织中浓缩鞣质最大可达56.25 mg·g~(-1)DW,是对照的2.89倍。
张进杰[10]2007年在《哺乳动物Bax基因对金丝桃细胞凋亡和金丝桃苷合成的诱导作用及其机理研究》文中指出Bax基因是动物凋亡基因Bcl-2家族中的一员，具有促进动物细胞凋亡的作用。以往研究报道表明Bax基因可以诱发模式植物细胞过敏性反应和凋亡。为了探讨哺乳动物Bax基因对药用植物细胞凋亡和细胞中次生代谢产物合成的影响，本文以本实验室构建保存的转小鼠Bax基因的金丝桃细胞(雌二醇诱导型启动子)为材料，研究了小鼠Bax基因对金丝桃细胞凋亡和金丝桃苷合成的影响，并初步探讨了Bax基因诱发金丝桃细胞凋亡和金丝桃苷合成的信号转导机理，主要实验结果如下：1、转小鼠Bax基因金丝桃细胞系悬浮培养条件的优化将固体培养的转小鼠Bax基因金丝桃愈伤组织接种到MS培养液中，为获得最优细胞生物量和金丝桃苷含量，对培养液(植物激素组成、pH值和蔗糖浓度)、培养温度、摇床转速和接种量等条件进行优化，得到了金丝桃悬浮细胞系的最适培养条件：培养液为MS+1.5×10~(-5)mol·L~(-1)NAA+10~(-6) mol·L~(-1)BA+3％蔗糖，使用前pH值调至5.8，培养温度为25℃，摇床转速为100 rpm，接种量为3g／50mL medium。并且在此培养条件下测得细胞生长周期为12 d。在优化培养条件的过程中，对传代种细胞进行Bax基因的PCR鉴定筛选，最终获得了生长速度较快、形态比较稳定的金丝桃诱导型转小鼠Bax基因悬浮细胞系。2、小鼠Bax基因对金丝桃细胞凋亡的影响及其机理的初步研究Western blotting检测结果表明，添加25μmol·L~(-1)雌二醇(Est)可以诱导转小鼠Bax基因金丝桃细胞中Bax的稳定表达。转小鼠Bax基因金丝桃细胞经Est处理后，21h时胞外培养液pH值开始升高；用Sytox green特异性DNA染料对细胞进行染色，24h时就能检测到细胞的死亡，且随着时间的延长死亡细胞数量逐渐增加，在60～72h时可以观察到明显的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等形态学上典型的凋亡特征，而对照组细胞无上述特征。此结果表明小鼠Bax基因在金丝桃细胞中的诱导表达可以诱发细胞凋亡。DNA琼脂糖凝胶电泳结果表明，经Est处理48h后的转Bax基因金丝桃细胞的基因组出现明显的“DNA Ladder”，而对照组细胞检测不到“DNA Ladder”，表明小鼠Bax基因的诱导表达可以诱发核小体间的DNA发生断裂。此结果进一步证实小鼠Bax基因可以诱发金丝桃细胞凋亡。为了探讨小鼠Bax基因诱发金丝桃细胞凋亡的分子机理，本文测定了金丝桃细胞中一氧化氮(NO)的含量。试验结果表明，Est处理后12h，转基因金丝桃细胞的NO含量开始出现增加，并且在第25h左右达到第一个高峰，随后出现小幅下降，在大约33h左右又开始快速增加并在40h左右达到第二个高峰，而对照组细胞的NO含量未出现明显变化。试验结果表明，小鼠Bax基因的诱导表达可以诱发金丝桃细胞NO进发。NO专一性淬灭剂cPTIO在淬灭NO进发的同时，也抑制了由Bax诱发的细胞凋亡，说明NO是参与Bax诱发金丝桃细胞凋亡所必需的信号分子。DPI是质膜NADPH氧化酶的专一性抑制剂，可以抑制细胞的氧化进发。本文试验结果表明，DPI处理虽然不能抑制Bax诱发的金丝桃细胞凋亡和核DNA断裂，但可以推迟细胞凋亡和“DNA Ladder”的出现时间，说明由质膜NADPH氧化酶介导的氧化进发作用可能参与了Bax对金丝桃细胞凋亡的促进作用，但不是Bax诱发细胞凋亡的必需信号转导事件。3、小鼠Bax基因对金丝桃苷合成的影响及其机理的初步研究在未诱导Bax基因表达的前提下，转小鼠Bax基因金丝桃悬浮细胞和野生型金丝桃悬浮细胞，在细胞生长和金丝桃苷合成积累上没有区别。在转Bax金丝桃悬浮细胞生长周期的不同时间段添加Est进行Bax的诱导表达，发现细胞生长对数期末期(第9 d)为促进金丝桃苷合成积累的最佳诱导时期，第12 d收获得鲜重为对照的94％，金丝桃苷含量达到了对照的2.15倍。在Bax诱导金丝桃苷合成的过程中，悬浮培养的金丝桃细胞发生了NO进发事件。NO专一性淬灭剂cPTIO可以有效的消除Bax诱发的NO进发，并且在一定程度上抑制了Bax诱导金丝桃苷的合成；外源NO也可以诱导金丝桃细胞中金丝桃苷的合成，cPTIO能抑制外源NO诱导金丝桃苷的合成。此结果表明NO介导了一条Bax诱导金丝桃苷合成的信号途径。质膜NADPH氧化酶的专一性抑制剂DPI对Bax诱导金丝桃苷的合成也有一定的抑制作用。通常，在植物细胞中，质膜NADPH氧化酶介导的氧化进发的直接产物主要为H_2O_2。外源添加H_2O_2能够有效的诱导金丝桃细胞中金丝桃苷的合成。过氧化氢酶(CAT)类似于DPI可以在一定程度上抑制Bax诱导金丝桃苷的合成，而CAT对外源NO诱导金丝桃苷的合成无抑制作用。NO专一性淬灭剂cPTIO对外源H_2O_2诱导金丝桃苷的合成也无抑制作用。综上所述，可以推测在转Bax基因金丝桃细胞中，NO和由质膜NADPH氧化酶介导而产生的活性氧类物质(eg.H_2O_2)可能通过两条独立的信号途径介导Bax诱导金丝桃苷的合成。
参考文献：
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[9]. 促进沙枣浓缩鞣质合成的植株栽培和愈伤组织培养技术研究[D]. 宋继园. 东北林业大学. 2008
[10]. 哺乳动物Bax基因对金丝桃细胞凋亡和金丝桃苷合成的诱导作用及其机理研究[D]. 张进杰. 浙江工商大学. 2007
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