（1广东省中医院药剂科 广东 广州 510030）（2广州采芝林药业有限公司 广东 广州 510145）
【摘要】 目的：探讨复合酶法优化提取地黄多糖工艺的方法。方法：通过单因素和 L9（34）正交实验设计，以地黄多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH对多糖得率的影响为试验因素，优选地黄多糖的提取工艺。结果：最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度55℃，酶浓度4.5%，酶解时间2.0h，酶解pH 6.0。在此提取工艺条件下，地黄多糖含量占原药材的7.58%。结论：复合酶法提取地黄多糖工艺操作简便、快捷，重复性、稳定性良好。
【关键词】 复合酶法；地黄多糖；提取工艺；正交试验
【中图分类号】R94 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）24-0369-02
Optimization of Extraction Technology of Radix Rehmanniae Preparata with Mixed Enzymes
Wang Runzhen1,Li Chuyun1,Huang Xiaolong2.
1 Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital . GuangZhou, 510030 , China;
2 Guangzhou Caizilin Pharmaceutical Co., Ltd. GuangZhou, 510145 , China
【Abstract】Objective To optimize the extraction technology of Radix Rehmanniae Preparata with Mixed Enzymes. Methods The effects of temperature,enzyme concentration,extraction time,and pH on yield of polysaccharides were investigated,on the basis of single-factor experiments and orthogonal test for enzymatic action in Radix Rehmanniae Preparata extraction, and there were three levels for each of the factor. The Mixed Enzymes of Radix Rehmanniae Preparata was optimized by L9（34） orthogonal test using Radix Rehmanniae Preparata content as assessing index.Results The optimum extraction conditions were as followed: extraction temperature of 55 ℃，enzyme concentration of 4.5%,pH 6.0,extraction time of 1.5 h,the yield of polysaccharides were 7.58%. Conclusion The optimized extraction technology of Radix Rehmanniae Preparata is simple and quick to operate and has good repeatability and stabilization.
【Key words】Mixed Enzymes;Radix Rehmanniae Preparata;Extraction technology;Orthogonal test
熟地黄（Radix Rehmanniae Preparata）为中药中常用的补血药，为玄参科植物地黄的新鲜或干燥块茎经加工炮制而成[1]。生地黄具有清热凉血，养阴生津，润肠通便的功效，而熟地黄功效偏于滋补，具有补血滋阴、益精填髓的作用[2]。临床上常用的补血基础方四物汤，就是以熟地黄作为君药。熟地黄多糖是熟地黄中特有的活性成分之一，药理研究表明，熟地黄多糖有增强免疫力、补血、抗突变、抗肿瘤、抗氧化等生理功能[3]。近年来，有关熟地黄多糖的提取工艺[4-9]已有报道，但是关于复合酶法提取熟地黄多糖的提取工艺鲜见报道，复合酶法具有能耗低、操作简单、易实现产业化、条件温和、提取效率高、环境友好等特点，在天然产物的提取中越来越受到重视。因此，本研究通过单因素和L9（34）正交实验设计，以地黄多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH对多糖得率的影响为试验因素，优选地黄多糖的提取工艺，为地黄多糖的进一步深入研究提供依据。
1.材料与方法
1.1 试验材料
DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；SB-3200DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1800紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；DGH80-B 恒温干燥箱（北京中西远大科技有限公司）。
地黄购买自北京同仁堂，产地为河南焦作；实验中所用蒸馏水均为市售屈臣氏蒸馏水；葡萄糖（天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯）；苯酚、浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；中性蛋白酶（酶活力≥100U/mg）、纤维素酶（酶活力≥400U/mg），（大连美仑生物技术有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1标准曲线的绘制 精密称量葡萄糖对照品20mg置于100mL容量瓶中，溶解并稀释至刻度，混匀后即得0.2mg/mL的葡萄糖标准品储备液。精密吸取适量葡萄糖标准品储备液，用蒸馏水分别稀释至0、10、20、40、80、120、160μg/mL，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度，分别取0.2mL溶液于6个干燥比色管中，向各管中分别加入0.5mL5%苯酚、2.5mL浓硫酸，摇匀，室温下放置20min，以不加标准溶液的相应溶液作空白，在紫外可见分光光度计490nm下测定其吸光度（A）。按照葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制线性标准曲线，其回归方程为：A=0.7023C-1.9664，R=0.9994。测定多糖质量浓度线性范围是0～160μg/mL。
2.结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
按照葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，溶液在490nm处的吸光度（A）为纵坐标，绘制线性标准曲线，其回归方程为：A=0.7023C-1.9664，R=0.9994。测定总糖质量浓度线性范围是0～160μg/mL。
2.2 单因素和正交试验结果
单因素结果表明，酶解温度、酶浓度、酶解时间、酶解 pH对于地黄多糖含量均有影响，其中酶解温度小于50℃时，随温度增高，多糖得率增多，温度大于55℃时，多糖得率下降，说明此时酶活性降低。酶浓度在4.5%以下时，得率属于上升状态，而大于4.5%时，复合酶会对地黄多糖进行分解，降低提取效率。酶解时间大于2.0h时，同样也会使多糖分解。复合酶在偏酸性条件下pH 6.0时活性最好。
由表2试验结果可知，对地黄多糖的提取效果的影响顺序为：酶浓度（B）＞酶解温度（A）＞酶解时间（C）＞酶解 pH（D），即复合酶浓度对地黄多糖的提取效果影响最大，酶解温度次之，酶解时间和酶解pH影响较小。以地黄多糖的得率为考察指标，4因素3水平最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度55℃，酶浓度4.5%，酶解时间2.0h，酶解pH 6.0时，其提取效果最佳。
2.3 最佳提取工艺的优化及验证
在此提取工艺条件下，重复三次进行最优提取条件的验证，地黄多糖含量占原药材的 7.58%，RSD=1.77%（n=3）。结果表明，筛选的最佳提取条件基本稳定，有较好的重复性。
3.结论
本文通过复合酶法优化提取地黄多糖工艺，以地黄多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH为试验因素，得到最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度55℃，酶浓度4.5%，酶解时间2.0h，酶解pH 6.0。在此提取工艺条件下，地黄多糖含量占原药材的7.58%。利用优化后的复合酶法工艺进行地黄多糖提取，具有操作不仅简便、快速，而且重复性、稳定性良好等优点，适用于地黄多糖的规模化提取，为地黄多糖的进一步深入研究提供依据。
【参考文献】
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论文作者:王润珍1,利楚云1,黄小龙2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年8月第24期
论文发表时间:2018/9/5
标签：多糖论文; 地黄论文; 熟地黄论文; 工艺论文; 浓度论文; 温度论文; 葡萄糖论文; 《医药前沿》2018年8月第24期论文;