摘要：目的 分析该院2015年1月-2016年12月临床分离的肺炎克雷伯菌（Kpn）的分布情况及耐药性，指导临床合理用药，控制肺炎克雷伯菌的医院感染。方法：对临床分离出来的286株肺炎克雷伯菌进行标本，科室分布的统计及耐药性分析，并对其中多重耐药肺炎克雷伯菌作ESBLs，AmpC酶，碳青霉烯酶，新德里金属β内酰胺酶（NDM-1）等试验。结果 286株肺炎克雷伯菌主要来自痰液，占79.72%（228/286），其次为尿液及伤口分泌物，分别占8.74%（25/286），5.59%（16/286）；主要分布于ICU，呼吸内科，分别占56.29%（161/286），27.62%（79/286），产ESBLs肺炎克雷伯菌检出162株，检出率为56.64%（162/286），产AmpC酶检出39株，检出率为13.64%（39/286），产KPC酶28株，检出率为9.79%（28/286），产NDM-1检出2株，检出率为0.70%（2/286）。结论 该院肺炎克雷伯菌主要分离自痰标本，以ICU感染最为严重，其次为呼吸内科，肺炎克雷伯菌的耐药率比较高，且耐药表型多样，对多重耐药株检测耐药机制非常重要，以便控制医院的感染。
关键词：多重耐药肺炎克雷伯菌；超广谱β-内酰胺酶；药敏试验；医院感染
Distribution and drug resistance analysis of nosocomial infection of
Klebsiella pneumoniae
Xiao Qi-guo Tang Mei-hua（Department of Clinical laboratory，Central Hospital of Hengyang City，Hunan 421001，China）
【Abstract】Objective To analyze the distribution and drug resistance of Klebsiella pneumoniae（Kpn）isolated from clinical patients in the hospital during January 2015 to December 2016，and to guide rational drug use in clinic and control nosocomial infection of Klebsiella pneumoniae.Method A total of 286 strains of Klebsiella pneumoniae isolated from clinical patients were collected，the specimen Department Distribution and drug resistance were analyed.ESBLs，AmpCenzyme，carbapenemase and NDM-1enzymes tests were carried out with multidrug resistant Klebsiella pneumoniae.Results The 286 strains of Klebsiella pneumoniae were mainly isolated from sputum，accounting for 79.72%（228/286），followed by urine and wound secretions，accounting for 8.74%（25/286）and 5.59%（16/286）respectively；The strains were Mainly distributed in ICU and respiratory medicine department，accounting for 56.29%（161/286）and 27.62%（79/286）respectively，162 strains producing ESBLs Klebsiella pneumoniae were detected，the detection rate was 56.64%（162/286），39 strains producing AmpC enzyme were detected，the detection rate was 13.64%（39/286），28 strains producing KPC enzyme were detected，the detection rate was 9.79%（28/286），2 strains producing NDM-1 enzyme were detected，the detection rate was 0.70%（2/286）.Conlusion Klebsiella pneumoniae was mainly isolated from sputum specimens in the hospital，most seriously infected was ICU，followed by respiratory medicine department，the resistance rate of Klebsiella pneumoniae was relatively high，and the phenotype of drug resistance was diverse.It is very important to detect the mechanism of multidrug resistance in order to control nosocomial infection.
【Key words】 Multi drug resistant Klebsiella pneumoniae Extended spectrum beta lactamases Drug sensitivity test nosocomial infection
肺炎克雷伯菌（Kpn）作为一种常见的病原体类型，广泛分布于人体皮肤中，鼻咽部及呼吸道，肠道以及自然界的水土中[1]。常定植于人体呼吸道与肠道，可通过侵入性操作侵犯伤口和泌尿道而引起感染，当人体免疫力降低时，可以引起较为严重的感染，甚至败血症[2-4]。近年来，由于各类广谱抗菌药物大量应用于临床，同时激素，免疫抑制剂的使用也在不断增多，特别是三代头孢菌素的广泛使用，细菌在药物的选择压力下获得多重耐药性等，产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌株的出现，使其耐药性日趋严峻[5]，对于产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌感染的治疗，目前临床中主要是应用碳青霉烯类抗生素，临床治疗效果显著，对于临床分离的肺炎克雷伯菌，主要是以产AmpC酶，碳青霉烯酶以及超广谱β-内酰胺酶。此次样本研究对象都是收录于我医院分离的多重耐药肺炎克雷伯菌，并对肺炎克雷伯菌进行耐药性分析，旨在对临床合理用药产生指导性意义，并对此种细菌的院内感染加以有效控制。现进行具体阐述。
1.材料与方法
1.1基线资料 参与此次样本分析对象都是收录于来我医院进行治疗患者，收入时间范围控制在2015.1至2016.12，取患者痰，咽拭子，尿，血液等标本分离的286株肺炎克雷伯菌。
1.2仪器与试剂 包括：①TDR-300B微生物鉴定分析仪；②离心机；③MH琼脂平板；④比浊仪；⑤游标卡尺；⑥OXOID药敏纸片；⑦三洋低温冰箱MDFU32V；⑧ESBLs检测试剂盒。
1.3方法
1.3.1药敏试验 依据CLSI（美国临床实验室标准化委员会）2014年版[8]的具体规定。采用纸片法（K-B法）和最低抑菌浓度（mic）试验检测KPN对以下药物的耐药性：a.头孢曲松，b..哌拉西林/他唑巴坦，c.阿米卡星，d.头孢唑林，e.头孢他啶，f.哌拉西林，g.头孢呋辛，h.氨苄西林/舒巴坦，i.头孢吡肟，j.氨苄西林，k.头孢噻肟，l.妥布霉素，m.头孢西丁，n.庆大霉素，o.氨曲南，p.左氧氟沙星，q.亚胺培南，r.洛美沙星，s.环丙沙星，t.复方新诺明。
1.3.2 产超广谱β-内酰胺酶的表型筛选与确证
筛选出药敏试验中的疑产超广谱β-内酰胺酶菌株，包括抑菌环直径头孢他啶小于或等于22 毫米，头孢噻肟小于或等于27 毫米，头孢曲松不大于25 毫米以及氨曲南小于或等于27毫米。使用K-B纸片扩散法对疑产超广谱β-内酰胺酶菌株进行试验确证，使用复合纸片进行试验，包括：a.30微克的头孢他啶，b.30微克头孢噻肟纸片，c.30微克的头孢他啶/10微克的克拉维酸，d.30微克的头孢噻肟/10微克的克拉维酸，如果复合药敏纸片中的抑菌圈直径与其单独药敏纸片抑菌圈直径之差≥5 mm，即可确认为产 ESBLs株。
1.3.3筛查碳青霉烯酶表型的试验 根据2014年版的美国临床实验室标准化委员会标准，使用琼脂扩散法，如果10微克美罗培南或者10微克亚胺培南的抑菌圈直径呈现出小于或等于22毫米的最终状态，则说明表型筛查结果呈现阳性。
1.3.4确诊新德里金属β内酰胺酶表型的试验 采用10微克亚胺培南或者10微克美洛培南，1500微克EDTA两种纸片，用K-B法进行双纸片协同试验，确保两种纸片的距离控制在10至15毫米，如果美洛培南或亚胺培南抑菌圈直径在含EDTA纸片方向处逐渐变大，则说明存在金属酶；复合纸片K-B法采用10微克亚胺培南或者10微克美洛培南/EDTA 的复合纸片，与单药纸片相比，复合纸片的抑菌圈直径增大值大于或等于5毫米，即可判定产金属酶。
1.3.5 改良霍奇试验 制备好0.5的麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922菌悬液，然后将菌悬液进行10倍稀释，并使用棉签将其均匀的涂布于MH平板中，然后在平板中央贴含10微克美洛培南的纸片。使用接种环挑取受试菌自纸片边缘向平板边缘划线接种。35。C孵育过夜，如果矢状生长存在于美洛培南抑菌圈与待测菌株接种线交界处，则说明碳青霉烯酶呈现阳性。
1.3.5 AmpCβ内酰胺酶的表型筛选以及确认 用头孢西丁（FOX）纸片使用琼脂扩散法检测临床分离菌株。当抑菌圈直径小于或等于18毫米时，说明对FOX产生耐药或中介，可能为产生AmpCβ内酰胺酶菌株，提示AmpCβ内酰胺酶表型筛选呈现阳性；AmpCβ内酰胺酶的确认实验：FOX三维确认试验是检测AmpC酶的经典方法，在涂布了0.5麦氏浊度大肠埃希菌标准菌株的平板上贴头孢西丁纸片，向离心方向使用无菌刀片切一裂隙，距纸片边缘5毫米处，将30至40微升的待检菌株β-内酰胺酶初提液（过滤或低温超速离心除去活菌）加入进裂缝当中，并防止酶的初提液溢出裂隙，进行过夜培养，温度在35。C，如果细菌生长于抑菌圈内裂隙旁，则说明产AmpC酶阳性。并采取反复冻融法进行粗酶提取。
1.3.6 菌株的质控包括①大肠埃希菌 ATCC25922以及②肺炎克雷伯菌 ATCC700603。
1.4 统计方法 数据统计使用软件WHONET5.4，在SPSS13.0统计软件上比较产ESBLs与非产ESBLs的耐药率，采用χ2检验。
2 结果
2.1标本分布 286株肺炎克雷伯菌主要分离自痰液228株（79.72%），其次为尿液25株（8.74%），伤口分泌物16株（5.59%），血液7株（2.45%）中。见表1。
2.2科室分布 286株肺炎克雷伯菌主要分布在ICU（56.29%），呼吸内科（27.62%），见表2.
2.3药敏试验比较 分离的286株肺炎克雷伯菌中，产ESBLs的肺炎克雷伯菌162株，检出率为56.64%，其耐药率远远高于非产ESBLs的肺炎克雷伯菌，呈现出P<0.05的最终检验结局，探讨分析有效，见表3所示。
2.4耐药表型分析 本研究286株肺炎克雷伯菌中产ESBLs162株，检出率为56.64%；产AmpC酶39株，检出率为13.64%；产KPC酶28株，检出率为9.79%；产新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）菌2株，检出率为0.70%。见表4。
表1肺炎克雷伯菌株标本类型分布构成比（%）
表3产与非产ESBLs肺炎克雷伯菌株耐药率（%）
3.讨论
作为引起呼吸道感染为主等医院内感染的一种常见致病菌，肺炎克雷伯菌多造成肺、创伤面、泌尿系统以及血液等部位的感染，造成患者出现菌血症、肺炎以及尿路感染等。本研究对分离的286株来自临床病人的肺炎克雷伯菌进行分析，分离自痰和咽拭子的标本占81.47%，且临床分布主要在ICU和呼吸内科，表明该菌主要引起呼吸道感染，与文献报道较一致[9-10]。肺炎克雷伯菌由于受到抗菌药物广泛使用的影响，其耐药菌株呈现出逐年上升的趋势。在本研究中，肺炎克雷伯菌的耐药性主要体现在二代头孢菌素中，与此同时，对第三代头孢菌素以及第四代头孢菌素的耐药性也在持续增加，但是对碳青霉烯类抗生素，例如亚胺培南和美罗培南的耐药率相对较低，但有逐年增高的趋势[11]。本研究用改良霍奇试验检测碳青霉烯酶，其灵敏度和特异性均为100%[12]，检出产KPC酶肺炎克雷伯菌38株，检出率13.29%，应引起临床医生的重视，而造成此番结果的主要原因可能受到三代头孢和亚胺培南/西司他丁钠应用于呼吸内科以及ICU的影响，此次样本结果中共有产NDM-1的肺炎克雷伯菌患者2例，为防止该基因的扩散流行，应当引起临床以及感控部门的重视。
由于第三代头孢菌素在临床中广泛获得使用，其中产超广谱β-内酰胺酶以及高产AmpCβ内酰胺酶的革兰氏阴性杆菌在持续增加，临床中广泛应用碳青霉烯类药物，例如亚胺培南，以此造成产KPC酶的肺炎克雷伯菌以及大肠埃希菌的不断出现，同时产NDM-1的肺炎克雷伯菌也被检出，多重耐药（MDR）和泛耐药（PDR）的革兰氏阴性杆菌在临床的不断检出，并且面临着世界性流行，成为严重的社会问题，引起国内外卫生组织的广泛关注。
对产与非产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性作为本次研究的重要分析内容，在耐药性方面，产ESBLs明显高于非产ESBLs菌株，作为肺炎克雷伯菌的多重耐药机制，产ESBLs的菌株能够对广谱青霉素和第一、二、三代头孢菌素产生分解作用，与此同时甚至能够水解第四代头孢菌素等β-内酰胺类抗生素，在氨基糖苷类以及喹诺酮类抗生素中的耐药性也相对较高，在产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株中对含酶抑制剂的复合抗生素氨苄西林/舒巴坦耐药率高达95.1%，说明氨苄西林/舒巴坦已经不适应于临床对产ESBLs菌株的治疗，哌拉西林/他唑巴坦耐药率相对较低，但也有21%；本研究产AmpC酶检出率为13.64%（39株），其中12株的ESBLs+AmpC酶直接影响了复合抗菌药物（含酶抑制剂）对产ESBLs肺炎克雷伯菌的临床治疗效果，但是产ESBLs菌株对亚胺培南等碳青霉烯类抗生素具有较高的敏感性，临床上仍可直接用于治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的重度感染。
本研究结果显示，产ESBLs肺炎克雷伯菌检出率为56.64%，与国内报道[13]的结果相近。表明该院也普遍存在较为严重的ESBLs菌株流行现状。耐药机制主要包括：a.抗菌药物渗透障碍，b.改变抗菌药物作用靶点，c.产生抗菌药物主动外排机制，d.产生抗生素灭活酶，在菌种间经多种途径可进行耐药基因的传播。抗菌药物在医院，社区滥用是产生耐药的重要原因，为降低产ESBLs菌株的发生率，应加强控制抗菌药物的使用，抑制耐药菌株的流行，建立细菌耐药检测体系，及时开展快速检测产超广谱β-内酰胺酶，金属酶，AmpCβ内酰胺酶以及产碳青霉烯酶，确保为抗生素在临床中的合理使用提供更直接，更有效的证据，以指导临床合理用药，控制多重耐药菌株的产生与传播，防止耐药株产生引起医院感染的发生。
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论文作者:肖启国
论文发表刊物:《航空军医》2018年15期
论文发表时间:2018/11/12
标签：肺炎论文; 克雷论文; 菌株论文; 头孢论文; 纸片论文; 检出论文; 微克论文; 《航空军医》2018年15期论文;